重组人干扰素β1b活性测定国家标准品的研制

目的研制重组人干扰素β1b(rhIFNβ1b)生物学活性测定国家标准品。方法按《中国药典》三部(2005版)要求检测rhIFNβ1b标准品原液各项质量指标,以rhIFNβ1b国际标准品为标准进行协作标定,并检测其稳定性。结果rhIFNβ1b国家标准品经检测,外观、无菌试验合格,水分含量为0.8%,分装精度为0.44%。该标准品经3家实验室协作标定24次,几何平均生物学活性为7.18×104IU/支,平均生物学活性的95%可信区间为6.87×104～7.52×104IU/支,单次测定的95%参考值范围为5.76×104～8.68×104IU/支,平均可信限率为4.36%。在温度为-20、4、25和37℃条件下放置12个月,其生物学活性保持稳定。结论该批rhIFNβ1b活性测定国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品使用,生物学活性定为7.2×104IU/支,批号为08/01。     

注射用重组人干扰素β1b规模化分离纯化工艺的建立及其产品质量的检定

目的建立注射用重组人干扰素β1b(recombinant human interferonβ1b,rh IFNβ1b)规模化纯化工艺,并对该工艺制备产品的质量进行检定。方法采用高压均质机对rh IFNβ1b/BL21菌体进行破碎,离心提取包涵体,经有机抽提及酸化沉淀获得粗制rhIFNβ1b;通过Sephacryl S-200和Sephadex G-25层析纯化获得rhIFNβ1b原液,连续生产3批。将原液稀释,加入保护剂,经分装、冻干制备成品。同时对原液及成品的质量进行检定。结果 3批rhIFNβ1b原液蛋白产量可达6~7 g,平均回收率可达15.1%,平均效价为1.1×10~7 IU/mg,HPLC纯度和SDS-PAGE纯度均超过97%,一级序列和二级结构具有良好的一致性。每批rhIFNβ1b原液可制备出20 000~30 000支成品,且各项检定项目均合格。结论建立了rhIFNβ1b规模化分离纯化工艺,制品的产量、纯度及活性均较高,符合rhIFNβ1b工业化生产的要求。     

反相高效液相色谱法测定注射用重组人干扰素β1b中干扰素β1b的含量

目的建立测定注射用重组人干扰素β1b(recombinant human interferonβ1b,rh IFNβ1b)成品中干扰素β1b(interferonβ1b,IFNβ1b)含量的反相高效液相色谱法(reversed phase high performance liquid chromatography,RPHPLC)。方法采用色谱柱ZORBAX 300SB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm),以含95%水、5%乙腈、0.1%三氟乙酸的混合液为流动相A液,以含5%水、95%乙腈、0.1%三氟乙酸的混合液为流动相B液,流速为1.5 ml/min,梯度洗脱10 min(A液从70%~30%),检测波长为214 nm,柱温为35℃,进样量为20μl。对该方法的适用性、线性、精密度、重复性和准确度进行验证。用建立的方法检测3批注射用rh IFNβ1b成品中IFNβ1b的含量。结果建立的方法系统适应性良好;IFNβ1b在20~100μg范围内,与峰面积呈良好的线性关系,r2=0.998;供试品溶液连续6次进样,峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.97%;6份同一批供试品IFNβ1b含量的平均值为302.83μg/ml,RSD为0.99%;40、60和80μg/ml的IFNβ1b加标平均回收率分别为93.1%、94.18%和93.67%,RSD均2%。3批注射用rh IFNβ1b成品中IFNβ1b的含量分别为389.8、364.5和304.6μg/ml。结论建立的RP-HPLC法操作简便,精密度、重复性、准确度好,可用于测定注射用rh IFNβ1b成品中IFNβ1b的含量。     

重组人干扰素α2b栓剂的检定及其临床疗效

目的对重组人干扰素α2b栓剂进行质量检定及临床疗效观察。方法连续试制3批样品,进行各项质控指标的检定及宫颈糜烂的临床疗效观察。结果本品各项检定指标均符合质量要求。治疗组宫颈糜烂的有效率为74·8%,对照组的有效率为60·0%。治疗组和对照组的副反应发生率分别为9·1%和8·3%。结论重组人干扰素α2b栓剂质量稳定,安全性好,疗效确切。     

重组干扰素α1b的抗病毒活性及其临床作用

目的 了解重组干扰素α１ｂ的抗病毒活性及其临床效果。方法 应用小牛肾传代细胞（ＭＤＢＫ）与人羊膜传代细胞（ＷＩＳＨ）测定重组干扰素α１ｂ的抗病毒活性;应用４０μｇ的剂量连续注射３个月观察治疗乙型肝炎的临床效果。结果 在ＭＤＢＫ细胞中测定的活性比在ＷＩＳＨ细胞中高１１．３倍,４０μｇ／ｄ重组干扰素α１ｂ治疗惭型肝炎有效,不良反应轻微。结论 建议以重量（μｇ）表示重组干扰素的剂量。     

聚乙二醇修饰重组人干扰素-α1b条件的优化

目的对聚乙二醇(PEG)衍生物化学修饰重组人干扰素-α1b(rhIFN-α1b)的条件进行优化。方法以3种不同的第2代PEG衍生物对rhIFN-α1b进行修饰,SDS-PAGE分析PEG及修饰产物的表观相对分子质量。对反应pH值、温度、时间、修饰剂用量等修饰条件进行优化,并对修饰产物进行初步分离纯化和活性检测。结果PEG的电泳表观相对分子质量大于其理论值;PEG20000的修饰率(92.1%)高于PEG5000和PEG10000;修饰剂用量和pH值是主要影响因素,最佳pH为9.0,rhIFN-αlb与PEG20000的最佳摩尔比为1∶10,时间和温度影响甚微。单点修饰产物保留了14.4%的体外活性,多点修饰产物无活性。结论选择了合适的PEG衍生物并优化了修饰条件,为进一步深入研究奠定了基础。     

重组人干扰素α1b滴鼻治疗呼吸道病毒感染的疗效

目的 观察重组人干扰素α１ｂ滴鼻治疗呼吸道病毒感染的疗效。方法 将６０例呼吸道病毒感染 的患儿随机分为２组,治疗组在常规治疗基础上,加用重组人干扰素（滴宁）滴鼻治疗;对照组在常规治疗基础上加 用病毒唑（加入葡萄糖液中静点）,两组均观察３天。结果 发热、咳嗽、流涕、睡眠不安、肺部体征等症状消失时 间,观察组均优于对照组。结论 重组人干扰素α１ｂ治疗呼吸道病毒感染疗效显著。     

重组人干扰素a-2b联合利巴韦林治疗丙型肝炎疗效分析

目的探讨重组人干扰素a-2b治疗急、慢性丙型肝炎的疗效。方法给予急、慢性丙型肝炎患者重组人干扰素a-2b5Mu肌肉注射,起初1月每日1次,之后隔日1次,以12个月为1个疗程;给予丙型肝炎肝硬化患者3Mu肌注,隔日1次,疗程12个月。所有患者均联合利巴韦林,每日0.8～1.2g口服。随访2～5年。结果急、慢性丙型肝炎患者在治疗后均取得不错的疗效。急性患者经治疗后ETR为84.6%,稳定SR为76.9%,慢性患者ETR为61.4%,SR为52.3%(P<0.05);在10例丙型肝炎肝硬化患者,ETR为6例,SR为4例;急慢性肝炎患者在治疗最初1个月内应答者其复发率低于1个月后才应答者(P<0.01)。结论重组人干扰素a-2b治疗急慢性丙型肝炎的近、远期疗效较好,重组人干扰素a-2b治疗的安全性较好,代偿期肝硬化患者也可抗病毒治疗。     

微波联合重组ɑ-2b人白细胞干扰素凝胶治疗尖锐湿疣疗效观察

目的探讨微波联合重组ɑ-2b人白细胞干扰素凝胶治疗尖锐湿疣疗效。方法对198例患者分组治疗,治疗组局部外用重组ɑ-2b人白细胞干扰素凝胶,对照组则不使用任何药物。结果治疗组中痊愈86例(86%),复发14例(14%);对照组治愈67例(68.37%),复发31例(31.63%)。两组复发率比较χ2=7.88,P<0.005,有显著差异性。结论微波联合重组ɑ-2b人白细胞干扰素凝胶外用治疗尖锐湿疣,治疗组的复发率明显低于对照组。     

重组人干扰素α2b凝胶联合阿昔洛韦对带状疱疹的疗效

目的观察重组人干扰素α2b凝胶联合阿昔洛韦治疗带状疱疹的疗效。方法将122名带状疱疹病人随机分成2组:联合组62名,将重组人干扰素α2b凝胶直接涂在患处,每日4次,同时口服阿昔洛韦片,0.2g/次,每日5次,疗程10d;单一组60名,只使用重组人干扰素α2b凝胶,用法、疗程同上。观察重组人干扰素α2b凝胶单独使用及联合阿昔洛韦对带状疱疹的疗效。结果联合组和单一组的总有效率分别为88.71%和73.33%,两组间比较,差异有显著意义;联合组平均起效时间(止疱时间、水疱干涸时间、疼痛缓解时间和痊愈时间)均较单一组短,差异有极显著意义;联合组用药后不良反应轻微。结论重组人干扰素α2b凝胶联合阿昔洛韦对带状疱疹有明显的疗效。     

重组人干扰素α2b喷雾剂的研制

目的重组人干扰素α2b(以下简称为rIFNα2b)喷雾剂的试制及临床前实验。方法将重组人干扰素α2b原液进行稀释,调整pH和渗透压,加入适宜稳定剂,除菌过滤后分装于带有定量喷雾装置的棕色玻璃瓶。对配制好的制品分别进行理化和生物学试验、稳定性试验、鼻腔局部刺激性试验、急性毒性试验、长期毒性试验和动物体内抗病毒试验等。结果连续3批制品经检定各项指标均合格,2～8℃保存24个月后生物学活性无明显下降,使用安全,无不良反应。其他各项检定指标均符合现行《中国药典》的要求。结论研制的rIFNα2b喷雾剂安全、稳定,具有一定的抗病毒作用和潜在的临床应用价值。     

重组人干扰素β1a的纯化及其理化性质

目的纯化重组人干扰素β1a(recombinant human interferonβ1a,rhIFNβ1a),并分析其理化性质。方法应用15 L生物反应器悬浮微载体培养表达rhIFNβ1a的重组CHO细胞,细胞培养收获液经超滤浓缩、蓝胶亲和层析、脱盐和CM离子交换层析纯化后,采用水泡性口炎病毒抑制法测定rhIFNβ1a的效价;Lowry法测定蛋白含量;等电聚焦电泳法测定其等电点;SDS-PAGE和高效液相色谱法测定其纯度;Western blot法分析其免疫活性;SDS-PAGE和质谱仪测定其相对分子质量;圆二色谱法分析其二级结构。结果共纯化了3批样品,纯化的rhIFNβ1a平均蛋白浓度为0.284 0 mg/ml,平均比活可达1.06×108IU/mg,纯度达95%以上,蛋白质平均回收率为58.36%,蛋白质相对分子质量为20 445.0,等电点约为6.6,免疫活性良好,二级结构与国家标准品基本一致。结论成功纯化了rhIFNβ1a,并检测了其理化性质,为建立大规模制备rhIFNβ1a的生产工艺和制造检定规程,实现产业化奠定了基础。     

重组人干扰素α2b阴道泡腾片抗豚鼠单纯疱疹病毒性阴道炎的疗效

目的观察重组人干扰素α2b阴道泡腾片对单纯疱疹病毒性阴道炎动物模型的疗效。方法采用单纯疱疹病毒感染建立豚鼠实验性阴道炎模型,并分别用重组人干扰素α2b阴道泡腾片600、3 000和15 000 IU/只进行治疗。以阿昔洛韦(无环鸟苷)和干扰素α2b栓剂15 000 IU/只作为对照。对治疗前后豚鼠阴道外观及组织切片进行评分。结果应用重组人干扰素α2b阴道泡腾片对豚鼠实验性单纯疱疹病毒性阴道炎进行治疗后,豚鼠阴道外观病变与组织切片病变评分均显著降低,其中15 000 IU/只效果最好。同样剂量的α2b泡腾片药效优于栓剂。结论重组人干扰素α2b阴道泡腾片对实验性单纯疱疹病毒性阴道炎有明显的疗效。     

重组人干扰素α2b内毒素检查法的研究

目的研究鲎试剂法与家兔法检测重组人干扰素α2b内毒素结果的相关性,并参照家兔热原试验的阈值量,来确定本制品质量标准中内毒素的限量标准。方法分别用不同浓度的内毒素溶液和含不同浓度内毒素的供试品溶液进行家兔热原质试验,确定供试品内毒素限值,并在此限值下进行内毒素检测,方法均参照2000年版《中国药典》和2000年版《中国生物制品规程》进行。结果在含不同浓度内毒素溶液的家兔热原质试验中,致热阈值小于5.0EUml。在含不同浓度内毒素供试品溶液的家兔热原质试验中,致热阈值小于1.25EUml。以此确定本品内毒素限值,检测该制品的内毒素含量,结果均符合规定。结论本品在内毒素含量小于3.5EU500万单位dose的范围内,根据具体的对照实验及制品的用途来规定细菌内毒素限值,可用鲎试剂法代替家兔法检测注射用重组人干扰素α2b冻干制剂的热原质。     

重组人干扰素-β(rhIFN-β)中试工艺研究

目的　建立适合大规模生产重组人干扰素 β(rhIFN β)的分离纯化工艺。 方法　采用超声破菌、离心分离包涵体、仲丁醇萃取、Sephacryl 10 0、HIC层析等分离纯化步骤。结果　纯化的rhIFN β纯度达 98%以上 ,比活性为 2 .0× 10 7IU/mg,各项质量指标均符合质控标准。结论　此纯化工艺简便 ,可重复性好 ,适于大规模生产。     

重组人干扰素α1b含片对大鼠免疫功能的调节作用

目的探讨重组人干扰素α1b(recombinant human interferonα1b,rhIFNα1b)含片对大鼠免疫功能的调节作用。方法将大鼠按体重随机分为模型组(空白基质片干粉)、阳性对照组(匹多莫德)及rhIFNα1b含片低(1 000 IU/片)、中(10 000 IU/片)、高(50 000 IU/片)剂量组,每组14只,给予相应药物,每日1次,连续给药3周,于首次给药第7、9天经腹腔注射环磷酰胺,60 mg/kg,同时设正常对照组(10只),末次给药8 h后开始禁食,24 h后称量大鼠体重,计算胸腺及脾脏系数,检测血清及脾脏细胞中白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、IL-4、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IFNα水平,同时检测血清、唾液中IgG及IgA水平。结果与正常对照组比较,模型组大鼠体重及胸腺系数均明显降低(P 0. 05),血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFNα、IgG及IgA水平均明显下降(P 0. 01),脾脏中IL-4、TNF-α及IFNα水平均明显下降(P 0. 01),唾液中IgG及IgA水平均明显下降(P 0.01)。与模型组比较,各剂量rhIFNα1b含片组大鼠的体重、胸腺及脾脏系数差异均无统计学意义(P 0. 05);血清及脾脏中IL-2、IL-4、TNF-α及IFNα水平有不同程度的升高;血液及唾液中IgA水平明显升高(P 0. 05)。结论中、高剂量的rhIFNα1b含片对大鼠免疫功能具有明显的改善作用。     

重组人干扰素a1b联合5%氟尿嘧啶软膏治疗尖锐湿疣

目的观察重组人干扰素a1b联合5%氟尿嘧啶乳膏治疗尖锐湿疣的效果。方法将120例尖锐湿疣病例分为治疗组60例和对照组60例,治疗组采用5%氟尿嘧啶联合干扰素治疗,对照组单纯采用5%氟尿嘧啶治疗。结果以随访3个月为限,治疗组治愈率为96.7%,高于对照组的80.0%,P<0.01。结论重组人干扰素a1b联合5%氟尿嘧啶乳膏治疗尖锐湿疣能明显提高治愈率。     

聚乙二醇化重组人干扰素α2b的质量检测

目的　建立聚乙二醇化重组人干扰素α2b(PEG rhIFNα2b)的质量检测方法。方法　采用Wish细胞 VSV病毒系统 ,以CPE法测定干扰素的生物学活性 ,基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法测定相对分子质量 ,反向高效液相法 (RP HPLC)测定纯度 ,溴化氰裂解 SDS PAGE法测定肽图 ,等电聚焦电泳法测定等电点 ,紫外分光光度法测定紫外吸收光谱。结果　聚乙二醇化重组人干扰素α2b的比活为 6 . 0× 10 6～ 10 . 0× 10 6IU/mg蛋白 ,相对分子质量约为 6 2 6 0 0 ,等电点在 5 . 2 0～ 6. 5 5之间 ,紫外最大吸收峰约在 2 78nm波长处。结论　所建立的检测方法可控制聚乙二醇化重组人干扰素α2b质量。     

聚乙二醇-重组人干扰素α2b结合物冻干保护剂的筛选

目的筛选聚乙二醇-重组人干扰素α2b(PEG-rhIFNα2b)结合物的冻干保护剂。方法采用两步筛选法,以氨基酸、甘露醇和糖类作为冻干保护剂,与PEG-rhIFNα2b在适宜条件下制备成冻干制剂,分别于40、25和4℃放置不同时间取样,检测其理化性质和生物学稳定性,筛选最佳保护剂配比。结果通过6～12个月的试验,证实该冻干制剂外观、pH无明显改变,但再溶解速度略慢于以人血白蛋白作保护剂的冻干制剂;采用15mmol/L精氨酸+10mmol/L谷氨酸+4%甘露醇+1%蔗糖/海藻糖的冻干保护剂配方,在4℃和25℃放置12个月后,抗病毒活性仍较好,相当于人血白蛋白的冻干保护效果。结论已筛选出不含人血白蛋白的PEG-rhIFNα2b结合物的冻干保护剂。