马克斯克鲁维酵母β-半乳糖苷酶合成条件的优化及其酶学性质表征

β-半乳糖苷酶是广泛使用的食品添加剂,主要用于降解乳制品中的乳糖,缓解乳糖不耐受症状。该研究对实验室保藏菌株马克斯克鲁维酵母的发酵条件进行了优化。在20 g/L半乳糖、20 g/L玉米浆干粉、40℃、初始pH 6.5、150 r/min的条件下,粗酶液的酶活力为26.3 U/mL,表明该菌株具有利用廉价碳氮源高效生产β-半乳糖苷酶的潜力。通过DEAE阴离子交换层析进一步纯化得到比活力为124.09 U/mg的纯化酶。纯化后酶的最适温度40℃,最适pH 6,K_m为5.28 mmol/L,k_cat为4.74 s^-1。此外,发现该酶受Mg²⁺的促进,在20～40℃表现出优异的热稳定性,40℃下30 min仍能保持95.6%的活力。因此,马克斯克鲁维酵母β-半乳糖苷酶比乳酸克鲁维酵母的热稳定性更好,具有潜在的工业应用潜力。     

根霉凝乳酶的分离纯化及其酶学特性研究

采用70%乙醇对凝乳酶进行粗提,回收率为52.65%.采用DE-52和Sephadex G-75柱进行纯化,经冷冻干燥成酶粉,其活力1813.74 U/mg,回收率为11.25%.该酶的最适反应pH为5.7,在pH 5～7.5范围酶活力保持稳定;最适反应温度45℃,60℃保持20min,酶完全失活.Ca2+、Fe2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Al3+对该酶的活力有不同程度的促进作用,其中以Al3+和Ca2+的促进作用最显著,Na+和K+对该酶的活力有抑制作用.通过SDS-PAGE测定,该酶的分子质量约35kDa.     

内生黑曲霉产脂肪酶条件研究及其粗酶酶学特性

针对新疆酿酒葡萄中获得的1株产脂肪酶的内生黑曲霉菌株C2J6,研究了该菌株的产酶条件及酶学特性。结果表明,该菌适宜的产酶条件为1%的乳糖为碳源,1%的蛋白胨为氮源,培养基初始pH值为8.0,培养温度35℃,培养时间约72h,此时所产脂肪酶的活力可达18.75U/mL。该菌所产脂肪酶粗酶液的最适反应温度为40℃,最适反应pH值为7.0,为中温中性酶;在50℃保温1h酶活力保留54.55%,具有良好的热稳定性;在pH值3.0~7.0范围内较稳定,有一定的耐酸性。金属离子Mn2+对酶活力有促进作用,Zn2+、Fe2+、Cu2+对酶活力有抑制作用,K+、Ca2+、Na+、Mg2+对酶活力影响不大。该酶在以葵花油和谷物调和油为底物时,酶活分别为228%和180%,明显高于橄榄油和油烟机废油。     

臭曲霉ZU-G1 α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质

为明确臭曲霉ZU-G1分泌的α-半乳糖苷酶的酶学性质,采用硫酸铵沉淀、分子筛层析和阴离子交换层析等方法进行分离纯化.试验结果表明:α-半乳糖苷酶的分子质量136.71 kDa,反应最适pH 5.0,最适温度60℃;在30～40℃环境中热稳定性较好,在pH 6.0环境中酸碱稳定性较好.该酶受Ag+和十二烷基磺酸钠的强烈抑制(抑制率分别为100%和93%)、Cu2+的明显抑制,而Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、棉籽糖、乙二胺四乙酸和巯基乙醇对酶活性影响较小.该酶对pNPG的米氏常数Km=33.48 mmol/L,最大反应速度Vmax=238.09 mmol/(L·min).本试验结果为α-半乳糖苷酶在饲料和食品中的应用提供了一定的理论基础.     

产β-D-半乳糖苷酶马克斯克鲁维酵母的分离鉴定及其产酶特性

从藏灵菇中分离筛选到的一株高产β-D-半乳糖苷酶菌株ZX-5,经ITS DNA序列分析,鉴定为马克斯克鲁维酵母。对产酶培养基的最佳碳源和氮源优化结果为半乳糖2.0%,胰蛋白胨1.0%;产酶优化条件:温度30℃,培养基初始pH 6.5,装液量30%,转速100 r/min,接种量2.0%,发酵36 h。粗酶液酶活力为2.60 U/mL;经硫酸铵分级沉淀和DEAE离子交换层析,获得纯化酶的比活力为157.35 U/mg。酶最适反应温度35℃,最适pH 6.0,在20~40℃和pH 5.0~7.0的范围内酶的稳定性较好;Mn2+对酶的活性有促进作用。利用菌株ZX-5β-D-半乳糖苷酶分解乳糖并合成低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide,GOS),在35℃、乳糖质量浓度60 g/100 mL、酶浓度1.0 U/mL条件下,乳糖水解率达68.34%(50 h),GOS产率达34.70%(40 h),具有潜在的应用前景。     

低温β-半乳糖苷酶分离纯化及酶学性质研究

对来自新疆天山冻土的Rahnella sp.R3所产的胞内低温β-半乳糖苷酶进行纯化,并对其酶学性质进行研究。采用硫酸铵分级沉淀、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析、Q Sepharose High Performance阴离子交换层析、Sephacryl S-200High Resolution凝胶过滤层析,得到电泳纯酶。酶的活性回收率为21.3%,纯化倍数为35.6,比酶活由1.28U/mg提高到45.54U/mg。SDS-PAGE电泳显示其表观分子量为57.3kDa。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度为45℃,在15℃时的酶活为最高酶活的40%,4℃时的酶活为最高酶活的23%。该酶对热敏感,45℃保温45min酶活全部丧失。纯酶的最适pH为7.0,在pH 6.5~7.5时保持稳定。5 mmol/L Na+、Ca2+、Cu2+、Al 3+、Zn2+对酶活力有不同程度的抑制作用,其中Al 3+抑制作用最强,Na+、Ca2+抑制作用不明显。5 mmol/L Mg2+、K+对酶活力具有促进作用,其中Mg2+促进作用较强,使酶活提高到1.19倍。25℃以ONPG为底物的Vmax,Km值分别为7.19mol/(min·mL)、4.64mmol/L。     

壳聚糖固定β-半乳糖苷酶及其应用稳定性研究

以壳聚糖微球为载体,戊二醛为交联剂,固定β-半乳糖苷酶对β-半乳糖苷酶的固定化条件及周定化酶的各种性质进行研究,确定酶固定的最适条件为:用pH6.5的P-E-M缓冲液浸泡10h,25℃壳聚糖微球与0.5%戊二醛交联12h以上,4℃下酶与壳聚塘微球固定12h以上,酶活力回收率可达67%.固定化酶的最适温度为40℃左右,最适pH7.0.通过双倒数法求回归方程,求得酶动力学参数Km值为0.613 mmol/ml.固定化酶稳定性好,可以重复使用.将该固定化酶应用于乳糖分解实验和作为柱层析介质连续分解乳糖,分批反应6批次,乳糖水解率保持在90%以上,连续水解20d,乳糖水解率仍然可保持在75%以上.     

一株产高温β-半乳糖苷酶低温菌株及其酶学性质研究

从101株低温菌中发现了1株产高温β-半乳糖苷酶菌株G2005,依据形态特征与生理生化反应特性,参照《常见细菌鉴定手册》将其鉴定为乳球菌Lactococcus sp.。该菌株高温β-半乳糖苷酶的最适pH值为6.5,最适作用温度为50℃,65℃相对酶活为总酶活的19%,在30~60℃范围内,具有较好的稳定性。不同金属离子对β-半乳糖苷酶活性的影响为:Mg2+>Na+>K+>Fe2+>Ca2+>Zn2+>Mn2+>Hg2+>Cu2+。Mg2+增强酶活,而Hg2+、Cu2+、Mn2+抑制酶活。经测定该酶Km值为96.8 mmol/L,具高温酶特性。该菌株的最适产酶条件分别为30℃培养48h~60h,培养基初始pH 6.5,培养基乳糖浓度为2%。     

高产β-半乳糖苷酶植物乳杆菌的筛选及其酶学性质研究

β-半乳糖苷酶不仅能通过分解乳制品中乳糖解决乳糖不耐症问题,同时能通过转糖苷作用合成具有益生功能的低聚半乳糖。从8株植物乳杆菌中筛选出高产β-半乳糖苷酶菌株K2,比活力高达6620 U/g,并对β-半乳糖苷酶酶学性质进行研究。结果表明:β-半乳糖苷酶最适和最稳定的pH值为6.5,最适温度为60℃,而在40℃稳定性最强。Mg2+对β-半乳糖苷酶活力有明显促进作用,而Cu2+有强烈抑制作用,通过推导求得米氏常数Km,oNPG=1.15 mmol/L,最大反应速率Vmax,oNP=6.34μmol/(min.mg)。研究结果为具有解决乳糖不耐受症的植物乳杆菌微生态制剂的开发奠定了基础。     

中性植酸酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质

从土壤中分离到一株高产中性植酸酶的菌株,酶活力达12.52U/mL。对其进行形态、生理、生化、分子生物学鉴定,初步鉴定为放射型根瘤杆菌(Agrobacterium radiobacter)。酶学性质研究结果表明：该酶的最适反应温度为45℃;最适反应pH 值为7.0;65℃处理60min 酶活力保持80% 左右,有一定耐热性;在pH5.5～8.0 之间,稳定性较好;Ba2+ 对酶活力有一定的激活作用,Fe2+、Mg2+、Zn2+ 和Cu2+ 对酶活力均有一定程度的抑制作用,其中Fe2+ 的抑制作用最强。     

一株嗜热菌木糖异构酶的纯化与性质研究

研究了1株嗜热菌(Anoxybacillus flavithermus)所产木糖异构酶的分离纯化以及酶学性质。结果表明,经硫酸铵沉淀、Sephadex G-75凝胶过滤、纤维素DE-52弱阴离子交换柱和Q Sepharose Fast Flow强阴离子交换层析得到的木糖异构酶,分子量约为181 ku,由4个相同分子量的亚基组成。酶反应的最适温度为80℃,最适为pH为7.0且最适pH范围宽泛,pH6.0~11.0酶反应活性能保持80%左右。该酶热稳定性及耐碱性能良好,70℃保温1 h后酶活仍能保持近80%左右;pH5.0~8.0保温1 h后酶活仍能保持近80%以上,甚至pH12.0保温1 h后酶活性仍能保持40%左右。Mn2+和Co2+对酶活性有明显促进作用,Zn2+、Cu2+以及Al3+对酶活性有一定程度的抑制。     

一株阿里地区产纤维素酶菌株的筛选与鉴定

从西藏阿里地区冈仁波齐山脉附近筛选得到了一株产纤维素酶的细菌G1,经形态观察与16S rDNA的序列分析鉴定其为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。该菌株在30 ℃、pH 7的初始条件下培养76 h后产酶量达到最高,酶活力为0.3 U/mL。酶学性质研究表明,B. licheniformis G1所产纤维素酶的分子质量约为65 ku,其最适反应温度为55 ℃,在30～60 ℃范围内保持50%以上的活力;其最适反应pH为6.0,在pH 5.0～6.0范围内保持95%左右的酶活力;此外,Mn2+对其纤维素酶活力有明显的促进作用,而Cu2+、Mg2+、乙二胺四乙酸（EDTA）对该酶活有较强的抑制作用。     

低温果胶酶的纯化及酶学性质的研究

进行了低温果胶酶产生菌的筛选,并对低温果胶酶的酶学性质、纯化及动力学常数进行了研究。结果表明:该酶最适酶反应温度25℃,最适酶反应pH为5.8;酶液的pH稳定范围在5～6.4;在25℃保温3h,酶活降至50.5%,在35℃保温2h,酶活降至55.1%,在45℃保温1.5h,酶活降至48.7%,在55℃保温1h,酶活降至43.1%;金属离子Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Na+对低温果胶酶有激活作用,而Ba2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+对低温果胶酶有强烈的抑制作用;当以果胶为底物时,该酶的动力学常数Km为27.86mg/mL,Vmax为152.13μmol/(min·mL);采用不同的处理方法均可使低温果胶酶得到纯化,但40%～85%的硫酸铵分级沉淀纯化效果最好。     

绿色木霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

针对绿色木霉AS3.3711产生的β-葡萄糖苷酶组分,先后运用包括乙酸铵沉淀、透析、Sephadex G-150葡聚糖凝胶柱层析在内的一系列分离纯化技术对该纤维素酶进行纯化,得到β-葡萄糖苷酶纯化组分,并对该酶的酶学性质进行研究。纯化后酶液的蛋白质量浓度为8.12 mg/mL、酶活力为4.08 U/mL,纯化倍数达到18.48,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）测定分子质量为66.0 kD。绿色木霉β-葡萄糖苷酶在酸性条件下稳定性良好,最适pH值为5.0;在温度60～70 ℃能长时间保持较高酶活力,最适反应温度为60 ℃。金属离子中,Ca2+、Mg2+、K+对绿色木霉AS3.3711 β-葡萄糖苷酶活力起到促进作用,Ca2+促进作用最强;而Zn2+、Fe3+对该酶有抑制作用,Ag+、Cu2+、Hg2+重金属离子使β-葡萄糖苷酶几乎丧失了全部活性。     

海洋细菌Pseudoalteromonas flavipulchra HH407低温碱性蛋白酶的发酵条件和酶学性质研究

对一株分离自连云港海域的海洋细菌(Pseudoalteromonas flavipulchra HH407)菌株产蛋白酶的条件及酶学性质进行研究。结果表明,在发酵温度为20℃、培养基pH 值为8.0、NaCl 质量浓度为20g/L、接种量2.5% 和装液量20% 时产酶较高。甘露醇、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、鱼粉和酵母粉有利于蛋白酶的产生。该酶的最适作用温度为35℃,0℃时相对酶活力达21.7%。45℃条件下保温60min 后酶活力仍能保持80% 以上。酶的最适作用pH 值为10.0,pH 值为7.0～11.0 范围为时,酶活力相对比较高。酶在pH8.0～11.0 范围内稳定,最稳定的pH 值为10.0,属于低温碱性蛋白酶,Mn2+、Cu2+、Ca2+ 对其具有较强的激活作用,Hg2+ 较强地抑制其酶活力。苯甲基磺酰氟(PMSF)能完全抑制该蛋白酶,EDTA 无影响表明该酶属于丝氨酸蛋白酶。     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶的分离纯化及酶学性质研究

研究采用DEAE-Sepharose F.F离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析对嗜酸乳杆菌发酵液中的亚油酸异构酶进行了分离纯化,酶回收率为6.39,纯化倍数为37.9倍。经研究确定酶最适pH为6.0,最适反应温度为30℃。在pH 6~8之间,亚油酸异构酶可保持较高活力,超出此范围,酶活力明显下降;该酶对高温敏感,50℃保温2 h,酶活力即变得很低;亚油酸异构酶受底物LA的抑制,酶反应最适LA浓度为1.5×10-5g/mL,过高LA则对酶产生抑制作用。     

产淀粉酶非酿酒酵母菌的筛选及产酶特性研究

通过对非酿酒酵母菌的筛选鉴定,共得到11株产淀粉酶菌株,酶学性质研究表明,该11株酵母菌在pH值为7~9时表现了较高的酶活力,在pH值为5~6时保持稳定;最适反应温度为40℃,在30~50℃时保持较高酶活力;金属离子依赖性发现,Fe2+、Mg2+对酶有不同程度的激活作用,Ca2+、Ba2+、Cu2+对酶有抑制作用;十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)对酶均有抑制作用,EDTA抑制酶活约为50%,淀粉酶对二价金属离子具有一定的依赖作用。     

发酵豆酱中蛋白酶高产细菌的筛选及所产蛋白酶的酶学特性研究

从发酵豆酱中分离出四种产蛋白酶细菌,采用Folin-phenol法测定其蛋白酶活力,筛选出产酶活力最强的菌株,并进行酶学特性的研究。结果表明:该酶的最适反应温度为55℃;最适作用pH为8.5;该酶具有较好的稳定性;在pH6.0～8.5条件下稳定;NH+4对该蛋白酶有明显的激活作用,Pb2+、Fe3+则对其表现出强烈的抑制作用;在55℃、pH8.0条件下,该酶解反应的表观米氏常数为0.056%。     

鸭肝谷氨酸脱氢酶的纯化与酶学性质研究

目的：获得鸭肝谷氨酸脱氢酶纯品并对其酶学性质进行研究。方法：采用丙酮脱脂、重金属离子沉淀、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose 离子交换层析和Sephacryl S-200 凝胶层析方法,分离纯化鸭肝谷氨酸脱氢酶,用SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度鉴定和酶相对分子质量测定。结果：从鸭肝中分离纯化获得电泳纯的谷氨酸脱氢酶,纯化倍数为60.93 倍,酶活力回收率为11.02%,比活力达24.37U/mg。酶相对分子质量为371.41,亚基相对分子质量为61.60。推测该酶由6 个相同亚基构成。该酶对NADH 的Km 为53.19μmol/L,最适pH 值为10.0,最适反应温度为35℃。该酶在pH8.0 左右较稳定;在40℃以下酶活力保持稳定。Zn2+、Li+ 和Cu2+ 对该酶具有显著的抑制作用。结论：分离纯化获得谷氨酸脱氢酶,该酶具有较高应用价值。     

一株嗜酸乳杆菌突变株亚油酸异构酶的纯化及性质

亚油酸异构酶可以把亚油酸转化为共轭亚油酸。用硫酸铵沉淀、透析、凝胶过滤等步骤 ,从 1株嗜酸乳杆菌突变株中分离纯化了该酶。纯化倍数为 5 2 .0倍、比活力达 5 1 3 .0U/mg、活力回收 7.0 %。用SDS PAGE测得该酶亚基的分子量为 40 .7ku ;该酶的最适反应pH值为 4.0左右 ,最适反应温度为 3 0～ 40℃ ,在 pH 2 .0～ 7.0和 60℃以下较稳定。Fe2 + 、Mg2 + 、Zn2 + 、Na+ 能提高酶活性 ,Hg2 + 、Cu2 + 、Mn2 + 、Fe3+ 能抑制酶活性。以亚油酸为底物时该酶的动力学常数为 2 1 .6mmol/L。