阿霉素耐药的乳腺癌MCF-7/Adm细胞系的建立及其耐药特性

建立肿瘤耐药细胞系是研究肿瘤细胞的重要手段之一,也是探讨肿瘤多药耐药机制及其逆转的基础。采用大剂量间歇诱导法诱导MCF-7细胞,建立MCF-7/Adm耐药模型;MTT法检测耐药倍数;流式细胞术检测MCF-7细胞和MCF-7/Adm细胞中阿霉素的积累量;real-time PCR检测MCF-7/Adm细胞中ABCG2、ABCC1、ABCB1基因的表达。结果显示,阿霉素抑制MCF-7和MCF-7/Adm细胞存活的IC50值分别为0.535μg/mL和173.275μg/mL,耐药倍数为324;MCF-7细胞中的阿霉素积累量较MCF-7/Adm明显高;MCF-7/Adm细胞中mRNA水平ABCB1基因表达明显上调,ABCG2和ABCC1基因表达下调。成功获得对阿霉素耐药的人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adm,为进一步研究乳腺癌多药耐药机制及其逆转提供有利工具,并且对乳腺癌化疗药物的筛选具有一定的意义。     

刺囊酸及其衍生物的体外化疗增敏作用及机制研究

目的探讨刺囊酸及其衍生物的体外化疗增敏作用及其机制。方法体外培养人乳腺癌细胞MCF-7和人肝癌细胞HepG-2的敏感株和阿霉素耐药株,依次在阿霉素和受试化合物的作用下,以MTT法测定其IC₅₀,计算耐药倍数; 随后,对耐药株加入不同浓度组合的阿霉素和受试化合物进行共培养,以MTT法测定各组细胞活力,计算刺囊酸及其衍生物的MDR逆转倍数。结果刺囊酸及其衍生物在低浓度下无明显细胞毒活性,但却能增强耐药细胞对化疗药阿霉素的敏感性,逆转倍数最高可达15倍以上,并且几种刺囊酸衍生物的作用具有剂量依赖性; ELISA试验结果显示,刺囊酸及其衍生物抑制耐药株的P-gp表达,减少化疗药物从细胞中泵出,起到增敏作用。结论刺囊酸及其衍生物具有化疗增敏作用,其机制来源于对P-gp的抑制。     

ER阳性乳腺癌中西达本胺逆转内分泌耐药

内分泌治疗是雌激素受体阳性乳腺癌的主要治疗手段,但耐药的发生限制了其应用,本研究目的为验证组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺是否可用于逆转雌激素受体阳性乳腺癌内分泌耐药,通过MTS细胞增殖检测实验发现,4-羟他莫西芬与西达本胺单药均对雌激素受体阳性乳腺癌细胞MCF-7的增殖具有一定抑制作用,且在两药联合时表现为药效叠加.表皮生长因子可诱导MCF-7对4-羟他莫西芬的耐药,而西达本胺可逆转这种耐药.通过Western blot实验发现,西达本胺可抑制表皮生长因子引起的MEK、ERK和AKT等激酶的磷酸化,并抑制雌激素受体的磷酸化.原位移植瘤动物模型的体内药效实验也显示,药物联用组比单药组有更强的抑瘤作用.研究表明,西达本胺在雌激素受体阳性乳腺癌细胞中具有逆转内分泌耐药的作用,作用机制可能与其对表皮生长因子下游通路及雌激素受体活化通路的抑制有关.     

普朗尼克F127/P123-雷公藤甲素载药胶束的逆转肿瘤耐药作用

为了考察雷公藤甲素靶向制剂的逆转肿瘤耐药性,薄膜水化法制备了装载雷公藤甲素的双普郎尼克载药胶束(F127/P123-TPL),选择内在性和获得性耐药的A-549和MCF-7/ADR细胞作为耐药细胞模型,MTT试验检测制备的载药胶束,空胶束以及裸药TPL对两种耐药细胞的细胞毒作用,多功能酶标仪以及微弱发光测量仪测定不同浓度的空胶束对荧光探针R-123在A-549耐药细胞内的蓄积量,线粒体膜电势,以及ATP含量的影响。结果表明:TPL和F127/P123-TPL对两种耐药肿瘤细胞都有抑制和杀灭作用,且F127/P123-TPL载药胶束增强了TPL的作用。而作为TPL载体的F127/P123,在使用剂量范围内对耐药肿瘤细胞的存活率无影响,但能够使R-123在A-549耐药细胞内的蓄积量增加,并且使细胞的线粒体膜电势和ATP的含量降低。TPL具有逆转肿瘤耐药作用,而F127/P123-TPL能增强其作用。实验结果将为TPL的新制剂研究打下基础。     

人肺癌细胞5-氟脲嘧啶耐药株的建立及其生物学特性分析

建立人肺癌5-氟脲嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)的耐药细胞株H460/5-FU,并对其生物学特性进行分析。实验采用浓度梯度递增法诱导肺癌细胞耐药,建立肺癌细胞耐药模型。采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT),计算H460和H460/5-FU的半数抑制浓度(IC50)及耐药系数(RI);通过流式细胞仪分析H460和H460/5-FU的细胞周期分布;光镜观察细胞形态变化;通过流式细胞仪进行SP(side population)细胞检测,比较SP细胞所占比例;做细胞生长曲线和集落形成实验观察细胞生长及倍增情况。结果表明5-FU对H460和H460/5-FU的IC50分别为28.7μg/mL和90.44μg/mL,RI为3.15;H460/5-FU细胞倍增时间缓慢,DNA复制时间延长,且含有更多的SP细胞。     

p38MAPK抑制剂增强阿霉素抑制乳腺癌细胞增殖的体外研究

以乳腺癌细胞株MCF-7为研究对象,经阿霉素及阿霉素联合p38MAPK抑制剂(SB20580)作用细胞,通过MTT法测定细胞存活率、光学显微镜观察细胞形态变化。实验数据显示相同药物浓度下,SB20580可以明显降低MCF-7细胞存活率。结果表明p38MAPK抑制剂可以促进阿霉素抑制细胞增殖的效果。     

液体发酵桦褐孔菌三萜类成分抑制肿瘤细胞活性研究

探究桦褐孔菌液体深层发酵所得菌丝体中三萜类成分的抗肿瘤活性。采用高效液相色谱法鉴定桦褐孔菌液体深层发酵产物中含有5种已知具有肿瘤细胞生长抑制活性的三萜类成分,采用MTT比色法分析三萜类成分对卵巢癌细胞ES2、SKOV3和肺癌细胞A549和PC9的生长活性的影响,通过细胞周期和细胞凋亡实验研究三萜类成分对卵巢癌细胞和肺癌细胞增殖的影响。结果表明:经过三萜类成分处理3d和6d的肿瘤细胞生长活性均被明显抑制,对卵巢癌细胞ES2抑制的IC50分别为21.1μg/mL和17.6μg/mL,对SKOV3抑制的IC50值分别为33.8μg/mL和10.9μg/mL;对肺癌细胞PC9抑制的IC50分别为21.4μg/mL和19.7μg/mL、对A549抑制的IC50值分别为28.5μg/mL和23.5μg/mL。细胞周期实验结果表明三萜类成分对ES2、A549、PC9、SKOV3的阻滞可能发生在G0/G1期,在16.0μg/mL的三萜类成分处理下,PC9、A549、ES2、SKOV3处在G1期的细胞比例与对照组中各细胞G1期的占比分别提高32.3%、45.7%、10.9%、6.2%,S期的细胞数降低19.1%、57.3%、23.1%、17.5%。细胞凋亡结果表明,经过药物处理2d后,三萜类成分能够有效的诱导卵巢癌细胞ES2、SKOV3和肺癌细胞A549和PC9的细胞凋亡,进一步验证桦褐孔菌三萜类成分具有肿瘤抑制活性。     

功能化表阿霉素脂质体的主药含量测定及体外释放考察

建立了功能化表阿霉素脂质体的主药含量及体外释放率的测定方法.采用薄膜分散法和硫酸铵梯度法制备各种类型的表阿霉素脂质体,建立了一种梯度洗脱方法,利用高效液相色谱仪测定脂质体中表阿霉素与塞来昔布的质量浓度及其体外释放度.结果显示脂质体中表阿霉素质量浓度在0.5~50.0 μg/mL,塞来昔布质量浓度在0.3~30.0μg/mL范围内线性关系良好.各种脂质体中表阿霉素的质量浓度分别为(101.2±2.0)、(103.1±1.8)、(98.7±1.3)g/mL,塞来昔布的质量浓度分别为(65.5±0.5)、(63.5±1.1)μg/mL.72h内表阿霉素的释放度均低于5%,36h塞来昔布的累积释放度均低于20%.所建立的HPLC方法准确可靠,简单快速,重复性好,各脂质体中表阿霉素与塞来昔布的体外释放缓慢,稳定性良好.     

6种化合物对肝癌细胞活性影响的比较

肝癌在全球,特别是在中国,有着很高的发病率。在中国,每10万人中约有将近40人罹患肝癌。在临床治疗肝癌等癌症的方法上,最常用最普遍的手段是手术治疗和化学治疗等方法。不同的化合物对不同的癌症细胞的细胞活力影响有很大的不同。为了比较不同的化合物对体外培养的肝癌细胞的细胞活力的影响,做了如下实验。利用MTT检测细胞活力的方法,分别检测了不同浓度的阿霉素,顺铂,依托泊苷,5-FU,甲硫哒嗪和白藜芦醇等6种常用化合物对肝癌细胞的细胞活力影响。实验结果表明,阿霉素,依托泊苷,甲硫哒嗪和白藜芦醇的IC50值分别为0.25μg/mL,20μg/mL,500μM,20μM。在一定的浓度范围内,随着阿霉素浓度的升高,肝癌细胞的细胞活力显著下降,正常肝细胞的活力也有一定的下降;随着依托泊苷的浓度的增加,肝癌细胞和正常肝细胞的细胞活力都显著下降;随着甲硫哒嗪的浓度的增加,肝癌细胞活力显著下降,正常肝细胞的活力几乎没有影响。     

阿科特素体外处理乳腺癌细胞的基因表达通路分析

近年来有研究表明黑升麻提取物阿科特素具有抗肿瘤活性。但其分子机制仍然不够清楚。研究用基因集富集分析的方法分析了20μg,／mL和40μg／mL两种不同质量浓度的阿科特素处理乳腺癌细胞MDA—MB--4536h或24h后的基因表达谱,获取处理后的乳腺癌细胞中的基因集富集情况．结果表明：处理6h的乳腺癌细胞中没有获得有统计学意义的基因集,而在处理24h的乳腺癌细胞中与细胞分裂、细胞周期等相关的生物学通路则表达下调,40Ixg／mL阿科特素处理还可以使得乳腺癌细胞中大分子降解相关通路表达上调．由于阿科特素可以促进细胞凋亡并抑制细胞周期,为其今后用于乳腺癌的预防和治疗的可能性提供了良好的理论依据．     

A portable single-cell analysis system integrating hydrodynamic trapping with broadband impedance spectroscopy

In this paper, we present a portable single-cell analysis system with the hydrodynamic cell trapping and the broadband electrical impedance spectroscopy(EIS). Using the least flow resistance path principle, the hydrodynamic cell trapping in serpentine arrays can be carried out in a deterministic and automatic manner without the assistance of any external fields. The experimental results show that a cell trap rate of higher than 95% can be easily achieved in our cell trapping microdevices. Using the maximum length sequences(MLS) technique, our home-made EIS is capable of measuring the impedance spectrum ranging from 1.953 kHz to 1 MHz in approximately 0.5 ms. Finally, on the basis of the developed single-cell analysis system, we precisely monitor the trapping process of human breast tumor cells(MCF-7 cells) according to the changes of electrical impedance. The MCF-7 cells with different trapping conditions or sizes can also be clearly distinguished through the impedance signals. Our portable single-cell analysis system may provide a promising tool to monitor single cells for long periods of time or to discriminate cell types.     

家蝇幼虫凝集素的分离纯化及其抑制MCF-7细胞活性的研究

家蝇幼虫血淋巴粗提液经过亲和层析,分离出3种与D-半乳糖特异性结合的蛋白,经高效液相色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离出分子质量为38ku的家蝇幼虫凝集素（MLL-2）,该组分具有明显的凝血活性．圆二色谱结果表明,MLL-2的二级结构主要是以／3折叠（80．3％）和无规卷曲（19．5％）的构象存在．MTT实验结果显示,MLL-2对人乳腺癌（MCF-7）细胞的生长具有明显的抑制作用,其抑制效果具有时间和浓度依赖性．形态学观察表明,MLL-2处理过的MCF-7细胞出现凋亡小体、染色质浓缩凋亡现象．经流式细胞仪分析MCF-7细胞被阻遏在G2／M期,并且凋亡率随作用时间的延长而增加．MLL-2通过诱导MCF-7细胞发生凋亡,从而起到抑制肿瘤细胞生长的作用．     

在乳腺癌细胞MCF-7中紫杉醇诱导硫氧还蛋白结合蛋白-2的表达

探讨紫杉醇在人乳腺癌细胞株MCF-7中诱导硫氧还蛋白结合蛋白-2表达及与其诱导的相关途径．用不同浓度的紫杉醇刺激MCF-7细胞,MCF-7细胞生长受抑制．通过荧光实时定量PCR检测,发现紫杉醇刺激MCF-7细胞后硫氧还蛋白结合蛋白-2mRNA的表达升高．经荧光素酶活性检测,得出紫杉醇诱导硫氧还蛋白结合蛋白-2基因启动子活性的增高．p38丝裂原激活蛋白激酶（p38MAPK）抑制剂,SB203580抑制了紫杉醇诱导的硫氧还蛋白结合蛋白-2mRNA的表达．因此,紫杉醇抑制MCF-7细胞生长,并通过p38丝裂原激活蛋白激酶途径诱导硫氧还蛋白结合蛋白-2表达．     

A New Type of Nanogel Carrier based on Mixed Pluronic Loaded with Low-Dose Antitumor Drugs

To design a new type of antitumor nanodrug carrier with good biocompatibility, a drug delivery system with a 2.19% drug-loading rate, measured by high-performance liquid chromatography(HPLC), was prepared by membrane hydration using a mixed polymer: Pluronic~? F-127, which binds folic acid(FA), Pluronic~? F-68 and triptolide(TPL)(FA-F-127/F-68-TPL). As a control, another drug delivery system based on a single polymer(FA-F-127-TPL) with a 1.90% drug-loading rate was prepared by substituting F-68 with F-127. The average particle sizes of FA-F-127/F-68-TPL and FA-F-127-TPL measured by a particle size analyzer were 30.7 nm and 31.6 nm, respectively. Their morphology was observed by atomic force microscopy(AFM). The results showed that FA-F-127-TPL self-assembled into nanomicelles, whereas FA-F-127/F-68-TPL self-assembled into nanogels. An MTT assay showed that a very low concentration of FA-F-127/F-68-TPL or FA-F-127-TPL could significantly inhibit the proliferation of multidrug-resistant(MDR) breast cancer cells(MCF-7/ADR cells) and induce cell death. The effects were significantly different from those of free TPL(P 0.01). Using the fluorescent probe Nile red(Nr) as the drug model, FA-F-127/F-68-Nr nanogels and FAF-127-Nr nanomicelles were prepared and then incubated with human hepatocarcinoma(HepG2) and MCF-7/ADR cells, and the fluorescence intensity in the cells was measured by a multifunctional microplate reader. The results indicated that both FA-F-127/F-68-Nr and FA-F-127-Nr had sustained release in the cells, but HepG2 and MCF-7/ADR cells exhibited significantly higher endocytosis of FA-F-127/F-68-Nr than that of FA-F-127-Nr(P 0.01). A nude mice transplanted tumor model was prepared to monitor FA-F-127/F-68-Nr in the tumor tissue and organs by whole-body fluorescent imaging. The results showed that FA-F-127/F-68-Nr targeted tumor tissues. The prepared nanogels had small particle size, were easy to swallow, exhibited slow release property,targeted tumor cells, and could improve the antitumor effects of TPL; hence, they are ideal carriers for low-dose antineoplastic drugs.     

乙酰肝素酶-1/多配体蛋白聚糖-1轴对肝癌细胞侵袭能力的影响

乙酰肝素酶-1(Heparanase-1,HPA-1)/多配体蛋白聚糖-1(Syndecan-1,SDC-1)轴调控多种肿瘤细胞的转移。肿瘤细胞侵袭能力的改变是导致肿瘤脱离原发组织,进而向远隔器官转移的关键启动因素。为了检测Heparanase-1/Syndecan-1轴在肝癌细胞中是否存在及其对肝癌细胞侵袭能力的影响,我们利用SDC-1小干扰RNA及重组HPA-1(rHPA-1)分别处理肝癌细胞Hepa1-6,再通过反转录PCR(RT-PCR)、Western-blot及免疫细胞化学检测SDC-1表达,应用体外基质胶侵袭实验观察细胞侵袭能力的改变。结果显示:SDC-1小干扰RNA明显抑制SDC-1表达;r HPA-1处理显著下调SDC-1蛋白的分子量,但没有改变SDC-1的mRNA表达;SDC-1表达下调及rHPA-1处理均促进Hepa1-6细胞的侵袭。因此得出结论:HPA-1通过作用于SDC-1蛋白,即形成Heparanase-1/Syndecan-1轴启动肝癌细胞转移。     

E2弱化双酚A雌激素活性机制

前期研究发现天然雌激素E2可以弱化一种常见雌激素类污染物双酚A的活性,为探讨这一现象的机制,利用人体乳腺癌细胞MCF7,从细胞周期、雌激素受体途径、MAPKs信号途径进行实验．结果表明:E2可诱导DNA合成期细胞显著增高,抑制受体蛋白表达,提高ERK蛋白的表达,进而激活多种转录因子;双酚A显著抑制受体蛋白表达,对MAPKs信号通路基本没有影响,可同时提高DNA分裂期与间歇期细胞比例;两者联合后活化了受体途径和ERK途径,促进Cfos的转录表达,激活cyclin D1蛋白,增加S期及G2期细胞比例．E2弱化双酚A的可能机制为Cmyc蛋白表达下降．     

过表达Akt1细胞株的构建及鉴定

Akt1是细胞信号传导通路中的关键信号分子,具有促进细胞增殖、生长、迁移、侵袭,以及抑制细胞凋亡,抵抗化疗和放疗等重要作用。文章通过构建pLJM1-Akt1重组质粒,利用慢病毒侵染的方法将重组质粒转染至K562、Bel-7404细胞,用嘌呤霉素筛选得到Akt1稳定过表达的Bel-7404/Akt1、K562/Akt1细胞株,通过Western bloting分析细胞株中Akt1的表达情况。结果显示：Bel-7404/Akt1与K562/Akt1细胞中Akt1表达量明显高于野生型Bel-7404细胞与K562细胞,成功构建过表达Akt1的K562/Akt1、Bel-7404/Akt1稳转细胞株。Akt1过表达细胞株的成功构建为寻找和筛选高效、低毒、强特异性的Akt1抑制剂以及逆转细胞多药耐药（multidrug resistance,MDR）的研究提供了实验模型。     

水飞蓟宾对MCF-7和SK-OV-3诱导凋亡作用的不同敏感性

由于肿瘤的异质性,抗肿瘤药物作用不同的肿瘤模型时表现出不同的敏感性和不同的作用机制.将水飞蓟宾分别作用乳腺癌细胞MCF-7和卵巢癌细胞SK-OV-3,研究其对细胞增殖、细胞凋亡的影响及可能的作用机制.与卵巢癌细胞SK-OV-3相比,水飞蓟宾对乳腺癌细胞MCF-7具有明显的细胞增殖抑制及诱导凋亡能力,并都通过激活caspase 3的方式启动凋亡程序.此研究结果将为肿瘤的个体化治疗和临床实验提供可靠的保证.     

CD44、CD133和ABCG2潜在癌症生物标记蛋白质的表达

癌症生物标记物是一种新的早期癌症治疗工具,它既可用于癌细胞抑制,也可用于将其杀灭.癌干细胞已被证明是癌症的一个关键标志细胞.最近,随着单克隆抗体技术的发展生物标记物的研究发展迅速,一些重要的癌干细胞标记已被确认.单克隆抗体是癌标记物应用的重要技术,也是临床诊断和治疗重要手段.本研究的癌干细胞标记物CD44,CD133和ABCG2,分别通过Genestar等软件分析,并选定目标抗原特异性的基板的基因,设计出目标基因的模板和引物.经过免疫分析,设计出编码基因,利用PCR克隆技术,将其并插入预先选定的pGEX-4T-1或pET32a质粒上的克隆位点上.载有预定基因的标记物,通过载体转入感受态的E.coli BL21中,在加入IPTG的条件下,诱导其蛋白质的表达,得到目标蛋白质产物.利用SDS-PAGE和Westem Blot analysis,验证其表达的正确性.研究的目标蛋白质片段CD44、CD133和ABCG2,可以用于癌干细胞进一步的研究和其单克隆抗体的制作.

Abstract：

Cancer biomarkers can provide the chance to develop therapies for cancer during its the natural progression, to either inhibit or eliminate the disease. Cancer stem cells have been proved to be critical in the progression of cancer. Recently,some important cancer stem cells markers have been characterized. The rapid development of cancer biomarker research is attributed to a large extent to the advance of the monoclonal antibody technology. Monoclonal antibodies specific for cancer biomarkers have important clinical use in diagnosis and therapeutics. In the present studies, the cancer stem cell markers,CD44,CD133 and ABCG2 ,were first analyzed for their respective antigenic epitopes by Genestar. Then the gene encoding protein fragment with sound immunogenicity was cloned by PCR and inserted to the multiple cloning site of the pGEX-4T-1 or pET32a plasmid. The resulting expression vector was transformed into the E. coli BL21 strain and the protein expression was induced by the addition of IPTG. Finally,the target protein was characterized by the SDS-PAGE and Western Blot analysis. In further study,these CD44 ,CD133 and ABCG2 target protein fragments will be utilized to develop monoclonal antibodies, which can be used in cancer stem cell research.