代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产甲硫氨酸

目的:通过构建新型微生物菌株提高微生物发酵法生产甲硫氨酸产量。方法:对甲硫氨酸合成途径关键酶天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)、高丝氨酸脱氢酶(homoserine dehydrogenase,HSD)和高丝氨酸乙酰基转移酶(homoserine acetyltransferase,HAT)进行定向改造及过表达研究,通过实时聚合酶链式反应和高效液相色谱分析代谢流情况,并对竞争途径关键酶高丝氨酸激酶(homoserine kinase,HSK)A20底物结合位点进行定点突变及酶学性质表征,降低苏氨酸途径碳流的消耗。结果:菌株WTg1/PEC-lysC~m-SD-hom~m-SD-metX中lysC、hom和metX相比于原菌AK基因表达量提高6.896、2.378倍及1.659倍。液相色谱分析发现甲硫氨酸产量相比于原菌提高到2.26倍,达到4.14 g/L。同时获得HSK突变体thrB-A20Y、thrB-A20H、thrB-A20L是原菌HSK活性的39%、43%及49%。结论:本实验通过过表达干路关键酶并筛选弱化支路关键酶位点两方面,对谷氨酸棒杆菌天冬氨酸下游代谢进行调控,强化甲硫氨酸碳流运输系统,增强了碳流量的积累,有效提高了甲硫氨酸产量。研究可为构建甲硫氨酸工程菌提供一定理论参考。     

硫模块启动子对提高L-甲硫氨酸的生物合成的影响及发酵培养条件的优化

研究生物合成硫模块对L-甲硫氨酸产量的影响并优化了发酵条件。利用实验室构建的重组菌株,用trc启动子替换基因组上cys K的组成型启动子,在质粒p A*H上插入glp E和nrd H基因;通过构建PG3启动子文库,获得转录强度最高的p32启动子,进一步优化硫模块,最后通过对培养基的优化提高了硫代硫酸盐的供给,从而提高L-甲硫氨酸产量。结果表明:使用构建得到的E. coli W3110 JAHFEBL trc-cys K/p A*H-p32-nrd H-glp E菌株,发酵48 h后L-甲硫氨酸摇瓶水平产量达到1. 3 g/L,较对照组提升了41. 5%;通过对培养基的进一步优化,L-甲硫氨酸产量最终达到2. 3 g/L,相比未优化的发酵水平提高了77. 0%,且该研究为其他含硫氨基酸的生物合成提供了基础。     

大肠杆菌羊毛甾醇合成途径的构建与优化

三萜类化合物是一类具有高附加值的次生代谢产物，羊毛甾醇是其生物合成的重要骨架化合物。为了在大肠杆菌中构建羊毛甾醇合成途径，将酵母来源的鲨烯合酶，荚膜甲基球菌来源的鲨烯环氧酶和氧化鲨烯环化酶分别克隆到载体pET28a(+)和pCDF-DUET-1中，共转入大肠杆菌BL21(DE3)底盘细胞，获得了羊毛甾醇生产菌株BT-tSSE-DXOSC。通过过表达甲基赤藓糖醇磷酸(2-C-methyl-D-erythrito-4-phosphate, MEP)途径关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶和法尼基焦磷酸合酶，增加了前体供应，使羊毛甾醇产量达2.39 mg/L,较优化前提高了2.1倍。通过发酵条件优化，确定了最优pH为7.5,诱导剂IPTG浓度0.5 mmol/L,诱导温度30℃,获得羊毛甾醇产量为5.12 mg/L,较初始条件提高了1.1倍。该研究首次构建了产羊毛甾醇的大肠杆菌工程菌株，为以羊毛甾醇为中间体的三萜类物质生物合成及相关代谢途径的研究搭建了平台。     

微生物发酵法生产L-异亮氨酸的研究进展

L-异亮氨酸作为三大支链氨基酸之一,在食品、牲畜饲料和医药等领域都有广泛应用。微生物发酵法是目前生产L-异亮氨酸最主要的方法,选育优良的生产菌种和优化发酵控制工艺有助于提高L-异亮氨酸的产量。该文对L-异亮氨酸的生物合成途径及代谢调控机制、L-异亮氨酸产生菌的选育现状以及发酵控制工艺进行了系统综述,为后续利用微生物发酵法生产L-异亮氨酸的生产研究提供了参考。     

微生物发酵法制备结冷胶的研究进展

目前,微生物发酵法是结冷胶生产的最佳方法。结冷胶的生物合成途径包括胞内糖活化前体的合成、四糖重复单元的合成、重复单元的移位、聚合及结冷胶分泌到膜外等过程。UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、TDP-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-葡萄糖脱氢酶等是结冷胶合成的关键酶。生产结冷胶的菌种可以通过诱变、基因重组和支路基因敲除等方法获得。最佳的碳源、氮源及C/N、最适的发酵温度及溶氧控制、发酵动力学模型建立及响应面实验设计方法等新技术方法逐渐应用于结冷胶的生产。本文对结冷胶的生物合成代谢途径及重要酶的研究进展进行了综述,并对近年来构建结冷胶产生菌的研究及发酵工业进行了总结,展望了未来构建结冷胶基因工程菌的研究方向。      

α-PGM过表达对灵芝多糖发酵的影响

为了探究灵芝多糖合成途径中磷酸葡萄糖变位酶(α-PGM)的过表达对灵芝多糖发酵产生的影响,利用农杆菌介导法将同源性基因pgm转化灵芝原生质体,筛选灵芝转化子,测定灵芝胞外多糖产量及胞内多糖含量,并研究多糖合成过程中相关酶基因转录水平的相对表达量和酶的活性。结果发现在PGM过表达的重组型灵芝菌株中胞内多糖含量和胞外多糖量最高分别为21.02 mg/100 mg菌体和0.71 g/L,分别比野生型菌株高9.1%和39.2%;灵芝多糖生物合成途径中pgm、pgi基因转录水平表达量较野生型灵芝菌株处于上调状态,且多糖合成代谢中相关酶活性有显著提高。     

维生素B_(12)的生物合成研究

维生素B12广泛应用于医药、食品和畜牧业,主要由微生物发酵得到。脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)和费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)是主要的生产菌种。与之相应,维生素B12存在好氧和厌氧2条生物合成途径,生物合成过程十分复杂,2条合成途径大体相同又各有特点。维生素B12发酵产量的提高有待于菌种的改良和发酵工艺的改进。了解维生素B12生物合成途径和代谢调控机制具有重要意义,可为育种工作提供理论基础。     

毕赤酵母含硫氨基酸生物合成途径

含硫氨基酸是所有生物生长繁殖不可缺少的氨基酸。尽管毕赤酵母在工业发酵中作为重要的表达菌株,但是其含硫氨基酸的生物合成途径尚未明了。作者采用生物信息学及表型分析的方法,阐明了毕赤酵母含硫氨基酸的生物合成途径。结果表明,毕赤酵母可通过O-乙酰同丝氨酸及O-乙酰丝氨酸与无机硫元素合成含硫氨基酸,甲硫氨酸与半胱氨酸也可通过转硫途径实现相互转化。另外毕赤酵母cys3Δ突变菌株在未添加半胱氨酸的合成培养基中对硒代甲硫氨酸表现出显著的抗性。综上所述,未来有望应用毕赤酵母表达硒蛋白用于蛋白质三级结构的分析。     

微生物发酵粗酶液酶解提取黑豆衣红色素新工艺

通过微生物液体发酵技术得到富含纤维素酶的发酵粗酶液,对黑豆衣进行酶解处理,以红色素提取率为指标,确定微生物发酵粗酶液酶解提取最佳工艺条件。从自然界筛选出一株高产纤维素酶菌株w8,确定其最佳产酶发酵条件为:初始p H值为8、1%玉米芯粉、0.5%硫酸铵、0.05%吐温80、温度为30℃、接种量为3%、培养5 d,优化后,其FPA酶活提高至510.19 U/m L,CMC酶活提高至3879.16 U/m L。微生物发酵粗酶液酶解提取黑豆衣红色素最佳条件为:料液比为1:20、酶解温度为50℃、酶解时间120 min、酶用量为50 U/m L、初始p H值为6,浸提4次,合并滤液经真空冷冻干燥获得黑豆衣红色素,提取率达到96.84%。     

氨基酸添加对吸水链霉菌5008发酵过程中有效霉素A合成的影响

氨基糖苷类抗生素的生物合成与氨基酸代谢密切相关,通过在吸水链霉菌5008发酵过程中分别添加9种不同种类氨基酸,研究了氨基酸对有效霉素A生物合成的影响。结果表明,在这9种氨基酸中,有7种氨基酸对有效霉素A产量有提升作用。其中异亮氨酸对产量提升幅度最大,与对照组相比,可以将产量提高约49%(16.76 g/L);同时发现甲硫氨酸对有效霉素A产量有着明显的抑制作用,与对照相比,将产量降低约25%(8.47 g/L);随后对添加氨基酸发酵过程中蛋白积累量,糖利用量以及有效霉素A前体合成相关碳代谢途径的酶活力情况进行检测,结果显示氨基酸能够影响碳代谢途径上关键酶的活性,导致碳代谢流向改变,从而促进有效霉素A前体的积累与有效霉素A的生物合成。     

L-苹果酸生物合成研究进展

L-苹果酸是生物体代谢过程中产生的重要有机酸,具有许多生物功能和生物活性,尤其在能量代谢方面对保护人类健康起着重要的作用。近年来微生物发酵法生产L-苹果酸的优势逐渐显现,随着苹果酸生物合成途径的阐明及其相关基因的克隆,运用基因工程手段调控微生物合成苹果酸已成为可能。本文对苹果酸生物合成代谢途径及重要酶和相关基因的研究进展进行综述,并对近年来苹果酸产生菌的最新研究进行总结,最后展望了未来构建苹果酸基因工程菌的研究方向。     

响应面试验优化桑葚汁复合酶解制备工艺及微滤技术对其品质的影响

以新鲜成熟桑葚果实为原料,桑葚出汁率为指标,通过单因素试验及响应面试验,确定果胶酶和纤维素酶酶解制备桑葚汁的最佳工艺参数,并进一步考察非热力杀菌微滤技术对桑葚汁杀菌、澄清、褐变抑制效果以及理化指标的影响。研究结果表明,适于实际生产的最佳酶解工艺为：果胶酶添加量0.42%、纤维素酶添加量1.84%、酶解时间101.26 min、酶解温度50 ℃、酶解pH 3.5～4.0（桑葚汁自然pH值）。在此条件下,桑葚出汁率为86.37%,与理论值88.10%接近。实验表明微滤技术对桑葚汁不仅有很好的抑菌效果,且对桑葚汁的褐变具有一定的抑制作用。     

马克斯克鲁维酵母对发酵乳中糖代谢的影响

采用高效液相色谱等方法,对乳酸菌单独发酵和向其中添加马克斯克鲁维酵母这两种发酵乳中乳糖代谢主要产物及关键酶活力的变化情况进行对比分析,以确定添加酵母菌对乳糖无氧代谢产生乳酸途径的影响。结果表明：添加酵母菌后乳糖降解速率明显加快（P＜0.05）,贮藏期间马克斯克鲁维酵母可以对积累的半乳糖进行利用;发酵过程中,由于酵母菌的添加使β-半乳糖苷酶及乳酸脱氢酶活力有显著提高（P＜0.05）,糖酵解途径关键限速酶--己糖激酶和丙酮酸激酶活力增加（P＜0.05）;含有酵母菌的发酵乳pH值下降（滴定酸度上升）较乳酸菌单菌发酵快（P＜0.05）,这与添加酵母菌后发酵乳中乳酸含量显著增加（P＜0.05）有关;丙酮酸含量变化不显著（P＞0.05）。该研究揭示了马克斯克鲁维酵母的添加对乳糖酵解具有一定促进作用。     

煎饼发酵面糊中优势菌种的筛选与鉴定

对煎饼发酵面糊中的优势菌种进行富集培养和划线分离,通过菌落形态、颜色、大小等进行初筛,通过生理生化实验、耐受性实验等进行复筛,采用VITEC-2 Compact微生物鉴定仪对其进行初步鉴定。结果表明：从煎饼发酵面糊中分离筛选得到的9 株乳酸菌和11 株酵母菌中,乳酸菌R2、R8和酵母菌Y8发酵性能良好,经鉴定R2为肠膜明串珠菌、R8为戊糖片球菌、Y8为酿酒酵母,可以作为煎饼专用复合发酵剂用菌。     

响应面试验优化酶解辅助喷雾干燥制备怀山药粉工艺

为获取溶解性和冲调性较好的怀山药粉,改善怀山药粉的喷雾干燥效果,以普通怀山药为原料,采用酶解辅助喷雾干燥的方法制备怀山药粉,并用响应面法优化酶解液的喷雾干燥条件。分析热风温度、热风流量、进料流量的变化情况对怀山药出粉率的影响规律,并对怀山药粉的基本成分含量及特性指标进行测定。结果表明：在α-淀粉酶添加量0.2%、温度70 ℃、pH 7.0、酶解时间45 min的条件下,怀山药中可溶性固形物得率达82.79%,当酶解液真空浓缩至质量分数17%时,对其进行喷雾干燥,在热风温度180 ℃、热风流量28.60 m3/h、进料流量1 060 mL/h条件下,怀山药出粉率最高达到37.59%,且制得怀山药粉冲调性好,色泽风味佳,含水率小于5%,适于长期贮存。因此,酶解与喷雾干燥相结合的方法制得怀山药粉品质较优。     

NADPH代谢对氨基酸生物合成影响的研究进展

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）是微生物代谢重要的辅助因子,其在微生物体内的含量是限制氨基酸合成代谢的一个重要因素。本文从NADPH的生物代谢,NADPH与微生物发酵产氨基酸的关系,以及NADPH的代谢调控策略促进氨基酸的生物合成等,进行简要概述,为进一步提高氨基酸产量提供参考。     

虾蟹壳中甲壳素绿色提取技术研究进展

甲壳素的提取需经脱除蛋白质、矿物质、脂质和色素等工艺,酸碱法有成本高、环境危害等缺点,微生物发酵、酶法或基因工程等生物法绿色提取技术亟待研究。本文综述以虾蟹壳为原料,由传统化学法、生物法绿色提取技术的进展;分析微生物发酵、酶法及基因工程等生物法的优缺点,微生物生物转化及酶处理利用发酵产生的有机酸和蛋白酶,经济有效易实现大规模生产,提出微生物发酵法提取甲壳素具有产业化潜力;最后对遗传操作和代谢工程在近几年的进展也进行了讨论。以生物法绿色提取技术生产甲壳素既具备环境友好又具备高效性,具有重要的发展前景。     

酶解法提取罗非鱼血液中血红素的工艺条件优化

为更加科学有效地利用丰富的罗非鱼血液资源,研究酶解法提取罗非鱼血液中血红素的工艺条件,通过单因素试验和正交试验确定了复合酶提取血红素的最佳酶解条件为：温度40 ℃、pH 8.0、底物质量浓度6 g/100 mL、酶添加量8 000 U/g、酶解时间2 h。再经过热处理、酸沉淀和真空冷冻干燥等纯化工艺后得血红素终产品。在此条件下,血红素提取率达到80.9%,产品纯度为28.2%。该工艺简单可行,生产成本低,适合工业化生产,不仅能有效地减少环境污染,还能显著地增加企业产品的附加值。     

原生质体融合提高产谷氨酰胺转氨酶菌株产量

目的：研究并建立产谷氨酰胺转氨酶茂原链霉菌原生质体制备技术,通过原生质体融合技术筛选高产菌株。方法：以溶菌酶处理茂原链霉菌获得原生质体,采用原生质体融合技术,通过96 孔板高通量初筛、试管复筛、摇瓶验证选育高产菌株。结果：茂原链霉菌形成的原生质体再生出的菌落直径比较小,而菌丝生成的菌落直径比较大,两种形态的菌落96 孔板发酵后酶活力有显著性差异。不同的茂原链霉菌株制备原生质体,酶解程度、原生质体纯度、再生率有很大的差异,再生率最高可达1 804.25%,最低仅为12.76%。原生质融合后的高产菌株,选取96 孔板初筛酶活力前3%的菌株进行试管发酵,得到高产菌株比例为32.2%,酶活力比亲本高22.4%,经摇瓶验证产酶比对照提高16.28%。结论：利用基因组重排技术,可以初步对茂原链霉菌进行高产菌株选育。     

米根霉发酵产L-苹果酸的工艺优化

以米根霉（Rhizopus oryzae）突变株CICC40503-JST为菌种,葡萄糖为碳源,对其发酵工艺及葡萄糖代谢途径进行初步研究,从而提高L-苹果酸的产量。采用单因素试验和响应曲面法（Box-Behnken设计）对培养基和发酵条件进行优化,研究发酵罐实验对产酸的影响。结果获得最佳培养基配方为：葡萄糖100 g/L、(NH4)2SO4 4.0 g/L、MgSO4 0.3 g/L、FeSO4•7H2O 0.025 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、ZnSO4 0.1 g/L、CaCO3 80 g/L。发酵条件较好组合为：发酵设备为Sartorius发酵罐、发酵温度32 ℃、通气量0.20 L/（min·L）、转速500 r/min、孢子悬浮液单独培养48 h、发酵进行48 h后添加培养基进行补料发酵,发酵周期为72 h、L-苹果酸的产量为57.71 g/L。结论：米根霉能够较好地利用葡萄糖发酵产L-苹果酸,其产量得到明显提高。