粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)产生物胺交互作用研究

粪肠球菌和屎肠球菌是发酵香肠中常检出的2种主要的产酪胺和苯乙胺微生物。将粪肠球菌和屎肠球菌按照不同比例进行混合接种培养,发现在48h连续培养过程中,当粪肠球菌和屎肠球菌以1∶9比例混和接种培养时,体系pH值、细菌数量和酪胺生成量均显著低于其他各处理组;粪肠球菌有很强的产苯乙胺能力而屎肠球菌产苯乙胺能力较弱,当两者混合接种培养时,各混合体系的产苯乙胺水平相当,屎肠球菌产苯乙胺能力不受影响,而粪肠球菌产苯乙胺能力显著降低。     

产酪胺粪肠球菌和屎肠球菌PCR检测方法的建立

目的：建立快速简便地检测产酪胺粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)的PCR方法。方法：将粪肠球菌和屎肠球菌的酪氨酸脱羧酶基因与GenBank数据库中已公布的细菌的酪氨酸脱羧酶基因进行比对,根据它们的非保守序列,分别设计粪肠球菌和屎肠球菌的特异性引物,建立检测产酪胺粪肠球菌和屎肠球菌的PCR方法。结果：根据非保守序列,分别设计粪肠球菌和屎肠球菌的特异性引物,用27株细菌对这两对引物分别进行反复验证,结果显示,所设计的两对引物都只对其目的菌株产生特异性扩增,对其他菌株没有扩增,方法的检测限可达到1.0×102CFU/mL。结论：本方法具有良好的特异性、稳定性和灵敏性,可用作食品中产酪胺粪肠球菌和屎肠球菌的检测。     

食品及环境样品中肠球菌快速检验方法的 建立及优化

目的建立并优化食品及环境样品中肠球菌的快速检验方法。方法用mEI培养基作为选择性培养基,肠球菌tuf基因为靶基因设计引物,建立食品及环境样品中肠球菌的快速检验方法。通过添加肠球菌和非肠球菌标准菌株,验证方法的检测限、灵敏度及特异性,并使用优化后的方法对北京市丰台区某大型生鲜猪肉集贸市场的地面、墙壁、污水和生鲜猪肉等样品中的肠球菌进行检验。结果所建方法的检测限为1 CFU/100cm2和1 CFU/25 g(mL),且与10种非肠球菌无交叉反应;地面涂抹、墙壁涂抹、污水和生鲜猪肉等样品中均检验出肠球菌,检出率为100%。结论建立了简便、快速、灵敏、特异的肠球菌检验方法;集贸市场内部环境和生鲜猪肉存在肠球菌污染。应加强市售生鲜肉中肠球菌的监测,并采取相应措施降低其污染水平。     

产抗李斯特菌细菌素乳酸菌的筛选与鉴定

从51株肠球菌中筛选出2株具有抑制李斯特菌活性的肠球菌菌株:肠球菌KLDS6.0610和肠球菌KLDS6.0611。在排除有机酸和过氧化氢的干扰后,2株菌的无细胞发酵上清液对指示菌还有强烈的抑制作用。经蛋白酶K处理后,抑菌活性丧失,证明无细胞发酵上清液中含有蛋白性质的抑菌物质,即细菌素。经菌体形态和16SrDNA序列同源性分析鉴定2株肠球菌均为粪肠球菌。     

酵母浸出物对屎肠球菌活菌数的影响

屎肠球菌(Enterococcus faecium)发酵饲料中的活菌数是保证其功能特性的关键因素,为了提高屎肠球菌发酵过程中的活菌总数,本研究以屎肠球菌为试验菌株,选用4种不同特性的酵母浸出物来考察其对屎肠球菌活菌数的影响。通过单因素试验,确定以酵母浸出物为唯一氮源培养屎肠球菌的活菌数,根据酵母浸出物检测指标找出影响屎肠球菌活菌的关键因子。试验结果表明,培养基中主要提供生长因子和微量元素的酵母浸出物对屎肠球菌的活性有明显的影响,其中游离核苷酸的含量是影响屎肠球菌发酵活菌数重要因子,通过外源添加一定量的游离核苷酸,厌氧培养12 h,获得的最终活菌数为176×10~8 CFU/m L,与未添加游离核苷酸相比,活菌数提高了将近40%。结果显示,在培养基中添加一定量的游离核苷酸可提高屎肠球菌在发酵液中活菌数量,为工业化生产高活菌数的饲用屎肠球菌提供参考和借鉴。     

北京市集贸市场生鲜猪肉肠球菌种水平鉴定及耐药特征

目的评价和比较不同肠球菌种水平鉴定方法的准确性,了解北京市集贸市场生鲜猪肉肠球菌的种水平分布及耐药特征。方法利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和VITEK 2 COMPACT两种方法对北京市集贸市场生鲜猪肉肠球菌开展种水平鉴定,两种方法鉴定结果不一致的菌株使用API 20 Strep、16S rRNA和23S rRNA序列分析再次鉴定。比较不同种肠球菌对10种临床常用抗生素的药物敏感性。结果在5种肠球菌种水平鉴定方法中,16S rRNA序列分析和最终结果的符合率最高,为100.0%;VITEK 2 COMPACT符合率最低,仅为4.0%(1/25)。在86株肠球菌中,粪肠球菌占82.6%(71/86),其次为希拉肠球菌占14.0%(12/86)。粪肠球菌对环丙沙星(CIP)的耐药率高于希拉肠球菌,差异有统计学意义(χ~2=10.751,P0.01);对四环素(TET)、高浓度链霉素(HLSR)和高浓度庆大霉素(HLGR)的耐药率均高于希拉肠球菌,但差异无统计学意义(TET:χ~2=3.865,P0.05;HLSR:χ~2=1.608,P0.05;HLGR:χ~2=0.553,P0.05),但对红霉素(ERY)和氯霉素(CHL)的耐药率明显低于希拉肠球菌,差异有统计学意义(ERY:χ~2=20.244,P0.01;CHL:χ~2=14.139,P0.01)。结论 16S rRNA和MALDI-TOF-MS序列分析技术在肠球菌种水平快速鉴定上有较高准确性,不同种属肠球菌呈现不同耐药特征,本研究为有效监测食源性耐药肠球菌的传播和流行提供了科学数据。     

食品来源粪肠球菌的全基因组分析

目的 了解食品来源粪肠球菌的全基因组分子特征, 并与临床分离菌株进行比较基因组学分析。 方法 对收集的食品来源粪肠球菌进行全基因组测序和生物信息学分析, 比较分析3株食品来源粪肠球菌和7株已发表的临床分离粪肠球菌基因组, 对比粪肠球菌基因组中携带的耐药基因、毒力基因和移动元件, 筛选核心基因, 构建系统进化树。结果 3株食品来源粪肠球菌染色体全基因组序列全长分别为2816436、3005875和2818728 bp, 共含有2733、2853和2756个基因, 基因平均鸟嘌呤和胞嘧啶(guanine and cytosine, GC)含量为38.0%。在全基因组核酸水平上, 食品与临床分离的粪肠球菌线性关系良好, 基因组结构高度相似。3株食品来源菌株基因组中含有3~7种耐药基因、8~19种毒力基因和42~67个移动元件, 与临床分离菌株比较, 无显著性差异(P>0.05)。系统进化树分析发现食品来源和临床分离粪肠球菌分布在一个进化分枝, 分子遗传关系距离较近。结论 本研究获得了食品来源粪肠球菌全基因组基本特征的背景材料, 证实了食品来源和临床分离粪肠球菌进化溯源关系相近, 基因组无显著差异(P>0.05), 为后续食品工业界实际应用粪肠球菌的安全性评价奠定了基础。     

肠球菌检验法

1、检验肠球菌的意义肠球菌是人和动物肠道内的常住菌,和大肠菌群一样,因可作为大便的污染指标而受到人们的重视。大便中肠球菌的菌数一般说比大肠菌群稍少,但与大肠菌群相比,肠球菌在外界环境中难以增殖,在自然界的水、土壤里边的分布较少,从这一点上看来,该菌作为大便污染的指标是优越的。另外,将食品冷冻了的时候,大肠菌群死亡较快,而肠球菌大部分可以生存,所以要检查冷冻食品冻结之前的污染情况,检查肠球菌,更有意     

食源性肠球菌荧光定量PCR检测方法的建立与评价

利用基因组序列比对分析等生物信息学方法发掘肠球菌新的属特异性靶点,根据42个候选靶点序列设计50对引物,结合普通PCR初筛和荧光定量PCR复筛,挑选特异性和灵敏度等检测性能最佳的引物,建立相应的荧光定量PCR检测方法,并对该方法应用于食品中肠球菌检测时的效果作出评价。分析结果显示,特异性最强的引物为EF1902,利用该引物建立的荧光定量体系检测肠球菌时均产生特异性扩增信号,而检测非肠球菌菌株时均无特异性扩增信号形成。经优化PCR体系后,该方法的基因组DNA检测灵敏度为13.78拷贝/PCR,纯培养物灵敏度为38.4 cfu/PCR。以肠球菌人工污染牛奶,当初始接菌量为2.63 cfu/mL时,只需增菌6 h即可用该方法检出肠球菌。对52份食品样品进行检测准确率为94.23%,证实了该方法可应用于食源性肠球菌的快速检测。综上所述,作者建立的肠球菌荧光定量PCR方法,特异性强且灵敏度高,可应用于食品中肠球菌的快速检测。     

广式腊肠加工过程中肠球菌变化规律及其分离鉴定

本文对广式腊肠烘烤加工过程中肠球菌的变化规律进行了研究,结果发现:肠球菌在烘烤0-18 h时数量增加,烘烤18,,-54h数量下降,烘烤54h后数量缓慢提高,至烘烤结束时肠球菌数量为2.74logcfu/g,占乳酸菌总数的0.04%,为次要茵群.分离得到的两株肠球菌AD4和AD8经鉴定为屎肠球菌.AD4和AD8能够在50℃生长以及耐受6.5%NaCl,因此能够适应广式腊肠的环境;AD4和AD8均不具有明胶酶活性,但都具有溶血性,表明广式腊肠中的肠球菌具有某些毒力因子.     

屎肠球菌饲用效果及作用机理

屎肠球菌是动物肠道中的一种常见菌,它是一种兼性厌氧的乳酸菌,具有良好的耐酸、耐胆盐和耐热性,能够抑制肠道致病菌增殖,如大肠杆菌和沙门氏菌,医学上屎肠球菌制剂常被用来治疗腹泻。结合我们有关屎肠球菌影响仔猪肠道基因表达的最新研究结果,重点综述了屎肠球菌在饲料中的应用效果及作用机理。     

酱醪源肠球菌的特性研究与安全性评价

肠球菌是发酵食品中常见的乳酸菌,部分肠球菌可作为发酵食品的潜在发酵剂。为了更好地了解从酱醪中分离得到的3株肠球菌的特性,研究了其生长曲线、产酸及抑菌能力等。通过毒力基因检测、氨基酸脱羧酶试验、吲哚试验、溶血试验、耐药性检测来评价其安全性。结果表明:肠球菌接种入酱醪12 h后进入稳定期,具有较好产酸能力,可抑制金黄色葡萄球菌的生长;肠球菌中未检出毒力基因;吲哚试验呈阴性;无溶血作用;对多种抗生素敏感。综上,3株肠球菌发酵特性较好且较为安全。     

干酪中肠球菌种群的遗传差异及万古霉素抗性基因分析

通过种、属引物特异性扩增、重复序列PCR（rep-PCR）技术和万古霉素抗性基因检测对新疆北疆地区干酪样品中球菌的遗传结构差异进行分析。结果表明,15份样品共分离52株肠球菌,包括31株耐久肠球菌(Enterococcus durans)、18株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和3株屎肠球菌(Enterococcus faecium)。依据rep-PCR遗传指纹带谱分析,52株菌可以聚类成7个群,其中4个由E. durans构成。24株肠球菌检测到了万古霉素抗性基因,17株E. durans为VanC2/C3型,4株E. faecalis为VanC1型,2株E. faecium为VanB型,只有1株E. faecium为VanA型。新疆北疆地区干酪中肠球菌种群分布较为广泛,地域之间优势种群和基因型不同,同种肠球菌菌株之间存在广泛的遗传差异。     

屎肠球菌HY07发酵液对冷却猪肉中单增李斯特菌的抑制作用研究

研究了产细菌素屎肠球菌HY07发酵液对冷却猪肉中单核细胞增生李斯特菌的抑制作用。结果表明屎肠球菌HY07发酵液在p H5~10环境条件下或在40~120℃处理15 min以后仍具有一定的抑菌活性。屎肠球菌HY07发酵液可明显抑制冷却肉中单增李斯特菌的生长,显示出屎肠球菌HY07在抑制冷却肉病原菌方面具有一定的应用潜力。     

组成型分泌表达蛋白酶的重组粪肠球菌的构建及应用

为构建组成型分泌表达蛋白酶Ker的重组粪肠球菌,采用豆粕固态发酵实验并评估其应用效果。以重组质粒pSIP401-kerhds为基础框架,向其中引入组成型启动子p10和高效分泌信号肽S6,构建重组载体pSIP401Z-s6-kerhds。采用电击转化方法将该重组载体转入具有益生特性的粪肠球菌EXW27来构建重组粪肠球菌。重组粪肠球菌的胞外蛋白酶的比酶活力为125.37 U/mL。重组蛋白酶Ker的最适反应温度为40℃,在pH 5.0~10.0范围内具有较高的相对酶活力和稳定性,并对胆盐溶液具有较好的耐受性,可适用于动物肠道环境。豆粕固态发酵实验表明,与粪肠球菌EXW27相比,重组粪肠球菌可以更有效降解豆粕中蛋白质。该研究构建了既具有益生特性又具有蛋白酶活性的重组粪肠球菌,为开发新型微生态制剂奠定了基础。     

发酵香肠中分离纯化的三株乳酸菌产酸特性研究

为了研究从发酵香肠中分离纯化的3株乳酸菌粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)和肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的产酸性能,对这3株菌在不同pH、温度、NaCl、NaNO2条件下的生长情况及产酸情况进行了测定。研究结果显示:这3株菌中,肠膜明串珠菌和戊糖片球菌的生长特性较好;粪肠球菌的生长特性虽不如肠膜明串珠菌和戊糖片球菌,但产酸能力最好,戊糖片球菌耐盐性最好、肠膜明串珠菌耐亚硝酸盐的特性最好;在不同温度和pH条件的测试中,肠膜明串珠菌的生长能力最好,粪肠球菌次之。这3株乳酸菌在发酵肉制品中均产生乳酸。总之,这3株菌均具有用于发酵制备乳酸的能力。     

食源性希拉肠球菌R17基因组中前噬菌体的结构特征及其与宿主菌的相互影响

目的了解生鲜猪肉中分离的希拉肠球菌R17基因组中前噬菌体的结构特征及其和宿主菌的相互影响。方法利用PHAST软件预测希拉肠球菌R17基因组中前噬菌体基因的分布及其编码基因特征,分析前噬菌体中含有的毒力基因、耐药基因和环境抗性基因。结果在希拉肠球菌R17染色体上有3个前噬菌体,其中Prophage-1和Prophage-2是不完整的前噬菌体,Prophage-3是完整的前噬菌体。染色体上的噬菌体携带了多个细菌功能编码基因,包括与核苷酸转运和代谢功能相关的基因。希拉肠球菌R17质粒上有一个不完整的、携带了红霉素和杆菌肽耐药基因的前噬菌体Prophage-p,推测前噬菌体介导的基因水平转移使希拉肠球菌R17对红霉素和杆菌肽产生了耐药性。结论希拉肠球菌基因组中的前噬菌体具有多样性。前噬菌体在肠球菌向耐药菌进化过程中发挥了重要作用,应重视监控噬菌体介导的耐药性和致病性在食品中的扩散。     

乳品中肠球菌LAMP快速检测方法的建立及应用

应用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对肠球菌16sRNA中高度保守的序列分析设计特异性引物,建立乳品中肠球菌特异性快速检测方法。结果表明,所设计的引物具有良好特异性,10株肠球菌均能扩增出特异性片段,而14株非肠球菌均未扩增出相应片段,无假阴性或假阳性情况出现。同时,该方法可在14 h内完成检测,且阳性LAMP反应所需目标菌DNA浓度仅为10 fg/μL。应用本方法对164份婴幼儿配方乳粉的检测结果显示,共在37个批次中检出肠球菌,检出率为22.6%,污染量在0.36~110 g-1(最近似值)间。该方法为肠球菌的快速检测提供了一种重要的技术手段。     

自然发酵乳中粪肠球菌和屎肠球菌的4种鉴定方法的比较

采用传统生理生化鉴定方法,16S rRNA基因序列分析技术,16S-23S rRNA间区序列多态性分析技术,变性梯度凝胶电泳技术(DGGE),对分离于自然发酵乳中的9株粪肠球菌和6株屎肠球菌进行鉴定,并对4种鉴定方法进行比较和评价。结果表明,16S-23S rRNA间区序列多态性分析技术和DGGE技术不但可以快速、精确地区分粪肠球菌和屎肠球菌,而且能够将粪肠球菌和屎肠球菌种内的不同基因亚型区分开,而传统生理生化鉴定方法和16S rRNA基因序列分析技术较以上两种方法区分效果略差。     

随机扩增多态性DNA分子标记技术在肠球菌分型中的应用

该研究旨在探索随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）分子标记技术在肠球菌种间快速分型的效果。试验通过筛选模板、单引物、双引物及RAPD反应体系，构建肠球菌种间分型体系，对32株已知肠球菌分型确定分型相似度标准，并通过对46株未知肠球菌进行种间分型以及管家基因rpoA测定验证分型效果。结果显示微波法提取基因组DNA满足实验需要，筛选出7条单引物用于双引物配对组合，最适的双引物反应体系为：2×PCR Taq Mix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL；分型效果最好的双引物组合为Primer1+Primer5，该引物组合可以在80%的相似度下区分肠球菌种间差异，Primer1+Primer3组合在500 bp位置扩增出海氏肠球菌的特征条带，可以作为海氏肠球菌的鉴定指标，用以快速鉴定海氏肠球菌。