数字PCR定量检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌方法的研究

目的建立微滴式数字PCR技术(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的分析方法。方法选择基因hly A为靶序列,设计PCR扩增引物和Taq Man探针,优化反应条件和反应体系,通过细菌分离和dd PCR方法对靶标基因的检测特异性、灵敏度和重复性进行实验,并对定量结果进行分析。结果 ddPCR反应中的最佳探针浓度为5 pmol/μL,特异性好,检出限为(3.6±0.1)copies/20μL,重复性实验良好,标准偏差为0.067%。ddPCR的拷贝数(copy number)与细菌密度(colony forming units,CFU/mL)形成了较好的线性关系。结论本研究建立dd PCR的拷贝数和菌液密度或菌落数的线性关系,可以为单核细胞增生李斯特氏菌的快速定量检测提供参考。     

实时荧光PCR检测熟肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌的结果分析与探讨

目的:对实时荧光PCR检测单核细胞增生李斯特氏菌假阳性结果的原因分析探讨。方法:对假阳性的样本进行传统培养法鉴定分析,将鉴定的菌落进行实时荧光PCR检测,同时对样本基质的影响和培养基本底的影响进行实时荧光PCR检测。结果:样本中的可疑菌落、样本的基质、培养基本底对实时荧光PCR检测结果均无假阳性影响。结论:实时荧光PCR检测熟肉制品中单核细胞增生李斯特氏菌的假阳性主要原因可能是样本中存在死亡目的菌基因造成的干扰。     

食品中单核细胞增生性李斯特氏菌PCR快速检测方法

为建立食品中单核细胞增生性李斯特氏菌 (单增李斯特氏菌 )的快速、敏感、特异的PCR检测方法 ,选取hlyA基因作为靶序列设计一对引物 ,用该引物对 6 3株从国内食品中分离的李斯特氏菌 (进行传统方法验证 )和 2 0株非李斯特氏菌进行PCR扩增 ,并用此方法对人工污染食品进行检测 ,扩增片段表现出极好的单增李斯特氏菌种特异性 ,人工污染的生肉、冷冻虾仁、卷心菜的检出限为 39cfu g ,为食品中单增李斯特氏菌的快速、敏感并且特异的检测方法。     

EMA结合实时荧光PCR方法检测单核细胞增生李斯特氏菌

建立叠氮溴化乙锭（EMA）结合实时荧光PCR（qPCR）方法检测单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）活菌。以李斯特溶血素O（LLO）基因hly设计引物、TaqMan探针,用李斯特属典型菌、沙门氏菌等56株致病菌株验证特异性,不同质量浓度EMA处理进行qPCR检测。尝试脱氧胆酸钠溶液（SD）强化抑制效果,73份不同的人工污染食品、环境样本（卤鸡肉、牛奶、肉馅、垃圾渗滤液）测试实用性。结果表明,引物探针准确检测L. monocytogenes,对其他菌株无特异性扩增。EMA最适质量浓度2.5 μg/mL,经过15 min光激活与死菌DNA共价结合明显抑制了扩增,方法检出限为150 CFU/mL。SD处理L. monocytogenes活菌Ct值增加。与传统培养法比较,EMA-qPCR方法检测100 %准确,操作简单、省时高效,在食品、环境方面应用前景广阔。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测分析

目的:分析食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测结果,以及时发现食品安全隐患,为食品安全监管提供参考依据.方法:严格按照《全国食源性致病菌监测工作手册》中的单核细胞增生李斯特氏菌检验标准,对某市2021年1—12月定期采样的10类常用食品进行单核细胞增生李斯特氏菌检测,分析其阳性检出率.结果:897份10类常用食品中,检出...     

单核细胞增生李斯特氏菌的PCR检测方法

研究比较了裂解法、热煮沸法、试验盒法提取单增李斯特氏菌DNA的效果 ,认为Promega试剂盒法提取的DNA ,得率高、纯度好。同时根据单增李斯特氏菌的毒力相关基因的 5对引物 ,进行了引物的特异性研究 ,结果发现inlA引物、inlB引物、plcA引物特异性好 ,可以用于食品中单增李斯特氏菌的检测     

单核细胞增生性李斯特氏菌荧光定量PCR快速检测方法的建立及初步应用

以单核细胞增生性李斯特氏菌的hly基因为靶基因,用Primer 5.0设计了特异性兼并引物,建立荧光定量PCR检测方法。并用阳性质粒标准品、不同菌株对该方法的特异性、灵敏度进行了验证,且在人工污染鲜切甜瓜上对该方法进行了初步应用。结果表明,建立的检测方法特异性强、灵敏度高,对阳性质粒标准品的灵敏度为7.69×10copies/μL,对人工污染的鲜切甜瓜中单核细胞增生性李斯特氏菌的最低检出限为3.11×10cfu/mL。     

单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测试剂盒的研制

目的:建立一种用于单核细胞增生李斯特菌快速检测的荧光定量PCR试剂盒.方法:根据本课题组前期工作基础,针对单核细胞增生李斯特菌hly基因序列设计TaqMan探针和引物,建立荧光定量PCR检测方法,将反应试剂组装成试剂盒,并对该试剂盒的各项参数进行评价.结果:特异性试验表明,组装的试剂盒对8林单核细胞增生李斯特菌标准菌株的检测均呈阳性反应,对6株其它种的李斯特菌及13株食品(环境)中常见的非李斯特污染菌(如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌)呈阴性反应.该试剂盒的基因组DNA检测灵敏度为3.94fg/反应(约合1.34CFU/反应).该试剂盒批内平均变异系数为2.2%,批间变异系数为1.9%,具有良好的重复性;同时稳定性强,反复冻融处理对其无明显影响;可在-20℃下避光保存1年.结论:该试剂盒具有特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点,可应用于单核细胞增生李斯特菌的快速检测.     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证

目的通过能力验证提升食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力和实验室质量管理水平。方法依据GB 4789.30-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》进行检测,利用BAX system Q7全自动病原微生物检测系统对能力验证中的3个样品进行快速筛查,采用VITEK2COMPACT全自动细菌鉴定系统、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)和溶血素O基因(hlyA)序列比对分析鉴定可疑菌株。结果编号CODE1和CODE3的样品检出单核细胞增生李斯特氏菌,编号CODE2的样品未检出。结论本实验室参加了中国食品药品检定研究院组织的食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测能力验证测试,取得了满意的实验结果。     

用PCR技术快速检测食品中的单核细胞增生性李斯特菌

建立了食品中单核细胞增生性李斯特菌快速、敏感、特异的聚合酶链反应PCR检测方法.选择的引物具有良好的单增李氏菌种的特异性.对人工污染在冷冻食品中单增李氏菌的检测低限是4-8CFU/10g,对其增菌液的检测低限是7.2-11×103/ml,每PCR反应体系的检测低限为86-132CFU.对400份自然污染样品的检测结果显示,PCR方法的检测结果同常规培养法的结果完全相符.     

食品中单核增生性李斯特菌的PCR快速检测研究

为提高食品中单增李斯特菌的检测水平,针对单增李斯特菌中多个稳定的特异性基因hlyA、plcB、prfA、iap,设计并筛选出7对引物组成多重-巢式PCR联合检测体系,并结合高灵敏性的聚丙烯酰胺凝胶电泳,对单增李斯特菌进行快速检测,多重PCR的灵敏度达到1×102CFU ml,巢式PCR的灵敏度达到1×10CFU ml。结果表明该检测体系具有快速可靠、灵敏准确及特异性好的特点,而且有效缩短了检验周期,从传统的7～14d缩短到1～2d。     

食品中单核细胞增生性李斯特氏菌PCR快速检测

通过扩增hly基因建立检测单核细胞增生性李斯特氏菌(Lm)的PCR方法.该方法具有较强的特异性,35株经传统方法鉴定的菌株PCR结果均为阳性,而其他三种同属异种菌,包括英诺克李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌和威尔斯李斯特氏菌及非李斯特氏菌均未扩增出特异性的片段.PCR方法对上Lm纯培养物的最低检测限为7.3CFU/μl,对模拟污染的生猪肉和蔬菜的检测低限为4CFU/g,牛奶为4CFU/ml.应用该方法对285份食品样品检测,17份样品Lm呈阳性,结果与常规的分离培养方法完全一致.该种方法具有敏感、特异、快速及准确的优点,可用于食品中Lm的快速检测.     

单增李斯特氏菌SureTect实时PCR检测方法的 比较研究

目的 评估食品中单增李斯特氏菌SureTect实时PCR检测方法的性能。     

免疫磁珠捕获PCR快速检测单核细胞增生李斯特氏菌

利用免疫磁珠富集单核细胞增生李斯特氏菌,采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增进行快速检测。所制备的免疫磁珠选取在37 ℃条件下均匀振荡1 h为最佳包被条件,1 mg磁珠偶联抗体的最佳量为100 μg/mg,制备的免疫磁珠捕获率为45%。所建立的免疫磁珠捕获-PCR技术在样品细菌浓度达到104 CFU/mL即可被检出,其灵敏度是直接PCR检测限（105 CFU/mL）的10 倍,可为病原菌的富集和快速检测提供新方法。     

应用PCR技术快速测定食品中单核细胞增生李斯特菌毒力

目的：采用PCR 技术准确、快速测定单核细胞增生李斯特菌(单增李斯特氏菌)分离株的毒力基因,鉴别强毒株和弱毒株或无毒株,以有效地限制李斯特氏菌病的传播。方法：以单增李斯特氏菌相关毒力基因(hly、plcB、inlA、inlB、inlC、inlJ、prfA)设计引物,检测重庆市2007 - 2009 年分离的40 株单增李斯特氏菌分离株中的毒力基因携带率,并进行小鼠毒力实验。结果：40 株分离株中有15 株7 种毒力基因检测结果均为阳性,6 株hly 基因阴性,4 株plcB 基因阴性,4 株prfA 基因性,5 株inlA、inlB 基因阴性,11 株inlC 基因阴性,9 株inlJ基因阴性,1 株inlA、inlB、inlC、inlJ 基因均为阴性。4 株分离株的毒力与标准菌株ATCC191161E 相当,小鼠LD50 在1.2 × 108～6.0 × 108CFU/mL 之间,为强毒株。筛选出弱毒株09-132,LD50 为1.7 × 1011CFU/mL。结论：重庆市存在发生李斯特菌食物中毒的潜在危险,内化素基因(inlA、inlB、inlC、inlJ)的缺失可能是导致菌株毒力降低的原因,而prfA 和plcB 基因与菌株毒力的相关性较小。     

单增李斯特菌毒力因子多重荧光PCR法 建立与应用

目的建立同时检测单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)及其3种毒力因子的多重荧光PCR快速检测方法,并应用于日常食品的检测。方法根据单增李斯特菌溶血素基因hly A、内化素基因inl A和表面蛋白act A基因的保守序列,分别设计合成特异性引物和探针,优化多重荧光PCR反应体系。对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估。结果该法特异性强、敏感性高,对单增李斯特菌纯培养物的最低检出限410cfu/m L;重复性好,变异系数均小于2%。对84份食品检测结果与传统国标法相符,共检出单增李斯特菌4份,检出率为4.76%。多重荧光PCR检测方法耗时1 h,比传统方法节约2~5 d。4株单增李斯特菌分离株中2株同时含有inl A、act A、hly A 3种毒力基因,另2株为毒力基因act A缺失株,提示目前流行株并非同一来源。结论本研究建立的多重实时荧光PCR方法能同时对单增李斯特菌及其3种毒力因子进行快速检测,且灵敏度高、特异性好,为食源性疾病的病原学检测提供了快速可靠的方法。     

双重荧光定量PCR检测沙门菌和单核细胞增生李斯特菌方法的建立

目的建立双重荧光定量PCR方法,快速检测沙门菌和单核细胞增生李斯特菌。方法通过设计特异性引物和探针,扩增沙门菌的fimY基因和单核细胞增生李斯特菌的hly基因,采用倍比梯度稀释法检测该体系的灵敏度,以另外7株肠道致病菌评价检测体系的特异性;建立了沙门菌和单核细胞增生李斯特菌感染小鼠的检测模型以验证方法的适用性。结果建立了同时检测沙门菌和单核细胞增生李斯特菌的双重荧光定量PCR方法,从DNA提取到检测完毕仅需2.5 h。检测两种病原菌的灵敏度分别为11和12.8 copies/μl,特异性为100%,符合率为93.3%。结论该法缩短了检测时间,并有良好的灵敏性和特异性,在疾病防控及食品卫生行业中很有应用前景。     

食品中单增李斯特氏菌检测PCR-免疫胶体金 试纸条方法的建立

目的 建立食品中单核增生李斯特氏菌快速检测PCR-免疫胶体金试纸条法。方法 通过设计特异性引物建立单增李斯特氏菌检测PCR方法并使用免疫胶体金技术建立PCR产物快速检测试纸条; 用试验菌株检测PCR-免疫胶体金试纸条方法的检测特异度与敏感度。使用新建方法对市售肉制品和乳制品中单核增生李斯特氏菌进行检测, 验证该方法在食品检测中的可行性。结果 PCR-免疫胶体金法具有良好的特异度, 敏感度比标准琼脂糖凝胶电泳法高100倍。采集乳品样品131份, 阳性样品1份, 检出率1.53%; 肉制品224份, 阳性样品4份, 检测率1.79%。结论 建立的单增李斯特氏菌检测PCR-免疫胶体金试纸条法特异度好, 敏感度高, 适用于食品中单增李斯特氏菌的检测。     

免疫捕捉PCR和直接PCR技术检测单核细胞增生性李斯特菌比较研究

将免疫学技术与分子生物学技术相结合,建立了免疫捕捉PCR(IC-PCR),并与传统的直接PCR(Direct-PCR)进行比较。结果显示:纯菌液中IC-PCR检测灵敏度(104CFU/mL)是Direct-PCR灵敏度(105CFU/mL)的10倍;模拟带菌实验结果表明:IC-PCR最低可检测到5×101个细菌/PCR反应体系(即104CFU/mL),检测限比Direct-PCR(5×103个细菌/PCR反应体系即106CFU/mL)高100倍;特异性实验、干扰实验结果表明IC-PCR可特异检测单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monaytogenes,LM),而和18株其他常见食源性致病菌无交叉反应。IC-PCR具有快速、经济、灵敏、特异等优点,是一种适合食品安全监管部门、食品企业的LM快速检测方法。