过表达Akt1细胞株的构建及鉴定

Akt1是细胞信号传导通路中的关键信号分子,具有促进细胞增殖、生长、迁移、侵袭,以及抑制细胞凋亡,抵抗化疗和放疗等重要作用。文章通过构建pLJM1-Akt1重组质粒,利用慢病毒侵染的方法将重组质粒转染至K562、Bel-7404细胞,用嘌呤霉素筛选得到Akt1稳定过表达的Bel-7404/Akt1、K562/Akt1细胞株,通过Western bloting分析细胞株中Akt1的表达情况。结果显示:Bel-7404/Akt1与K562/Akt1细胞中Akt1表达量明显高于野生型Bel-7404细胞与K562细胞,成功构建过表达Akt1的K562/Akt1、Bel-7404/Akt1稳转细胞株。Akt1过表达细胞株的成功构建为寻找和筛选高效、低毒、强特异性的Akt1抑制剂以及逆转细胞多药耐药(multidrug resistance,MDR)的研究提供了实验模型。     

腺病毒介导的T细胞高效基因表达系统的构建

结合转基因修饰的手段,能有效提高细胞免疫治疗的疗效,但由于缺乏T细胞高活性表达系统,限制了该方法的应用。构建腺病毒介导的双荧光素酶启动子活性筛选系统,检测一系列常用强启动子(CMV、CMV(in)、CAG、EF1α及CASI)在T细胞株K562及Jurkat中的活性,发现EF1α启动子活性在T细胞株中的活性最高。在EF1α的基础上,增加mCMV增强子和hCMV增强子顺式作用元件,构成了2个新型嵌合型启动子CCEF及CCEF(in)。双荧光素酶检测系统检测结果表明,新构建的2个启动子在T细胞中的活性高于EF1α,且两者相比CCEF启动子活性更高(p0.05)。利用CCEF启动子控制PD-1全长抗体基因,并将此表达框插入腺病毒基因组,构建重组腺病毒Ad-CCEF-anti-PD-1。通过Western blotting及ELISA方法检测病毒感染T细胞株后,抗体基因的表达效率。结果表明,Ad-CCEF-anti-PD-1感染T细胞后,PD-1抗体能在T细胞中正确表达,且表达量较高(K562中11.019μg/mL,Jurkat中9.078μg/mL),表明该腺病毒介导的T细胞高效的基因表达系统成功构建,具有良好的应用前景。     

萤火虫荧光素酶标记结直肠癌模型的建立

针对小鼠结直肠癌细胞(CT26)构建能够稳定表达萤火虫荧光素酶Firefly luciferase(Fluc)以及具有嘌呤霉素抗性的CT26-Fluc细胞株,并建立其荷瘤鼠模型。采用同源重组技术将Firefly luciferase基因片段整合至转座子系统中得到质粒,将所得质粒转染进入CT26原始细胞株,使其在该细胞内表达。后通过细胞敏感性实验获得CT26最低致死浓度,筛选获得稳定表达荧光素酶的CT26-Fluc单克隆细胞系。流式细胞仪检测CT26-Fluc单克隆的纯度。同时利用显微观察等方法证实细胞增殖和细胞形态与CT26原始细胞系不存在显著差异。将构建成功的CT26-Fluc植入BALB/c小鼠右后侧背部皮下,通过小动物活体成像仪验证该细胞系能稳定表达荧光素酶,且能够用于小鼠结直肠癌成瘤模型。本实验成功构建了稳定表达Firefly luciferase的CT26-Fluc细胞系,为小鼠结直肠癌模型及其病灶转移机制的研究建立了技术基础。     

PHA-767491联合IL-24基因对肝癌细胞的杀伤研究

利用最新发现的抗癌新药PHA-767491联合肿瘤基因治疗中最常用的杀伤基因IL-24共同处理肝癌细胞Bel-7404,采用20MOI携带IL-24基因的非复制型病毒Ad-IL-24联合不同浓度的PHA-767491对肝癌细胞Bel-7404进行治疗研究。western blot实验结果表明:PHA-767491对IL-24的表达无明显抑制作用;MTT和Ho-ceast33342染色实验表明二者联合对Bel-7404细胞表现出了较高协同杀伤作用。     

三叶半夏凝集素C端结构域的可溶表达及其活性研究

利用pET-32-SUMO表达载体在大肠杆菌中可溶表达三叶半夏凝集素C端结构域(P-D2),并研究其凝血活性、糖结合特异性以及肿瘤抑制活性。实验结果表明,P-D2蛋白的产量为5mg/L。该蛋白具有凝集小鼠红细胞的活性,可以被D-甘露聚糖抑制,但不能被D-乳糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖抑制。P-D2蛋白的体外抗肿瘤活性实验表明其对肝癌细胞Bel-7404以及结肠癌细胞SW-620都有良好的抑制作用。凋亡现象观察实验发现P-D2蛋白可以诱导癌细胞Bel-7404的凋亡。这是首次在大肠杆菌表达系统中表达了可溶的半夏凝集素C端结构域,为其他凝集素的可溶表达提供了新的选择。     

三叶半夏凝集素C端结构域的可溶表达及其活性研究

利用pET-32-SUMO表达载体在大肠杆菌中可溶表达三叶半夏凝集素C端结构域（P-D2）,并研究其凝血活性、糖结合特异性以及肿瘤抑制活性。实验结果表明,P-D2蛋白的产量为5mg/L。该蛋白具有凝集小鼠红细胞的活性,可以被D-甘露聚糖抑制,但不能被D-乳糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖抑制。P-D2蛋白的体外抗肿瘤活性实验表明其对肝癌细胞Bel-7404以及结肠癌细胞SW-620都有良好的抑制作用。凋亡现象观察实验发现P-D2蛋白可以诱导癌细胞Bel-7404的凋亡。这是首次在大肠杆菌表达系统中表达了可溶的半夏凝集素C端结构域,为其他凝集素的可溶表达提供了新的选择。     

K562/ADR细胞的5型腺病毒感染率研究

腺病毒是目前肿瘤基因治疗研究的常用载体,而5型腺病毒(Ad5)以其复制效率高、载体容量大等优势而被广泛用于基因治疗的相关研究.比较5型腺病毒对人白血病细胞K562及其耐药株K562/ADR的感染效率,并分析引起这种差异的分子机制.流式细胞术及荧光显微镜观察,结果显示,5型腺病毒对K562/ADR的感染效率明显高于K562;Real time PCR定量分析表明K562/ADR细胞株表面的CAR表达水平约为K562的1.33倍(P<0.05),而整合素αν表达则是K562的4.36倍(P<0.01).     

人溶菌酶/乳铁蛋白双基因重组质粒在牛乳腺细胞中的表达

研究检测人溶菌酶/乳铁蛋白双基因重组质粒pEBH-IL在牛乳腺上皮细胞中的表达。采用脂质体转染技术,将pEBH-IL质粒DNA导入体外培养的牛乳腺上皮细胞中。加入G418对转染的细胞加压筛选,获得稳定转染的细胞。采用绿色荧光蛋白(EGFP)和PCR方法检测牛乳腺细胞基因组中的目的基因,并采用Westhorn Blot对重组质粒在牛乳腺细胞表达产物进行检测。试验表明:G418筛选获得稳定转染的细胞,对照组加压后第7 d细胞全部死亡,转染组第12~15 d汇片达80%左右;在荧光显微镜下观察到EGFP表达;PCR检测到目的基因;阳性细胞培养液中检测到目的蛋白的表达。结果表明:以人溶菌酶/乳铁蛋白为目的基因构建的重组质粒pEBH-IL在牛乳腺细胞中具有表达功能。     

狂犬病病毒aG株假病毒的制备方法

基于HIV慢病毒包装系统建立了狂犬病病毒（RV）aG株假病毒的制备方法。构建编码RV aG株糖蛋白（GP）的重组真核表达质粒pCMV-aG-G,转染至293T细胞验证GP的表达。将GP表达质粒与假病毒包装质粒及绿色荧光蛋白（GFP）指示质粒共转染293T细胞进行假病毒包装,制备携带GFP报告基因与aG株GP的RV假病毒。结果表明,研究成功构建了编码RV aG株GP的重组真核表达质粒,其可在293T细胞中有较高表达;成功制备了具有细胞感染性的RV aG株假病毒。本研究有助于更安全、准确监测针对我国现用人狂犬病疫苗生产用RV固定毒aG株的中和抗体水平。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA联合ZD55-TRAIL溶瘤腺病毒对肝癌细胞杀伤作用的研究

研究组蛋白去乙酰化抑制剂SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)联合ZD55-TRAIL对人肝癌细胞株的体外杀伤效果,实验采用MTT法检测SAHA、ZD55-TRAIL以及二者联合对肝癌细胞株Huh-7、Bel-7404、Hep3B以及人正常肝细胞株QSG-7701增殖的抑制作用;利用Hoechst33342染色对联合处理的细胞进行凋亡形态学观察;通过结晶紫实验进一步检测联合用药对肿瘤细胞的杀伤情况;通过Western blot实验在蛋白水平上检测一些凋亡相关蛋白表达情况的变化.实验结果表明:SAHA联合ZD55-TRAIL处理3d后对肝癌细胞株Huh-7的增殖抑制率达到50％,对Hep3B、Bel-7404也达到近40％的杀伤效率,并且联合治疗后对人正常细胞株QSG-7701未见明显的毒副作用.同时结晶紫实验也证明联合治疗对肿瘤细胞的杀伤力强于用SAHA或ZD55-TRAIL单独使用.Western blot实验证明了药物和病毒的联合作用使促凋亡蛋白Bcl-2,Bcl-xL的表达量明显减少,caspase-8和caspase-9蛋白也有相应剪切现象的发生.流式细胞仪同样检测出SAHA和ZD55-TRAIL联合作用对肝癌细胞有很好的杀伤作用.     

棉酚在肝癌细胞中作用机制的研究

棉酚是棉花中倍半萜（十五碳）的法尼基焦磷酸环化后合成的次生代谢产物。近来有研究显示棉酚具有抗肿瘤效果。本研究通过MTT、Hoechst染色、Westernblot等生化技术开展棉酚对肝癌细胞系Bek7404的增殖抑制及促凋亡作用研究。MTT实验结果表明5retool棉酚即对肝癌细胞增殖具有强烈抑制作用,Hoechst染色表明5mmol／L棉酚即可对肝癌细胞具有促凋亡作用,Westernblot结果表明棉酚能下调Bcl-2基因的表达。棉酚对肝癌细胞系Eel-7404具有很好的抑制增殖和促凋亡的效果。     

人源血管紧张素转化酶-N结构域基因片段在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR方法从食管癌细胞TE-1中反转出cDNA,PCR扩增得到血管紧张素转化酶N结构域(ACE-N)基因片段,构建pPIC9K-ACE-N表达载体,转化毕赤酵母GSll5,阳性克隆再次电转,并从转化菌株中筛选出多拷贝转化子进行表达.经Ni2+亲和层析柱对表达的蛋白进行纯化,获得的目的蛋白表达量为0.11 g/L,其纯度大于99％.为今后选择性抑制血管紧张素转化酶两个同源结构域的体外研究奠定基础.     

Effect of hydroxyapatite nanoparticles on K562 cells in vitro

Stable and single-dispersed hydroxyapatite （HAP） nanoparticles were synthesized with ultrasonic-assisted method. HAP nanoparticles were characterized by dynamic light scattering, XRD （X-ray diffraction） and TEM （Transmission Electron Microscopy）. The effect of HAP nanoparticles on the K562 human myelogenous leukemia cell line was investigated by MTT assay and cell count test, and the mechanism was studied through the changes of cell cycle and ultrastructure. The results showed that HAP nanoparticles inhibited the proliferation of K562 cells dramatically in vitro. HAP nanoparticles entered the cytoplasm of K562 cells and the cells were arrested at G/M phase, thus, the cells died directly.     

The Difference of Sensitivity between BXPC-3 and K562 Cells by Treatments with Combination of Indole-3-acetic Acid and Horseradish Peroxidase

The difference of sensitivity to indole- 3-acetic acid （ IAA ） combined with horseradish peroxidase （HRP） in K562 and BXPC- 3 cells was investigated. The cell proliferation was determined by MTF assay. The cell cycle and apoptosis of K562 and BXPC-3 cells were examined by a fluorescence flow cytometer （FCM） and terminal deoxynacleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling （TUNEL） respectively. The experimental results show that IAA and HRP could inhibit BXPC- 3 cell proliferation greatly compared with K562 cell during the first 48 h . The cell cycle was arrested predominantly at G2/ M phase in K562 and BXPC- 3 cells. The cell apoptosis of K562 and BXPC- 3 was induced by IAA/ HRP. There was a significant difference between the two cell lines since BXPC-3 cells were more sensitive than K562 cells by treatments with combination of IAA and HRP.     

PD-1抗体表达载体的构建以及其功能的探究

通过构建含PD-1抗体基因的重组腺病毒表达载体Ad35-anti-PD-1,表达的PD-1抗体以探究其对细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）抗肿瘤功能的影响。用ELISA实验检测Ad35-anti-PD-1在293细胞中PD-1抗体的表达量;利用Protein G亲和层析法纯化PD-1抗体;通过体外杀伤实验研究PD-1抗体阻断PD-1信号通路的CTL杀伤肝癌细胞能力的变化。显示成功构建重组腺病毒载体Ad35-anti-PD-1,滴度为1×1010 pfu/mL;ELISA实验检测在72h时293细胞上清中PD-1抗体的表达量约在600ng/mL;Westernblotting实验证明PD-1抗体包含正确的重链（50kD）和轻链（25kD）;ELISA实验检测从100mL细胞上清中得到1mL浓度在40μg/mL的PD-1抗体;体外杀伤实验证明CTL在添加PD-1抗体的环境中杀伤肝癌细胞的能力显著增强。     

羟基磷灰石纳米粒子对肝癌细胞PCNA表达的影响

为了研究羟基磷灰石(HAP)纳米粒子对肝癌细胞增殖细胞核抗原表达的影响,采用均匀沉淀法制备了均匀分散的纳米尺度的HAP纳米粒子。以0.56 mmol/L的HAP纳米粒子与Bel-7402肝癌细胞作用后,采用流式细胞技术检测细胞周期时相的变化,行免疫细胞化学法PCNA染色,形态学观察和定量分析细胞的PCNA表达。结果显示HAP纳米粒子能使Bel-7402细胞的细胞增殖周期阻滞于G1期,PCNA表达降低,与对照组比较有显著性差异(P<0.01)。HAP纳米粒子可能通过抑制PCNA的表达,起到抑制肝癌细胞增殖的作用。     

T C-1-HPV16 L1细胞模型与动物模型的建立与评价

为了解决人乳头瘤病毒16型L1蛋白(HPV16L1)为主要靶点的疫苗缺乏肿瘤模型细胞来验证疫苗的免疫效果的问题,构建了一个细胞模型并可以利用此细胞在实验动物体内形成肿瘤,用于以HPV16L1为主要靶点疫苗的验证实验。利用这个模型细胞或肿瘤模型可以在体内外检测疫苗的免疫学性质和保护功效。首先,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法获得目标基因HPV16L1的基因序列并连接到载体质粒中,将质粒转染到细胞TC-1后在杀稻瘟菌素抗性压力筛选下获得稳定表达HPV16L1的细胞株。对TC-1和TC-1-HPV16L1两种细胞的生长增殖和成瘤特性进行比较发现,外源基因的加入对细胞特性没有影响。通过体外杀伤实验证实细胞TC-1-HPV16L1能够被HPV16L1靶点疫苗免疫过的小鼠脾淋巴细胞杀伤。实验动物被疫苗免疫后,进行攻瘤实验发现疫苗只对TC-1-HPV16L1组具有保护作用。综上,在本研究中成功地构建了可以检测HPV16L1疫苗的抑瘤效果的模型细胞TC-1-HPV16L1,为HPV疫苗的研究提供了一个模型细胞。     

融合蛋白sCAR—TSP-1原核表达纯化及诱导白血病细胞K562凋亡的研究

根据thrombospondin-1（TSP-1）氨基酸序列（RFYVVMWK）,以已有的腺病毒受体sCAR为模板,将8个氨基酸对应基因核苷酸通过PCR扩增于sCAR之后,得到sCAR—TSP-1,连接到表达载体pQE30上,转化大肠杆菌M15后获得工程菌。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-TSP-1。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE分析表明,有一条明显的特异性蛋白条带。同时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-TSP-1对白血病细胞K562有明显凋亡作用。