不同来源氨基脲在刺参体内的富集和消除规律研究

目的分析刺参中低浓度氨基脲的残留分布特征,明确不同来源引起的低浓度氨基脲的变化趋势。方法采用超高效液相色谱-串联质谱法对不同来源氨基脲在刺参(Apostichopusjaponicus)体内的富集和消除规律进行研究。结果非呋喃西林源氨基脲, 1 d后氨基脲在刺参体壁的含量为0.57μg/kg,之后含量逐渐上升,到3d时含量度达到最大值1.00μg/kg。富集实验共持续3d,按天计算平均富集速率,分别为0.57、0.24、0.19μg/(kg·d),第140 d时体壁未检出,平均消除速率为0.0073μg/(kg·d);呋喃西林源氨基脲, 1 d后体壁的含量为0.52μg/kg,之后含量逐渐上升,到3 d时,含量达到最大1.00μg/kg。富集实验共持续3 d,按天计算平均富集速率,分别为0.52、0.26、0.22μg/(kg·d),第160 d时体壁未检出,平均消除速率为0.0064μg/(kg·d)。跟踪监测至180 d时,非呋喃西林源氨基脲和呋喃西林源氨基脲在刺参体壁内均未检出,半衰期分别为1045.7 h和1224.2 h,呋喃西林源大于非呋喃西林源。内脏的富集和消除速率相对较快,但内脏中氨基脲残留量大于体壁,所以降至未检出所需时间更长。结论在投喂过呋喃西林或暴露于一定浓度氨基脲的刺参,需经较长时间净化后才能降至未检出。     

刺参肠酶解-美拉德反应衍生物的特性

本文以刺参肠为原料,利用中性蛋白酶酶解获得酶解物,将酶解物与核糖进行美拉德反应得到刺参肠酶解-美拉德反应衍生物(MRPs-C)。再分别通过5、3、1 kDa的超滤膜进行超滤,得到组分MRPs-Ⅰ(>5 kDa)、组分MRPs-Ⅱ(3~5 kDa)、组分MRPs-Ⅲ(1~3 kDa)及组分MRPs-Ⅳ(<1 kDa)四部分。对比各组分在色度、紫外吸收、荧光强度及褐变程度的差异,并考察它们的ABTS⁺、DPPH自由基的清除能力、还原能力、Fe²⁺螯合能力及抗脂质过氧化作用。结果显示,通过比较四个超滤组分的特性,组分MRPs-Ⅰ的褐变程度、紫外吸收及荧光强度分别是组分MRPs-Ⅱ的5.0、2.7及1.1倍,其余组分较组分MRPs-Ⅰ和MRPs-Ⅱ的褐变程度更低,MRPs-Ⅳ对自由基清除能力、还原能力、Fe²⁺螯合能力及抗脂质过氧化能力最强,其中对ABTS⁺自由基的清除能力达到4.56 Trolox当量/μL样品,对DPPH自由基的清除率达到47.56%。上述结果说明,刺参肠酶解-美拉德反应衍生物中大于5 kDa的组分对其褐变程度、紫外吸收及荧光强度有较大贡献,低于1 kDa的组分对其抗氧化能力具有较大贡献。     

刺参2 种天冬氨酸蛋白酶的酶学性质及其对自溶的影响

对刺参体内2?种天冬氨酸蛋白酶——组织蛋白酶D（cathepsin?D,Cat?D）和组织蛋白酶E（Cat?E）的酶学性质进行探讨,并考察两者可能在刺参自溶中的参与作用。先用Tris-HCl缓冲溶液提取刺参体壁中的粗酶,采用特异性荧光底物法测定Cat?D和Cat?E的酶学性质。结果表明,Cat?D和Cat?E的最适pH值分别为5.0和4.0,分别在60?℃和40?℃呈现最大酶活性,两者在20～40?℃活性均较为稳定。Zn2＋、Cu2＋、Fe2＋、Fe3＋、Mn2＋可抑制Cat?D的活性,抑制率分别为86%、76.3%、29.2%、56.5%和48.5%。Fe3＋、Fe2＋、Cu2＋可抑制Cat?E的活力,抑制率分别为99.1%、82.2%和28.6%。Pepstatin?A、Z-Leu-Leu-Leu-H、苯甲基磺酸氟、1,10-菲啰啉能够抑制两者活性,抑制率分别约为98%～99%、65%～78%、30%～35%、19%～23%。二硫苏糖醇、L-Cys和乙二胺四乙酸则可将两者活性分别提升30.4%～31.1%、7.58%～9.64%、6.6%～7.9%。结果表明,刺参Cat?D和Cat?E为2?种具有一定金属离子敏感性和依赖性的天冬氨酸蛋白酶,其活性中心有丝氨酸和半胱氨酸参与其活性调节,且两者很有可能参与刺参自溶过程中蛋白质的降解。     

刺参不同酶解产物的抗氧化活性分析

为了探究刺参不同酶解产物的抗氧化活性,外源添加了3种蛋白酶（碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶）酶解鲜活刺参。测定了不同蛋白酶组的水解度、分子量分布、3种自由基（DPPH∙、O2-∙、∙OH）的清除率。结果表明：空白组水解度随着酶解时间的延长没有明显差异,蛋白酶组的水解度与酶解时间呈正相关关系,不同蛋白酶组水解度高低顺序为,中性蛋白酶>碱性蛋白酶>木瓜蛋白酶,中性蛋白酶组最高为19.4%,木瓜蛋白酶组最低为16.1%;酶解后大分子量片段减少,<200 u的氨基酸片段增加;碱性蛋白酶组,酶解时间1 h,粗肽得率最高达到64.2%。酶解时间2 h内,蛋白酶酶解后酶解液的抗氧化能力比未处理的样品明显提高,并且与酶解液浓度呈正相关关系;质量浓度为5 mg/mL的中性蛋白酶组（酶解0.5 h）,DPPH∙清除率可达到79.64%;碱性蛋白酶组3 h,∙O2-清除率为49.58%,0.5 h∙OH清除率最高为21.78%。综上所述,在抗氧化活性方面,中性蛋白酶酶解产物在外源添加的三种蛋白酶中效果最好,外源添加蛋白酶是提高刺参蛋白利用率的有效方式。     

基于非靶向代谢组学技术的氨基脲胁迫雌性栉孔扇贝的毒性作用机制研究

目的 本研究基于非靶向代谢组学技术,分析了暴露于50 mg.L^-1氨基脲72 h的雌性栉孔扇贝性腺代谢物组成及含量变化,以探究氨基脲对雌性栉孔扇贝性腺组织毒性及其作用机制。结果 非靶向代谢组学结果表明：与对照组相比,在氨基脲胁迫下,雌性栉孔扇贝性腺组织代谢物发生改变,共有64种差异表达代谢物,其中上调33个,下调31个;在HMDB数据库中进行比对分析,注释到36个差异表达代谢物,主要功能分类为有机酸及其衍生物、脂类和类脂分子及有机氮化合物等。差异代谢物功能通路的富集结果表明：氨基酸代谢、脂质代谢、信号转导、核苷酸代谢和内分泌系统等生物过程受到显著影响。根据筛选出的差异代谢物的生理功能及其涉及的代谢通路分析,差异代谢物鸟氨酸上调,推断雌性栉孔扇贝通过增加鸟氨酸含量,维持其正常生长过程。推测氨基脲可能通过影响栉孔扇贝的AMPKα-2 mRNA表达,进而影响了核苷酸代谢通路和类脂肪代谢作用通路,使得栉孔扇贝体内软脂酸含量下降。氨基脲可能通过对NMDAR的拮抗作用以及对GAD(谷氨酸脱羧酶)的抑制,干扰神经信号传导,导致雌性栉孔扇贝相关行为异常。结论 本研究探究了氨基脲对雌性栉孔扇贝性腺组织毒性作用及栉孔扇贝的响应调控机制,为后期深入研究氨基脲毒性作用机制提供理论依据。     

大肠杆菌色氨酸酶的制备及酶学性质

以硫酸铵沉淀法分离提取大肠杆菌色氨酸酶,进行色氨酸酶学性质检测及动力学初步探讨。结果表明：使用50℃水浴法进行细胞壁的破碎,提取粗TPase 酶液效果较好;(NH₄)₂SO₄ 粗提色氨酸酶有较好效果;色氨酸酶的最佳反应pH 值为8.0,在pH5.5～7.5 较稳定;最高耐受温度65℃,最佳反应温度45℃;K⁺、NH⁴⁺ 能够明显地提高色氨酸酶活性,而Na+ 则明显地抑制酶活性。对色氨酸酶的动力学研究表明,在相同反应条件下,针对底物L- 丝氨酸的米式常数Km 值远远大于吲哚的Km 值。     

酶解刺参内脏蛋白制备抗氧化肽的研究

对刺参内脏所含的内源蛋白酶的性质进行了初步研究,在此基础上分析和比较了利用内源蛋白酶和外源蛋白酶酶解内脏蛋白制备抗氧化肽的工艺。刺参内脏主要含有四种内源蛋白酶,最适pH分别为2.0、5.0、8.0和12.0。以羟自由基和超氧阴离子自由基清除率为指标,比较了内源蛋白酶和八种外源蛋白酶酶解内脏蛋白制备抗氧化肽的效果,结果表明菠萝蛋白酶为最佳用酶;用正交实验L9(34)对其水解条件进行优化,确定最佳酶解条件为:pH7.8、温度35℃、加酶量5.0g/100g、酶解时间1h,在此条件下所得酶解液对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除率分别为79.15%和28.57%。      

内源酶对刺参肠自溶的作用

以刺参肠为原料,通过诱导自溶并添加各种酶抑制剂,以三氯乙酸可溶性寡肽和还原糖释放量为指标,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法,研究内源酶在刺参肠自溶过程中的作用。结果表明,在一定的浓度范围内,胃蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、α-淀粉酶抑制剂和β-1,3-葡萄糖苷酶抑制剂对刺参肠的自溶均具有一定的抑制作用,且丝氨酸蛋白酶抑制剂N-甲苯磺酰-L-赖氨酸氯甲基化酮作用较强。说明胃蛋白酶、胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、α-淀粉酶和β-1,3-葡萄糖苷酶参与刺参肠自溶过程。     

游离果胶酶和固定化果胶酶的酶学性质

研究游离果胶酶和固定化果胶酶的酶学性质,结果表明,游离酶的最适温度为55℃,最适pH为4.0,明胶固定化酶的最适温度为60℃,最适pH为3.5,固定化酶的稳定性比游离酶更好,底物与固定化酶的亲和力增强。     

仿刺参卵酶解工艺条件优化

以仿刺参卵为材料,优化出酶解工艺,获得高水解度、风味独特的水解产物。首先,通过实验从木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶与风味蛋白酶中筛选出合适的水解用酶。然后通过单因素试验与正交试验,分别考察酶解温度、加酶量及酶解时间对筛选出的各种蛋白酶水解度的影响,获得单酶的优化水解工艺条件。最后进行多酶体系综合酶解实验,综合考虑水解度、生产成本和水解液感官评定结果来确定最佳水解工艺条件。结果表明:最佳酶解条件为:以混合酶(木瓜蛋白酶与复合蛋白酶质量比1:1)在加酶量2.0%、酶解温度75℃条件下酶解4h,煮沸灭酶活后再添加1.5%风味蛋白酶,在酶解温度45℃条件下继续酶解1h,在此工艺条件下水解度达到了77.11%,并且水解液鲜香浓郁,状态均匀澄清,可用于开发风味独特的功能食品。     

高效液相色谱法测定喹噁林类药物对刺参组织DNA的氧化损伤

为探索喹噁林类药物在刺参养殖中使用的安全性问题,采用高效液相色谱-紫外法对喹噁林类药物引起刺参组织DNA氧化损伤效应进行研究。采集经过不同添加剂量、不同时间喹噁林药物处理过的刺参组织,提取DNA,酶解后用高效液相色谱-紫外法对DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG）进行测定分析。结果表明：高效液相色谱-紫外检测法,操作简单,具有广泛的适用性、稳定性和准确性,灵敏度高,并且样品用量少,分析速度快。8-OHdG的含量随着乙酰甲喹质量浓度的增加和处理时间的延长而显著增加（P＜0.05）,存在质量浓度-反应、时间-反应关系,并且是一个持续性的过程。喹烯酮对DNA的氧化损伤也是随着添加剂量的增加而显著加重（P＜0.05）。说明乙酰甲喹和喹烯酮能引起刺参组织DNA的氧化损伤,对其遗传物质具有一定的遗传毒性,因此需要规范喹噁林类药物在刺参养殖中的使用。     

我国北方 3 种主要养殖模式刺参的营养组成与功能性成分差异研究

目的探究我国北方主要刺参产区3种不同养殖模式刺参营养组成与功能性成分的差异。方法从山东和辽宁采集底播养殖、围堰养殖和池塘养殖3种不同养殖模式共75个刺参样品,依据国家标准中的方法,比较分析刺参体壁中营养成分(灰分、粗蛋白、粗脂肪、氨基酸、脂肪酸)和功能性成分(胶原蛋白、刺身多糖和刺身皂苷)的含量。结果 3种养殖模式刺参体壁中的灰分、粗脂肪、粗蛋白、氨基酸(包括氨基酸总量、必需氨基酸、呈味氨基酸等)、不饱和脂肪酸总量、刺身多糖、刺身皂苷等含量均无显著差异。底播养殖模式刺参的甘氨酸、胶原蛋白、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)含量含量显著高于池塘养殖模式,围堰养殖刺参的含量位于中间水平;池塘养殖模式刺参的饱和脂肪酸含量最高,显著高于底播养殖模式,K、Na、Mg、Ca和P含量显著高于围堰养殖模式,而V含量显著低于围堰养殖模式,底播养殖刺参位于中间水平。结论 3种不同养殖模式刺参的营养成分组成存在一定差异。研究结果为促进和完善刺身营养及品质评价体系建设提供数据支持。     

鳀鱼蒸煮液及酶解液的风味特性分析

为了研究鳀鱼蒸煮液和酶解液的风味特征,通过电子鼻、电子舌和固相微萃取（SPME）-气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术,结合氨基态氮和可溶性肽含量分析鳀鱼蒸煮液和酶解液的风味物质组成差异。研究结果表明,蛋白酶处理组的氨基态氮含量及可溶性肽含量显著高于蒸煮液（p<0.05）,其中复合蛋白酶组最高,分别为418.60 mg/100 mL和5327.68 μg/mL;电子舌和电子鼻可以很好的区分三组样品,其中蒸煮液和酶解液的滋味和气味特征存在明显差异;SPME-GC-MS分析共鉴定出92种挥发性风味化合物,蒸煮液、风味蛋白酶酶解液和复合蛋白酶酶解液中分别鉴定出61、60和65种,其中醛类物质最丰富,其次是烃类、醇类、杂环类等,蒸煮液风味以醛类和烃类为主,而酶解液中醛类、杂环类含量明显增加,烃类含量明显降低。     

仿刺参体壁中抗菌肽的分离及抑菌活性

从仿刺参体壁中分离纯化出抗菌肽并研究其抑菌活性。以鲜活仿刺参体壁为原料,采用5%乙酸浸提法进行粗提,以抑菌活性为指标进行分离。经超滤系统超滤,大孔吸附树脂柱层析分离纯化,采用酶标仪比浊法检测各组分对大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、肠炎沙门氏菌（Salmonella eternitidis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的抑菌活性。采用Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,Tricine-SDS-PAGE）检测抗菌肽分子质量。结果表明：通过超滤分离,分别得到分子质量＜1、1～5 kD和5～10 kD组分,其中分子质量＜1 kD组分的抑菌活性最高,选用该组分继续进行大孔吸附树脂柱层析分离,得抑菌活性最高的组分,其Tricine-SDS-PAGE结果表现为单一条带,分子质量约为4.35 kD。     

仿刺参酶解提取物营养成分分析及其对小鼠免疫功能的影响

对仿刺参酶解提取物营养成分组成进行了测定和分析,并依照《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)中"增强免疫力功能检验方法",评价了其对小鼠免疫功能的影响。结果表明仿刺参酶解提取物水分、粗蛋白、粗脂肪、灰分、磷脂、多糖、皂苷含量分别为6.41%、70.51%、5.05%、6.83%、0.96%、8.56%、0.78%。仿刺参酶解提取物氨基酸总量为56.046 g/100 g,必需氨基酸占氨基酸总量的24.2%,鲜味氨基酸占氨基酸总量的55.6%。刺参酶解提取物低、中、高(0.1 g/kg·bw、0.2 g/kg·bw、0.6 g/kg·bw)剂量组可明显提高Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力,与阴性对照组比较差异显著(p0.05);3剂量组可显著提高小鼠血清溶血素水平(p0.05);高剂量组能极显著提高小鼠抗体生成细胞数(p0.01);中、高剂量组能极显著提高小鼠NK细胞活性(p0.01)。仿刺参酶解提取物含有丰富的营养成分,并具有增强免疫力的功能。     

海参内脏酶解物和体壁溶出物的护肤功效评价

该研究以海参加工副产物为试验材料,将海参体壁酶解物作为对照,分别考察了海参内脏酶解物和体壁溶出物的保湿、防晒、抗氧化、美白及抗衰老功能,旨在对海参加工副产物的护肤功效进行评价。试验数据表明,内脏酶解物和体壁溶出物在保湿、防晒、抗氧化、抗衰老功能上优于体壁酶解物。其中内脏酶解物的吸湿保湿、抗衰老功能综合评价最佳：在81% RH的12 h吸湿率和保湿率分别为52.51%和95.04%,弹性蛋白酶抑制率达到26.34%;体壁溶出物在防晒、抗氧化功能上表现最佳：在UVC和UVB波段的紫外吸收率分别为94.52%和33.89%,DPPH自由基清除率的IC50为3.00 mg/mL,ABTS与FRAP法总抗氧化能力分别为4.48 mmol/g和5.91 mmol/g。美白功能方面,体壁溶出物及内脏酶解物对酪氨酸酶活性抑制率的IC50分别为49.43 mg/mL和40.00 mg/mL,美白功能低于体壁酶解物（IC50=16.82 mg/mL）,但也能发挥很好的美白作用。在应用中,可以有效利用两种副产物在护肤功效上的作用优势,将二者联合应用或者作为体壁酶解物的补充应用在护肤品上,实现海参加工副产物的高效开发利用。     

偶氮甲酰胺与氨基脲在面粉及面包虾中的形成关系

为研究偶氮甲酰胺（azodicarbonamide,ADA）与面粉及油炸面包虾中氨基脲（semicarbazide,SEM）形成之间的关系,将添加ADA的面粉及面包虾经过一定湿热处理后,采用高效液相色谱-串联质谱法测定SEM的生成量。结果表明：含ADA的面粉经干热、湿热处理均能形成SEM,而湿热处理形成SEM的量随着加水量、加热时间和加热温度的增加呈现先增加后降低的趋势;含ADA的面粉形成SEM的量与ADA添加量呈现正相关（R2=0.998 2）,转化率约达1.0%～1.2%;同时,在无面粉基质的情况下,ADA也能形成SEM,但转化率仅为0.3%～0.4%;含ADA的面包虾形成SEM的量随着油炸时间或油炸温度的增加而增加。因此,ADA在一定湿热条件下能导致面粉及面包虾产品形成SEM,且形成量受ADA添加量、液料比、加热温度和加热时间等条件的影响。     

仿刺参肠道组织酶解工艺优化及肽段分析

以仿刺参肠道组织为原料,优化酶解工艺条件,研究梯级肽对小鼠原代巨噬细胞过氧化氢损伤的保护作用。采用单因素试验及响应面试验分析法对酶解工艺条件进行优化,利用超滤法获取不同截留分子质量的肽段,采用噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）比色法检测细胞活力。结果表明：通过响应面优化得最佳条件为：酶解温度50.10 ℃、酶解时间2.84 h、加酶量2.639万 U时水解度可达41.82%。通过超滤制备,分别得到分子质量小于650、650～1 000 u与1 000～10 000 u肽段,各肽段均能显著提高过氧化氢损伤细胞的细胞活力值,所获肽段对过氧化氢损伤巨噬细胞具有显著保护作用,其中小于650 u肽段更佳。     

刺参体内铝的富集和消除规律研究

目的研究铝在刺参体内的富集和消除规律。方法选取体重为(50±10) g的刺参暴露于铝浓度分别为50、150、300μg/L的海水中进行富集实验,分别在第0、1、3、5、7、10、15、21、30 d取样检测分析。富集实验结束后,放入自然海水中开始消除实验,分别在第1、3、7、14、21、35、45 d取样检测分析。结果3个实验组刺参体壁中铝的蓄积量范围为10.0～18.2mg/kg、富集系数范围为53.2～160、最终消除率范围为67.0%～78.6%;纵肌中铝的蓄积量范围为32.2～60.0mg/kg、富集系数范围为189～582、最终消除率范围为84.7%～88.2%;呼吸树中铝的蓄积量范围为69.2～120mg/kg、富集系数范围为365～1143、最终消除率范围为77.9%～86.4%;消化道中铝的蓄积量范围为78.7～275mg/kg、富集系数范围为865～1275、最终消除率范围为74.8%～86.1%。结论刺参各组织铝蓄积量、富集系数随暴露时间的延长而增大,各组织对铝蓄积量和富集系数大小顺序均为消化道呼吸树纵肌体壁,消化道和呼吸树是刺参富集铝的主要器官。刺参纵肌、呼吸树和消化道对铝的蓄积量、富集系数均随暴露浓度的增大而增大,体壁对铝的蓄积量也随暴露浓度的增大而增大,但体壁对铝的富集系数随暴露浓度的增大而减小。消除实验期间,刺参体壁、纵肌、呼吸树和消化道中铝残留量随消除时间的延长而降低,呈现前期消除较快,后期逐渐平稳的趋势;消除实验结束,3个浓度组刺参中铝的最终残留量与对照组相差不大。