交叉引物等温扩增检测霍乱弧菌方法的建立

建立食品中全血清型霍乱弧菌的交叉引物等温扩增检测方法。针对霍乱弧菌设计特异性引物及探针,建立交叉引物等温扩增法,利用免疫金标试纸条对结果进行检测。用57株霍乱弧菌及相近株细菌进行特异性试验;通过定量DNA、纯菌液计数、样品中添菌检测及与环介导等温扩增方法进行灵敏度验证及比较工作。结果表明,建立方法具有较好特异性;DNA检测灵敏度为79.28 fg/test,增菌液检测灵敏度为4.2×102CFU/m L,当每25克样品中有5.6 CFU菌时经增菌步骤后即可检出。建立的交叉引物恒温检测方法可作为食品中霍乱弧菌快速初筛检测方法使用,较环介导等温扩增方法灵敏且易于操作。     

乳粉中阪崎克罗诺杆菌快速检测方法应用比较

对几种应用较为广泛的阪崎克罗诺杆菌分子生物学检测技术进行比较分析,探求适用于食品实验室检验要求的快速准确的阪崎克罗诺杆菌检测方法。通过DNA灵敏度检测及样品添菌实验比较交叉引物等温扩增法、实时荧光PCR法、环介导等温扩增法的检测灵敏度;通过实际样品检测,以常规培养生化鉴定为基准方法,进行灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率及相对准确度等5方面比较分析。DNA灵敏度检测显示实时荧光PCR法最灵敏,检测低限在0.9 fg/test;样品添菌实验,3种方法检测低限均可达100 cfu/100 g;与基准方法比较,3种方法灵敏度均达到100%,假阴性率0%,特异性在98.8%~99.0%之间,假阳性率1.0%~1.2%之间,相对准确度98.8%~99.0%之间,均能满足食品实验室检测要求。3种分子生物学方法检测时间短,同基准方法比较,检测结果大致相符,无漏检情况,有假阳性结果,可用于日常阪崎克罗诺杆菌初筛检测。     

环介导等温扩增技术快速检测食品中的单增李斯特氏菌

采用环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术检测食品中的单增李斯特氏菌,并做特异性、敏感性和适用性试验。试验结果显示以单增李斯特氏菌hly基因保守区设计特异性引物,进行DNA等温扩增是可行的。3株单增李斯特氏菌均扩增出特异性目的片段,而10株非单增李斯特氏菌均未产生目的片段。用环介导等温扩增法在65℃条件下,1h内可检出单增李斯特氏菌,其灵敏度达100cfu/mL,特异性为100%,无假阳性和假阴性出现。用该方法与国标方法分别检测50种样品中的单增李斯特氏菌,结果数据显示两种方法的符合率达100%,表明环介导等温扩增法具有高效、特异性强和敏感性高等特点,可满足大批量样品快速筛选的要求。     

两种基于重组酶介导扩增技术的沙门氏菌检测方法比较

该研究旨在利用重组酶介导扩增技术建立并比较两种食品中沙门氏菌快速检测方法。根据沙门氏菌菌毛蛋白fimY基因设计引物和探针,分别采用荧光法和侧向流试纸条法对扩增产物进行检测,构建重组酶介导等温核酸扩增方法,验证两种方法的特异性、灵敏度及对人工污染样品的检测效果。该研究构建的两种方法均在39 ℃下恒温运行,检测时间30~40 min,方法特异性良好,与大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌等常见的其他食源性致病菌无交叉反应,侧向流试纸条法灵敏度可达到1 pg/μL,荧光法灵敏度为 10 pg/μL,对人工污染样品的检测结果与传统分离培养法检测结果一致。因此该研究建立了两种快速、特异、灵敏的方法用于检测沙门氏菌,为食品中沙门氏菌污染的快速筛查提供一定的参考价值和数据支撑。     

环介导等温扩增方法在食品中沙门菌检测的应用和评价

将环介导等温扩增检测方法应用于食品中沙门菌的检验,并在检测方法特异性、灵敏度等方面与实时荧光PCR和传统检测方法进行比较。方法 针对沙门菌属高度保守的fimY基因设计环介导等温扩增检测引物并优化反应体系,在特异性、灵敏度和实际样品检测等方面与实时荧光PCR及传统检测方法比对。结果 本研究建立的LAMP方法检测沙门菌93株和非目标菌31株,具有良好的特异性。在纯培养、无需增菌情况下,其检测灵敏度为6.4×10²cfu/ml,与实时荧光PCR方法相当。食品基质添加试验中,环介导等温扩增方法检测低限为2cfu/25g样品;对45份实际食品样品检测结果表明,该方法实际样品检出率为11.1%,与实时荧光PCR及传统方法检测结果一致。结论 本研究建立的沙门菌环介导等温扩增检测方法具有良好的特异性,检测灵敏度与实时荧光PCR相当,适用于沙门菌的快速筛选。     

一种快速检测纺织品中沙门氏菌的方法

探讨纺织品中快速检测沙门氏菌的方法。应用了环介导等温扩增技术结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术建立纺织品中沙门氏菌的快速检测方法。沙门氏菌invA基因序列具有致病性菌株属特异性,根据其特点设计出一套沙门氏菌环介导等温引物。环介导等温扩增结果为可疑或阳性时,分离菌株,通过基质辅助技术快速鉴定结果。选择典型参考菌株做特异性试验;沙门氏菌菌液稀释成不同梯度做灵敏度试验。试验结果表明:该方法特异性好,灵敏度较高,检测限可达4.6CFU/mL。认为:该方法可用于快速检测纺织品中沙门氏菌。     

环介导等温扩增法检测食品过敏原大豆成分

目的 建立食品过敏原大豆成分的环介导等温扩增(LAMP)分析方法。方法 根据大豆的内源管家基因Lectin基因设计6条过敏原大豆的特异性引物(两条内引物, 两条外引物和两条环引物), 建立LAMP检测方法。结果 环介导等温扩增法在63 ℃条件下, 40 min内可检出过敏原大豆成分, 该方法能够有效对大豆成分进行快速检测, 具有较强的特异性, 灵敏度可达0.01%(w/w)大豆粉。结论 该方法特异性强, 灵敏度高, 可以快速、准确检测食品中过敏原大豆成分。     

新等温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森氏菌

应用新型等温扩增检测技术——交叉引物等温扩增结合免疫金标试纸条建立检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法。针对小肠结肠耶尔森氏菌16-23S rDNA间区序列设计特异性引物及探针,用54株小肠结肠炎耶尔森氏菌及相近株细菌进行特异性试验;通过纯菌液计数、样品中添菌检测进行灵敏度验证;对677份食品用传统生化国标法进行比较检测试验。建立方法具有较好特异性;增菌液检测灵敏度为10~1cfu/mL,当每25g样品中有10~0cfu菌时经增菌步骤后即可检出,样品检测同传统检测结果比较大致相符,没有漏检,假阳性率较低。建立的新型恒温检测方法可用于食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌初筛检测。     

等温扩增荧光技术快速检测沙门氏菌的研究

本文研究并建立等温扩增荧光技术快速检测沙门氏菌的方法。通过对沙门氏菌的SSAQ基因序列保守区设计引物,采用最佳引物组搭配其他配套试剂建立一种针对沙门氏菌的等温扩增荧光技术快速检测方法;采用直扩法提取DNA,通过等温扩增荧光技术与常规PCR法对不同浓度沙门氏菌进行扩增检测,检测最低检测限,对其灵敏度进行评价。结果表明,所建立的针对沙门氏菌等温扩增荧光检测的方法与常规PCR法相比,等温扩增荧光检测的方法灵敏度更高,且根据干扰实验结果可知该方法对沙门氏菌具有良好的特异性,所建立的针对沙门氏菌的等温扩增荧光技术检测方法具有操作快捷、简便、反应时间较短、良好的特异性和较高的灵敏度的特点,能够用于沙门氏菌的快速检测。     

环介导等温扩增技术快速检测植物蛋白饮料中大豆成分

目的 建立植物蛋白饮料中大豆成分环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplificantion,LAMP）快速检测技术方法。方法 根据大豆Lectin基因保守序列,设计大豆成分环介导等温扩增检测特异性引物和反应体系,对方法特异性、灵敏度和稳定性进行测试,并以实时荧光PCR方法为参比方法,对32种植物蛋白饮料进行检测应用验证。结果 本研究建立的LAMP方法特异性强,稳定性好,最低检出限为0.1%（以质量分数计）;通过参比方法验证,方法特异性和灵敏度为100%,不存在假阳性和假阴性。结论 本研究建立的LAMP技术快速检测植物蛋白饮料大豆成分的方法具有操作简单、快速准确、检测成本低等优点,可为植物蛋白饮料大豆成分掺杂掺假提供一种快速检测方法。     

可视化环介导恒温扩增法检测蔬菜产地环境灌溉水源中沙门氏菌

目的建立可视化环介导恒温扩增体系(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测灌溉水源中沙门氏菌的分析方法。方法以沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因序列设计特异性LAMP检测引物,优化LAMP反应体系和反应条件后,通过特异性实验、灵敏度实验对LAMP检测方法进行测试,并与国标检测方法对比检测人工污染的灌溉水源样品,验证该方法的准确性。结果灵敏度实验结果显示本LAMP检测方法最低检出限为7 CFU/25μL,特异性实验结果显示本LAMP检测方法具有良好的特异性,干扰菌株对本LAMP检测方法无影响。该方法在与国家标准检测方法对比,检测人工污染的灌溉水源样品时具有相同的准确性,检测灵敏度为1×10^2 CFU/mL。结论本研究建立了快速、准确、灵敏的恒温扩增体系,可以应用于灌溉水源中沙门氏菌的快速检测。     

二重环介导等温扩增法快速检测乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌

为建立能够同时检测乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的二重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。针对沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因保守区域设计LAMP引物,优化引物浓度,并通过熔解曲线分析判断扩增靶标来源,建立同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的二重LAMP检测方法。结果表明,当沙门氏菌与金黄色葡萄球菌引物浓度比为3∶1时,建立的二重检测体系扩增效率最佳;该方法特异性强、灵敏度高,对6株目标菌株和9株非目标菌株进行检测,未产生任何假阳性和假阴性结果,对2种食源性致病菌的检测灵敏度均达到102 fg/μL;根据熔解曲线中的退火温度可准确判断目标菌株,实现不同菌株的有效区分。建立的二重LAMP方法可用于乳制品企业大规模乳粉样品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的现场快速筛查。     

乳品中肠球菌LAMP快速检测方法的建立及应用

应用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),针对肠球菌16sRNA中高度保守的序列分析设计特异性引物,建立乳品中肠球菌特异性快速检测方法。结果表明,所设计的引物具有良好特异性,10株肠球菌均能扩增出特异性片段,而14株非肠球菌均未扩增出相应片段,无假阴性或假阳性情况出现。同时,该方法可在14 h内完成检测,且阳性LAMP反应所需目标菌DNA浓度仅为10 fg/μL。应用本方法对164份婴幼儿配方乳粉的检测结果显示,共在37个批次中检出肠球菌,检出率为22.6%,污染量在0.36~110 g-1(最近似值)间。该方法为肠球菌的快速检测提供了一种重要的技术手段。     

食品中沙门氏菌快速检测技术方法对比结果分析

目的比较VITEK2COMPACT、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrixassistedlaser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)、实时荧光PCR法(real-time PCR)、环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)4类方法,分析其对沙门氏菌的快速检测效果。方法挑取12株阳性野生菌株复苏,配以1株标准菌株作为对照,分别用VIKEK2COMPACT、MALDI-TOF-MS、Real-timePCR、LAMP四类方法对其进行检测,并比较4类方法的结果差异。结果 Real-time PCR与LAMP单对通用引物能鉴定到属水平,此外, LAMP测定沙门氏菌时会有假阴性的情况出现;VITEK2生化鉴定能将少数沙门菌株鉴定到种的水平;质谱方法能鉴定到亚种水平,同时会出现鉴定不准确的情况。结论基于沙门氏菌属水平上, 4类方法都能快速准确鉴定沙门氏菌,但在使用快速检测技术时均应考量该方法的优点对实际工作的帮助以及缺点对检验结果的影响,才能提高检测效率。     

3种快速检测柳州螺蛳粉中热损伤沙门氏菌方法的比较分析

目的比较实时荧光PCR法、全自动免疫分析仪法(vitek immune diagnostic assay system, VIDAS)和环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification, LAMP)检测柳州螺蛳粉中热损伤沙门氏菌。方法以预包装柳州螺蛳粉为样品,利用3种热损伤沙门氏菌以人工添加的方式模拟污染样品,污染水平为4CFU/25 g和12 CFU/25 g,通过一步增菌和二步增菌后分别用实时荧光PCR、VIDAS和LAMP检测,并与国家标准法比较。结果当3种快速检测方法对只经过一步增菌的3种热损伤沙门氏菌进行检测时,7组VIDAS检测结果和2组LAMP检测结果出现假阴性;对40份模拟样品检测结果显示, VIDAS无法检测柳州螺蛳粉中低污染水平的热损伤亚利桑那沙门氏菌。结论实时荧光PCR法相对VIDAS法和环介导等温扩增法更适合基质复杂且沙门氏菌污染水平低样品的快速检测。     

环介导等温扩增技术检测不同乳制品常见食源性致病菌

目的 验证环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)试剂和仪器在不同乳制品常见食源性致病菌检测中的应用效果.方法 针对不同乳制品中常见食源性致病菌,运用LAMP建立便捷、快速、高效地检测方法,并以实验室储备菌株及人工污染乳制品样品评价LAMP检测引物试剂...     

肠炎沙门氏菌的LAMP检测方法的建立

建立肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,实现对肠炎沙门氏菌的快速检测.通过针对肠炎沙门氏菌血清型特异性基因lygD设计LAMP内外引物对,优化LAMP扩增反应条件,采用包括肠炎沙门氏菌在内的10种不同菌株进行LAMP引物特异性检测;通过系列梯度稀释肠炎沙门氏菌菌液进行LAMP扩增,计算检出限;并对鲜鸡蛋模拟样本进行LAMP检测.结果表明LAMP法可快速特异地检测出肠炎沙门氏菌;细菌培养液检出限为2.33×101 cfu/mL,鲜鸡蛋模拟样品为2.67×l01cfu/mL.该方法反应灵敏度高,可用于食品中肠炎沙门氏菌的快速检测.     

食品中单核细胞增生李斯特菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立

基于单核细胞增生李斯特菌胞壁质水解酶iap基因,设计两对特异性引物,利用DNA环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以扩增副产物焦磷酸镁实时浊度为判定标准,建立食品中单核细胞增生李斯特菌LAMP快速检测方法。结果显示,本LAMP方法特异性强,经过对29株细菌进行检测,所试单核细胞增生李斯特菌均为LAMP阳性,其他菌株为阴性;本LAMP方法对单核细胞增生李斯特菌纯培养菌的检测灵敏度为8CFU/管,对污染食品中单核细胞增生李斯特菌的检测灵敏度为12CFU/管。本研究建立的LAMP检测方法简便快速、结果判断直观。