重组人白细胞介素-18的纯化、复性及其活性检测

目的纯化和复性rhIL18,并测定其生物学活性。方法采用提取包涵体、分子筛层析及离子交换层析的方法纯化rhIL18,经稀释法复性,用IL18诱导PBMC产生IFNγ,ELISA法检测上清中IFNγ的水平。结果rhIL18纯度大于95%,复性回收率达30%以上,获得的产品可诱导PBMC产生大量的IFNγ,且呈剂量依赖关系。结论该纯化、复性方法为大量生产rhIL18打下了基础。     

人纤溶酶原饼环区5蛋白的原核表达体系的建立

目的　构建人纤溶酶原饼环区 5 (hPK 5 )蛋白原核表达载体 ,并进行表达和鉴定 ,为获取大量高纯度、具有生物活性的hPK 5蛋白奠定基础。方法　以纤溶酶原cDNA为模板 ,PCR扩增hPK 5基因 ,经酶切后构建表达载体pBV2 2 0 /hPK 5 ,转入大肠杆菌JM10 9进行温控诱导表达 ,表达产物经纯化、复性后 ,检测其抑制鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM)血管新生的生物学活性。结果　带有pBV2 2 0 /hPK 5的大肠杆菌表达的目的蛋白占菌体总蛋白的34 8% ,其表达蛋白具有His tag抗原活性和野生活性。结论　已成功构建了pBV2 2 0 /hPK 5重组质粒 ,并在大肠杆菌中获得高效表达。     

人BLys 78-285的高效表达、纯化及功能鉴定

目的 克隆人B淋巴细胞刺激因子(B-lymphocyte stimulator,BLyS)胞外区cDNA,并行高效表达、纯化及功能鉴定。方法 提取 HL-60细胞总RNA,经RT-PCR扩增编码人 BLyS胞外区 78-285氨基酸 cDNA,行序列测定后,构建高效原核表达载体pQE-80L,经 IPTG诱导表达及 Ni-NTA层析纯化,SDS-PAGE和 Wester blot检测活性。结果 RT-PCR扩增得到627bp的DNA片段,序列分析与CenBank中报道的编码BLyS 78-285的cDNA序列一致,并在大肠杆菌中得到高效表达,纯化后纯度可达95％,并能刺激B淋巴细胞增殖。结论 成功克隆人 BLyS胞外区cD-NA,并获得了高效表达,纯化产物具有生物学活性,为进一步研究奠定了基础。     

抗HIV—lgp120单链抗体的原核表达与初步纯化

目的在原核细胞表达抗HIV－1gp120单链抗体基因，纯化后检测其活性。方法 将单链抗体基因插入pET28原核表达载体进行诱导表达，对包涵体进行变异性复性处理后，利用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达的蛋白进行初步纯化，纯化后的单链抗体与gp120标准抗原膜条反应。结果 表达产物主要以包涵体形式存在，最高表达量占菌体总蛋白量的51％，金属螯合层析一步纯化后纯度超过85％。纯化后的单链抗体可以特异地识别gp120标准抗原。结论 在原核细胞表达的单链抗体，复性纯化后具有生物学活性。     

水牛干扰素α的可溶性原核表达、纯化及其抗病毒活性

目的在E.coli中高效表达可溶性水牛干扰素α(recombinant bovine interferon alpha,r Bo IFNα),纯化后检测其抗病毒活性。方法采用RT-PCR方法从水牛肝脏总RNA中扩增IFNα基因,插入原核表达载体p ET-32a中,构建重组表达质粒p ET-32a-IFNα,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测后,使用His Trap~(TM) HP镍离子亲和层析柱进行纯化,并采用细胞病变抑法,在水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)/MDBK细胞滴定系统上检测其抗病毒活性。结果核酸测序结果显示,r Bo IFNα基因全长498 bp,与Gen Bank报道的牛IFNαC亚型基因核苷酸序列同源性为100%;表达的r Bo IFNα蛋白主要存在于破碎菌体的上清中,表达量约占菌体总蛋白的63.8%;纯化的r Bo IFNα纯度高达98.52%,能与牛IFNα多克隆抗体特异性结合,比活性为(3.6±0.2 5)×10~6 U/mg。结论成功在E.coli中高效表达了可溶性r Bo IFNα蛋白,纯化的蛋白具有较强的抗病毒活性,为其临床应用奠定了基础。     

猪γ干扰素基因的合成、表达及纯化

目的通过人工合成猪γ干扰素(poIFN-γ)基因的编码序列,提高目的蛋白的表达。方法根据poIFN-γ的氨基酸序列,选择大肠杆菌所偏爱的密码子,设计并合成了24个寡核苷酸片段。通过重叠区扩增法,利用PCR合成poIFN-的成熟蛋白编码基因,克隆入pGEM-7Zf(+)载体,转化大肠杆菌TG1。经测序证实后,构建原核表达载体pBV222/poIFN-γ并转化大肠杆菌DH5α,经诱导表达后,进行SDS-PAGE分析及纯化。结果酶切及测序结果表明表达载体构建成功,工程菌诱导表达后的电泳图谱在相对分子质量约16500的位置出现明显的目的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的55%,占包涵体中总蛋白的80%,经Ni2+-NTA亲和层析纯化,纯度达90%以上。结论已获得了纯度较高的目的蛋白,为下一步对猪γ干扰素进行复性及活性研究奠定了基础。     

重组小鼠白细胞介素-17F/His融合蛋白的原核表达、纯化及生物活性

目的在大肠杆菌(E.coli)中表达并纯化重组小鼠白细胞介素-17F(rmIL-17F),并鉴定其生物活性。方法经RT-PCR扩增mIL-17f基因片段,定向插入原核表达载体pET28a,构建重组表达质粒pET28a/mIL-17f,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni2+-NTA亲和层析纯化rmIL-17F/His融合蛋白,Western blot鉴定其反应原性。以纯化复性的rmIL-17F滴鼻干预小鼠,采用实时荧光定量PCR法检测小鼠肺组织IL-6 mRNA的表达,ELISA法检测小鼠外周血IL-17F、IL-4和IFNγ的水平。结果扩增的mIL-17f基因DNA序列与GenBank中登录的mIL-17f基因序列一致,所构建的重组表达质粒pET28a/mIL-17f构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为19000,主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组蛋白纯度约为95%,具有良好的反应原性,经黏膜给药后,可促进小鼠肺组织中IL-6 mRNA的表达,并提高小鼠血清中IL-4和IFNγ的水平。结论已成功地在大肠杆菌中高效表达并纯化了具有生物学活性的rmIL-17F,为进一步研究IL-17F的功能奠定了基础。     

天花粉蛋白突变体TCS_(KR173-174CG)的构建、表达与纯化

目的构建天花粉蛋白(TCS)突变体基因,并进行表达及纯化。方法应用计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇,并进行定点突变。以栝楼基因组DNA为模板,经PCR扩增突变基因,与pRSET-A表达载体连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并对表达产物进行Ni-NTA层析纯化。结果目的蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化后,得到均一的TCS突变体蛋白。结论已成功构建了TCS突变体基因,并获得高效表达。     

《中国生物制品学杂志》2002年第15卷总目录

论著 流行性乙型脑炎病毒E蛋白上与病原性相关的氨基 (5) HIV一2型gpl05、gag核酸疫苗构建与免疫学研究 (9) 五种编码流感病毒蛋白的DNA疫苗的免疫原性研究 (13) 生长抑素(ss)基因在大肠杆菌IrF7ZZ表达系统中的 克隆与表达 (17) HSV一收基因/GCV系统治疗肿瘤的旁观者效应与 缝隙连接关系的研究 (21) 重组人IL一18的高效表达、纯化及诱导KG—l细胞 产生高水平INF一1 (24) 产芽孢梭菌纤溶酶的纯化及特性 (27) 森林脑炎纯化疫苗的研究 (32) 猪肾1一谷氨酰基转移酶((;GT)的提纯及其稳定性 (35) 从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶…     

重组人白细胞介素-10的表达与纯化

目的表达并纯化重组人白细胞介素-10蛋白,并进行活性检测。方法将重组质粒PCRT7/NT-TOPO-IL-10转化大肠杆菌BL21(DE3)pLyse细胞,IPTG诱导表达。采用Ni柱对表达产物进行亲和纯化,并检测其对外周血单核细胞分泌TNF-α的影响。结果IPTG诱导4h,目的蛋白表达量最高,可达45.02%,主要以包涵体形式表达。纯化后,所得目的产物的回收率为66.72%,纯度约为80.42%。纯化的IL-10对外周血单核细胞分泌TNF-α具有抑制作用。结论已成功表达并纯化了重组IL-10蛋白。     

人睫状神经营养因子基因克隆、表达、纯化及其生物活性

［摘 要］目的 克隆人睫状神经营养因子（hCNTF）基因，在大肠杆菌宿主系统中高效表达并纯化，获得具有生物活性的hCNTF蛋白。方法 以人染色体DNA为模板，经PCR扩增到编码CNTF成熟蛋白的cDNA序列，并克隆进原核表达载体 pBV220，在大肠杆菌 BL21（Gold）中进行表达，产物经 CM-Sepharose FF柱纯化后，以体外培养的鸡胚背根神经节（DRG）测定生物活性。结果 重组表达质粒pBV22Z- CNTF在大肠杆菌BL21（Gold）中获得了非融合的稳定、高效表达，目的蛋白占细胞总蛋白的45％左右，以可溶性和包涵体两种形式存在，表达上清及包涵体复性后经CM柱一步纯化纯度达90％以上；表达的重组hCNTF能促进培养的鸡胚背根神经节神经突起的生长。结论 基因工程rhCNTF的获得为进一步研究其结构功能关系和临床应用奠定基础。     

胸腺素α1串联体的表达、纯化及生物学活性检测

目的　表达胸腺素α1 (Thymosinalpha1,Tα1 )三串体 ,并进行纯化及生物学活性鉴定。方法　使用大肠杆菌偏爱密码子 ,人工合成Tα1 三串体 (Tα1 ③ )基因 ,在表达载体pET -2 2b(+)中克隆 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,经DEAE SepharoseFF阴离子柱纯化Tα1 ③蛋白 ,采用Westernblot鉴定表达产物 ,MTT法检测其生物学活性。结果　获得了纯化的Tα1 ③蛋白 ,相对分子质量约为 10 0 0 0 ,并具有Tα1 ③的生物学活性。结论　利用基因串联表达小分子多肽是一种可行的方法。     

胰岛素样生长因子-1基因原核表达载体的构建及表达蛋白的生物学活性

目的构建人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)基因原核表达载体,并检测表达的重组人IGF-1(rhIGF-1)蛋白的生物学活性。方法以pUC57-hIGF-1质粒为模板,PCR扩增hIGF-1基因,克隆入pTEtrans载体,进行DNA序列分析后,亚克隆入表达载体pTE,转化大肠杆菌W3110,进行诱导表达,表达产物经阳离子交换层析和凝胶过滤层析纯化,并进行Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析。MTT法检测rhIGF-1促MCF-7细胞的增殖作用。结果转化质粒pTE-hIGF-1的大肠杆菌经诱导后,以可溶性形式表达相对分子质量约为7700的目的蛋白,表达量约占菌体总蛋白的8%。Western blot证实该蛋白具有良好的反应原性,Tricine-SDS-PAGE证实纯度达98%以上,MTT证实具有良好的促MCF-7细胞增殖的作用。结论已成功构建了含hIGF-1基因的原核表达载体,并获得具有生物学活性的高纯度rhIGF-1。     

SARS病毒核衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的在大肠杆菌中高效表达SARS核衣壳蛋白。方法将已合成的SARS-CoV N蛋白基因片段,克隆至pUC-18载体,与pET28质粒连接,转化大肠杆菌,进行SARS-CoV核衣壳融合蛋白表达。用SARS患者恢复期血清进行表达产物鉴定。用色谱方法进行表达产物的层析纯化。结果SARS病毒N基因在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量占总蛋白的30%以上;经三步纯化后纯度达90%以上。结论已获得了SARS核衣壳蛋白样品。     

人溶菌酶基因的原核表达及其生物学活性

目的在大肠杆菌中表达人溶菌酶(hLYZ)基因,并检测其生物学活性。方法将人溶菌酶基因克隆至带有GST融合标签的原核表达载体pGEX-4T-1上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达产物经亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定,并用溶壁微球菌比浊法检测酶活性,热激法检测其生物学活性。结果经PCR、双酶切鉴定和核苷酸序列测定,表明重组表达质粒pGEX-4T-hLYZ构建正确。SDS-PAGE显示,在相对分子质量约40000处可见目的蛋白条带,表达量占菌体总蛋白的46.5%,目的蛋白在裂解沉淀中占17.0%,在裂解上清中占58.3%,主要以可溶形式表达。纯化后,重组蛋白纯度可达95%以上,且具有良好的反应原性。重组hLYZ酶活性为2389U/mg,对金黄葡萄球菌和大肠杆菌具有抑制作用。结论已成功地在大肠杆菌中表达了可溶性重组人溶菌酶,且具有较高的生物学活性。     

人CD271基因的克隆及原核表达

目的克隆人CD271基因,并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术从人REH细胞系中扩增CD271基因,将其克隆入pET22b表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行纯化及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET22b/CD271经双酶切鉴定,可见1197bp的目的基因条带。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约75000处可见表达条带。IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白表达量最高。纯化后蛋白纯度为82.5%。Western blot检测表明纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆了人CD271基因,并在大肠杆菌中获得表达。     

鸡干扰素γ的原核表达及其抗传染性法氏囊病毒的活性分析

目的原核表达鸡干扰素γ(chicken interferonγ,ChIFNγ),并对其抗传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)活性进行检测。方法 PCR法扩增Ch IFNγ基因,克隆至载体p ET-28a中,转化感受态E. coli BL21,经IPTG诱导表达,His-binding-resin柱进行纯化。取200 ng纯化蛋白,加至鸡胚成纤维细胞,37℃孵育24 h,接种IBDV,攻毒48 h观察细胞病变情况。将纯化蛋白经腹腔注射14日龄雏鸡,200μg/只,24 h后再注射1次,48 h后用IBDV进行感染,103 TCID50/只,感染48 h后无菌取鸡法氏囊组织,进行病理学及qRT-PCR检测。结果纯化蛋白相对分子质量约18 000,可与抗His标签单克隆抗体发生特异性结合,浓度约0. 8 mg/mL。加入纯化蛋白的鸡成纤维细胞病变明显减轻;注射纯化蛋白雏鸡的法氏囊组织病变减轻,病毒载量明显降低(P 0. 001)。结论本实验成功表达了Ch IFNγ重组蛋白,且于体内、外均有抑制IBDV的作用,为该蛋白的应用提供了实验依据。     

谷氨酰胺转胺酶基因的融合表达

运用基因工程手段在大肠杆菌中高效表达谷氨酰胺转胺酶基因。以茂原链霉菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到一条长为1224bp的谷氨酰胺转胺酶基因片段,成功构建原核表达载体pGEX-TGase,并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌BL21/pGEX-TGase。重组菌经IPTG诱导产生GST-TGase融合蛋白,并对表达条件进行了优化,应用亲和层析方法纯化融合蛋白,对纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析,结果显示目的蛋白获得了较高水平的表达。     

甘油脱水酶α亚基基因的克隆、表达及纯化

目的克隆甘油脱水酶α亚基基因,构建表达载体,表达并纯化融合蛋白。方法采用PCR技术克隆甘油脱水酶α亚基gldA基因,并将其重组到含组氨酸标签的表达质粒pET-32a(+)中。将重组质粒经热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经金属螯合层析柱纯化,并进行Western blot分析及活性检测。结果重组表达质粒pET/gldA经酶切鉴定及序列分析,证明构建正确。转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达,融合蛋白相对分子质量约81000,与预期大小一致。经Western blot分析,纯化蛋白能与6-Histidine抗体产生特异性免疫反应。α亚基经检测,未显示活性。结论已成功获得甘油脱水酶α亚基蛋白,为进一步研究其生物学性能奠定了基础。     

人TRAIL细胞外段基因在大肠杆菌中的表达及其包涵体的复性

目的　在大肠杆菌中表达人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段 (sTRAIL)基因 ,并研究其包涵体的复性。方法　应用RT- PCR法从正常人外周血单核细胞中获得sTRAIL的编码基因 ,将其克隆到原核表达载体pBV2 2 0 ,于大肠杆菌DH5α中通过温控诱导表达 ;将包涵体进行变性和复性处理后 ,采用离子交换层析纯化表达产物 ,并经Dotblot及MTT试验鉴定。结果　通过温度诱导 ,目的基因主要以包涵体形式高效表达 ,包涵体蛋白经梯度透析法复性可获得具有抗肿瘤活性的重组人sTRAIL。结论　已获得大量纯化重组人sTRAIL ,为开发新型抗肿瘤制剂奠定基础。