热带假丝酵母木糖醇脱氢酶的分离纯化

探讨了热带假丝酵母中木糖醇脱氢酶的分离纯化工艺。分步采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶层析以及Hi Trap Blue HP亲和层析等纯化方法,得到电泳纯的木糖醇脱氢酶。经SDS-PAGE和native-PAGE分析表明,木糖醇脱氢酶分子质量约为90ku,由2个分子质量为45ku的亚基组成。最终酶蛋白纯化倍数达到60·8倍,回收率为10·9%。     

近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶CpCR的表达及酶学性质研究

通过构建重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/pACYC Duet-1-cpcr,表达带有His标签的近平滑假丝酵母Candida parapsilosis ATCC 7330羰基还原酶CpCR基因,并采用Ni-Agarose亲和层析对重组酶CpCR进行分离纯化和酶学性质研究。重组酶CpCR的基因序列全长1 107 bp,含有368个氨基酸,分子质量在41 kDa左右,比酶活力为20 U/mg;该酶在4～33℃的温度范围稳定性较好,相对酶活力在80%以上,T₅₀值为37℃;该酶的pH适宜范围在6.2～7.5,在中性条件下稳定性最好; Cu²⁺对该酶有强烈的抑制作用,在1 mmol/L条件下,相对酶活力下降30%,在5 mmol/L条件下,相对酶活下降50%;该酶对底物苯甲醛、正丁醛亲和能力强于4-氯-3-酮基-丁酸乙酯(4-chlor-3-keto-butyrate-ethyl ester,COBE),对苯甲醛或正丁醛的催化效率是对COBE的20倍左右;该酶是一种NADPH依赖型的羰基还原酶。本研究为羰基还原酶CpCR分...     

解脂假丝酵母脂肪酶的纯化及性质研究

通过采用盐析和透析等提纯方法,对解脂假丝酵母(Candidalipolytica)脂肪酶进行了纯化,比活提高了2.69倍,回收率45%.该酶反应的最适pH值为7.5,最适温度为38℃,pH稳定范围为6.0～7.5,温度稳定性较差,以2mol/L的蔗糖作保护剂效果较好.该酶为金属酶,5mmol/L的钙离子有较好的活化效果.     

酸性α-淀粉酶菌株的诱变及酶的性质研究

以醋醅中筛选出产α-淀粉酶的酵母菌为出发菌进行N 离子注入诱变,使产物酶活提高了219%,达到497U/g。对其所产-α淀粉酶进行分离纯化,实验表明,该酶的最适温度为60℃,最适pH值为4.0,分子量约为81kDa,Ca2 对该酶的激活作用不明显。薄层层析结果表明,该酶水解淀粉产物为糊精和多种低聚糖。     

产正丁醇脱氢酶微生物的筛选及其酶学性质的初步研究

为研究酒类混合发酵过程中正丁醇的产生规律及建立调控正丁醇含量的方法,以酒曲和酒醅为样品,利用LB培养基分离菌株,吸光值法和气相色谱法测定菌株对正丁醇催化的减少量,从中筛选能够在乙醇存在条件下催化正丁醇的微生物,并对该微生物所产酶的性质进行初步研究.结果显示,所筛得编号为DQ-54的细菌属肠杆菌属(Enterobacte...     

白假丝酵母环核苷酸磷酸二酯酶2的异源表达、纯化与酶学特性分析

为获得白假丝酵母(Candida albicans)环核苷酸磷酸二酯酶2 (phosphodiesterases 2,PDE2),以C.albicans基因组为模板,经聚合酶链式反应扩增获得目的基因,构建重组质粒pET28a-C.albicans pde2,转化至大肠杆菌BL21中,获得稳定表达的基因工程菌。所表达的蛋白通过亲和层析柱(Ni-NAT)、离子交换层析柱(Q-Sepharose)和分子筛层析柱(Sephacryl S200)逐步进行纯化。应用高效液相色谱方法测定纯化的PDE2蛋白(约62 kDa)对单底物及双底物的水解特性,证明PDE2在0.385 mg/mL质量浓度下,对0.4mmol/L cAMP和cGMP的水解率达到60%～70%,且对底物cAMP具有更高的亲和力,并确定该酶具有较高生物学活性和稳定性,为该蛋白的晶体学解析及在C.albicans中的生理病理机制研究提供理论依据。     

褶皱假丝酵母产脂肪酶条件及酶学性质研究

对一株来源于海洋有产脂肪酶能力的褶皱假丝酵母产酶条件进行研究,探讨了碳源、氮源、pH、培养温度对该菌产脂肪酶的影响。结果显示:在摇瓶培养条件下,其最适产酶条件为:蔗糖5 g/L,橄榄油5 g/L,MgSO4·7H2O1 g/L,K2HPO41 g/L,(NH4)2SO410 g/L,起始pH为7.0,接种量10%,在30℃、200 r/min下培养36 h,产酶能力达到4 351.6 U/mL。该菌所产脂肪酶的最适反应pH为7.0,最适反应温度为37℃,Ca2+、Mg2+对酶活有一定的促进作用。     

红佳酿酵母β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

以红佳酿酿酒酵母为出发菌株,通过离子交换法分离纯化β-葡萄糖苷酶,测定酶活力和蛋白质含量,并研究温度、pH值稳定性和金属离子、葡萄糖、酒精度对酶活力的影响。结果表明:粗酶液经过离子交换层析后,纯化倍数为19.41,得率为38.67%;经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)电泳检测为1条谱带,达到电泳纯,分子质量约为45 kD;β-葡萄糖苷酶热稳定性较差,在20~40℃较稳定,在pH 5.0~10.0较稳定;Al3+、Cu2+对酶活力有抑制作用,K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Na+对酶活力的影响不明显;葡萄糖和酒精对酶活力无明显抑制作用。     

黄酒酵母β-苯乙醇合成途径醇脱氢酶I的异源表达及酶学特性

醇脱氢酶 I (Adh1p)是黄酒酵母艾利希途径最后合成β-苯乙醇的一个关键酶。为探究黄酒酵母Adh1p的差异及酶学特性,以工业生产菌株黄酒酵母HJ和模式菌株酿酒酵母S288C的基因组为模板,设计引物PCR扩增醇脱氢酶编码区基因ADH1,构建pET-28a(+)表达质粒,转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,IPTG诱导表达获得Adh1p。通过超声破碎菌体后获取粗酶液,亲和层析纯化后获取纯酶,进而探究酶学特性。以苯乙醛为底物,酶活性测定表明:来自黄酒酵母的Adh1pHJ纯酶的酶活(231.51 U/g) 比来自酿酒酵母的Adh1pS288C (203.48 U/g)高13.79%,且Adh1pHJ的Km值(0.524 μmol/L)小于Adh1pS288C的Km值(0.759 μmol/L),表现为Adh1pHJ与底物的亲和力更大。从kcat/Km值发现Adh1pHJ(0.406 L/(μmol·min))的催化效率更高。Adh1pHJ耐受β-苯乙醇和乙醇的能力较高于Adh1pS288C。本研究结果为Adh1p的结构以及酶学性质分析提供方法和理论依据,同时也对β-苯乙醇工业生产开发提供借鉴。     

库巴德巴利酵母FBKL2.0130 D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因的克隆表达及酶学性质研究

该研究从库巴德巴利酵母FBKL2.0130中克隆D-阿拉伯糖醇脱氢酶基因ARD,利用闪电克隆技术构建重组质粒Yep-PAK,并将重组质粒导入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W303-1A中,得到重组菌株W303-ARD并成功表达。并对重组菌株和亲本菌株的生长性能进行测定,并对重组D-阿拉伯糖醇脱氢酶酶学性质进行研究。结果表明,与亲本菌株相比,重组菌株的D-阿拉伯糖醇脱氢酶的还原活力从（32.7±0.803） U/mL提高至（122.4±1.012） U/mL,氧化活力从（18.46±0.105） U/mL提高至（97.30±0.826）U/mL。重组D-阿拉伯糖醇脱氢酶的最适反应温度为30 ℃,在25～40 ℃范围内氧化、还原活力均保持稳定。还原反应的最适pH值为9.0,在pH 9.0～11.0范围内比较稳定;氧化反应的最适pH值为7.0,在pH 7.0～8.0的范围内能保持较高的活性。Cu2+、Ba2+、Zn2+均能抑制重组酶活力;Mg2+对重组酶活力无明显影响;Ca2+、Mn2+、Fe3+均能提高重组酶活力。     

猪肝乙醇脱氢酶的分离纯化及部分性质

新鲜猪肝经匀浆、缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase,ADH）。纯化结果显示：该酶比活力为1 622.33 U/mg,回收率为29.05%,纯化倍数为34.58;该酶分子质量约为171.79 kD,亚基分子质量约为43.68 kD。ADH酶学性质研究显示：最适反应温度和pH值分别为45 ℃和10.0;在25～45 ℃及pH 7.5～9.0范围内稳定性较好;最适条件下测得该酶对乙醇的Km值为19 mmol/L;正丁醇、氯仿、异丙醇、十二烷基硫酸钠、草酸、Zn2＋、Cu2＋、Ag＋对该酶的抑制作用最强,Mg2＋对该酶有激活作用,EDTA对该酶有双重作用。     

氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003膜结合乙醇脱氢酶的纯化鉴定和性质研究

通过超速离心收集膜组分、表面活性剂溶解膜蛋白、CM- 纤维素柱层析纯化等步骤,从氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003 中获得电泳纯的具有1,2- 丙二醇脱氢酶活性的脱氢酶,此酶由两个亚基组成,其表观相对分子质量分别为80000 和50000。经MALDI-TOF MS-MS 质谱分析与肽质量指纹图谱检索鉴定,证明纯化得到的酶是乙醇脱氢酶。酶学性质分析表明,该酶的最适反应温度为30℃,最适pH 值为5.5～6.0;该酶能催化多种一元醇、二元醇,但对包含3 个以上羟基的多元醇基本无氧化活性;其催化活性随着底物碳链长度的增加而减小;大多数金属离子及抑制剂(Cu2+、Fe3+、Ca2+、EDTA 等)对此酶活性均有抑制作用。     

克雷伯杆菌甘油脱氢酶的分离纯化及性质

在有氧条件下,利用Q Sepharose Fast Flow离子交换层析和Blue Sepharose CL 6B亲和层析提纯克雷伯杆菌胞内甘油脱氢酶.酶的纯化倍数和回收率分别为 32.61 倍和 5.83%.通过SDS PAGE电泳测得该酶亚基的相对分子质量约为 34 000.该酶最适表观反应温度和最适反应pH值分别为60 ℃和11.在30 ℃以下及pH值10~12时,该酶具有良好的稳定性.在45 ℃和pH值11条件下,该酶以甘油和NAD 为底物的米氏常数Km分别为 0.75 mmol/L和 0.12 mmol/L.甘油脱氢酶对甘油的生理反应活性最大,对其它醇类如 1,2 丙二醇、乙二醇也有氧化能力.NH4 和Na 对酶有显著激活作用.巯基保护剂可明显地提高酶的活力.     

米根霉乙醇脱氢酶粗酶液的特性研究

米根霉细胞中乙醇脱氢酶(ADH)催化丙酮酸向乙醇支路的转化,导致丙酮酸向乳酸转化通量减少,降低了乳酸转化率。本文初步从米根霉菌丝体中提取制备ADH粗酶液,并研究其酶学特性,结果表明,ADH粗酶液体系反应的最适温度为25℃,温度高于30℃将降低ADH活力。ADH催化体系pH值对其活力有很大影响,最适pH值在7.5左右,高于或低于此值,反应速度均很快下降。在反应体系中添加0.1μmol的EDTA、Mg2+、Ca2+或Zn2+,对该酶都有一定的抑制作用。ADH以乙醛为底物的米氏常数Km为6.90×10-4mol/L。     

嗜热厌氧乙醇杆菌组氨酸融合双活性乙醇脱氢酶的克隆、表达和酶学性质

乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶是嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacter ethanolicus乙醇代谢途径中的关键酶。根据高同源性的NADP(H)依赖型Ⅱ型乙醇脱氢酶(S-ADH)的序列设计引物,从T.ethanolicusJW200基因组中PCR扩增出编码S-ADH的基因,插入带组氨酸标签的pET-20(b),测序获得基因大小为1 059 bp,并在大肠杆菌JM109(DE3)中表达。表达产物经Ni亲和柱提纯达电泳纯。带组氨酸标签的重组NADP(H)依赖型乙醇脱氢酶具乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶双活性,能将乙酰辅酶A转化成乙醇.带组氨酸标签的重组酶酶学性质为乙醛脱氢酶活性最适值为pH 8.4,最适温度70℃;乙醇脱氢酶活性正、逆反应分别最适pH 8.0,最适T 55℃;最适pH8.9,最适为T 60℃。以乙酰辅酶A(Aceyl-CoA)为底物,该酶的Km为3.32 mmol/L,Vmax为12.5μmol/(min.mg)。T.ethanolicusJW200中双活性S-ADH的首次发现,建立了该菌乙醇代谢途径中从乙酰辅酶A到的乙醇的另一条通路。     

FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶发酵、纯化及酶学性质

细菌来源的FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)较为罕见,作者利用乳糖为诱导剂,发酵E.coli BL21(DE3)生产FAD-GDH。7.5 L发酵罐中培养该菌,通过分批补料,分阶段温度控制,酶活达到1341 U/L,菌体量达12.4 g/L。通过镍柱、脱盐柱、阴离子交换柱三步层析对粗酶液分离纯化,获得比酶活109 U/mg的重组酶。SDS-PAGE凝胶电泳显示,重组蛋白质纯化后呈单一条带,相对分子质量约60000。等电聚焦电泳检测酶的等电点pI为5.3。酶标仪全波长扫描吸收光谱表明,该酶的辅基为FAD,与酶非共价键结合。相比其它糖类,以葡萄糖为底物酶的Km最小,为2.56 mmol/L,kcat/Km为3487.7 L/(mmol·s)。该酶在pH 5.5~8.0内稳定,最适反应pH 7.0,当pH高于8.0时酶活迅速降低。差式扫描量热分析(DSC)测得酶的Tm值为77℃,热稳定性良好。本研究为该酶的进一步工业化生产应用提供参考与借鉴。     

鸭肝谷氨酸脱氢酶的纯化与酶学性质研究

目的：获得鸭肝谷氨酸脱氢酶纯品并对其酶学性质进行研究。方法：采用丙酮脱脂、重金属离子沉淀、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose 离子交换层析和Sephacryl S-200 凝胶层析方法,分离纯化鸭肝谷氨酸脱氢酶,用SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度鉴定和酶相对分子质量测定。结果：从鸭肝中分离纯化获得电泳纯的谷氨酸脱氢酶,纯化倍数为60.93 倍,酶活力回收率为11.02%,比活力达24.37U/mg。酶相对分子质量为371.41,亚基相对分子质量为61.60。推测该酶由6 个相同亚基构成。该酶对NADH 的Km 为53.19μmol/L,最适pH 值为10.0,最适反应温度为35℃。该酶在pH8.0 左右较稳定;在40℃以下酶活力保持稳定。Zn2+、Li+ 和Cu2+ 对该酶具有显著的抑制作用。结论：分离纯化获得谷氨酸脱氢酶,该酶具有较高应用价值。     

谷氨酸生产菌S_(9114)中依赖于NADPH谷氨酸脱氢酶的纯化及性质

利用DEAE 纤维素离交柱层析、疏水柱层析和凝胶过滤层析等从谷氨酸棒杆菌S9114 中分离纯化出依赖于NADPH的谷氨酸脱氢酶 (GOH NADPH )。经HPLC测定 ,该酶的分子量为 188ku ;经SDS -PAGE电泳测得该酶的亚基分子量为 3 2ku。提示该谷氨酸脱氢酶由 6个亚基组成。该酶对NADPH具有高度专一性 ,在pH 7 5、3 7℃下 ,以α 酮戊二酸、NH4Cl和NADPH为底物时的米氏常数Km 分别为 9 2 2mmol/L、5 2 7mmol/L和 2 3 1× 10 -3mmol/L。最适反应pH为 7 5 ,最适反应温度为 42℃ ,并对热比较稳定。此外 ,KCl对GDH NADPH的活性具有激活作用。