鲨鱼皮明胶水解肽的制备、分离纯化与抗氧化活性研究

目的:基于鲨鱼皮明胶水解肽的抗氧化活性,制备、分离纯化高活性的抗氧化多肽。方法:分别使用5种商业蛋白酶水解鲨鱼皮明胶,测定其水解产物的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除活性以及对Fe2+诱导卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸过氧化反应的抑制作用;利用SP-Sephadex C-25阳离子交换色谱、Sephadex G-50凝胶过滤色谱和C18反向高效液相色谱(HPLC)对酸性蛋白酶的水解产物进行分离纯化。结果:酸性蛋白酶水解产物具有最佳的抗氧化活性;利用SP-Sephadex C-25、Sephadex G-50和C18-HPLC对酸性蛋白酶的水解产物进行分离纯化,所得洗脱组分E2具有最强的清除DPPH自由基活性。经过ESI质谱分析,其多肽组分的主要分子质量为1356u。结论:本研究制备并分离纯化得到高活性的抗氧化多肽,为将来的生产应用提供理论依据。     

三斑海马蛋白ACE抑制肽的制备及其二级结构的研究

以三斑海马为原料,经碱性蛋白酶酶解,获得富含血管紧张素转化酶(angiotensin I-converting enzyme,ACE)抑制肽的酶解液。酶解液经透析、Sephadex G-25凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱得到进一步分离纯化。结果表明,透析产物的IC50值为(0.44±0.26)mg/mL,相比酶解液(0.81±0.12)mg/mL,其ACE抑制活性更强。透析产物经Sephadex G-25凝胶柱分离纯化后,得到3种组分,其中组分F2的ACE抑制活性最强,IC50值为(0.11±0.08)mg/mL。F2经反相高效液相色谱进一步分离后,得到6个具有ACE抑制活性的组分峰,其中组分F2-4的ACE抑制活性最强,IC50值为(0.005 7±0.000 9)mg/mL。经过3步分离纯化后,成功从三斑海马蛋白中分离得到一种活性较强ACE抑制肽:ProAla-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala(PAGPRGPA),多肽分子量为721.39 Da。圆二色谱分析多肽二级结构表明其主要含无规则卷曲。因此,从三斑海马蛋白中分离得到的多肽可能成为营养保健品和抗高血压药品及相关疾病的一种有益成分,且对海马蛋白资源的开发利用具有重要意义。     

花生分离蛋白水解物中血管紧张素转化酶抑制肽的分离纯化与结构鉴定

利用碱性蛋白酶Alcalase对花生分离蛋白进行水解,制备花生分离蛋白水解物,并测定不同水解时间所得产物对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制作用。未水解的花生分离蛋白没有ACE抑制活性,而利用碱性蛋白酶Alcalase水解所得的水解物具有很强的ACE抑制活性,水解30 min时水解物活性最高,其半抑制浓度为(IC50)0.56 mg/mL。通过超滤、Sephadex G-15凝胶过滤层析、反相高效液相色谱(RP-HPLC)、基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)和氨基酸组成分析等分析手段从水解30 min所得的水解物中分离鉴定出两种新的ACE抑制肽,氨基酸序列为Gln-Gly-Gly-Ser-Gly-Met-Thr-Leu-Ala-Phe-Pro-Leu-Pro-Lys和Lys-Ile-Phe-Leu-Arg-Leu-Ser,其IC50值分别为10.6μmol/L和36.6μmol/L。     

蚕豆蛋白酶解物分离纯化及降胆固醇活性

采用凝胶过滤色谱对经过大孔吸附树脂纯化的蚕豆蛋白酶解物进行分离纯化,以期得到高降胆固醇活性的酶解物组分。结果表明:单因素试验得到蚕豆蛋白酶解物凝胶过滤色谱最佳分离纯化工艺条件为Sep G-10、G-25葡聚糖凝胶为柱填充材料,10 mg/m L的酶解液上样量4 m L,洗脱剂为去离子水,洗脱流速1 m L/min。凝胶过滤色谱分离纯化后得到F1~F6 6个蚕豆蛋白酶解物组分;与10 mg/m L考来烯胺散阳性对照比较,F3、F6组分对3种胆酸盐(胆酸钠、甘氨胆钠酸、牛磺胆酸钠)抑制率均高于阳性对照,其中F6组分的相对抑制率最高,分别为(274.98±0.19)%、(140.22±0.20)%、(130.99±0.22)%。     

诺邓火腿抗氧化肽的分离纯化与鉴定

提取诺邓火腿抗氧化肽,经过Sephadex G-25凝胶色谱进行分离纯化,对各组分进行体外抗氧化试验(清除·OH、清除DPPH自由基、螯合Fe~(2+))研究抗氧化活性;将抗氧化活性最强的组分经葡聚糖凝胶G-15(Sephadex G-15)凝胶色谱再次分离纯化,最后对抗氧化活性最强的组分通过基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)对抗氧化肽进行测序鉴定。试验结果:诺邓火腿抗氧化肽经Sephadex G-25凝胶色谱进行分离纯化后得到4个组分(A、B、C和D),其中组分C的抗氧化活性最强,质量浓度为1 mg/mL时,·OH清除率、DPPH自由基清除率和Fe~(2+)螯合率分别达到50.01%、48.32%和34.37%,与其他组分(A、B和D)相比,差异极显著(p0.01);组分C经Sephadex G-15凝胶色谱分离纯化的5个组分(C_1、C_2、C_3、C_4和C_5),其中C_3组分抗氧化活性最强,质量浓度为1 mg/m L时,·OH清除率、DPPH自由基清除率和螯合Fe~(2+)分别达到73.01%、51.21%和65.23%,与其他组分(C_1、C_2、C_4和C_5)相比,差异极显著(p0.01);通过MALDI-TOF-MS对C_3组分抗氧化肽进行测序鉴定,得到抗氧化肽序列。     

波纹巴非蛤ACE抑制肽的分离纯化

将波纹巴菲蛤酶解液经过凝胶层析柱(Sephadex G-15)分离收集到4个活性成分,活性最强的ACE抑制率达84.18%(0.5 mg/mL)。将组分4经过离子交换层析柱(SP Sephadex C-25)分离,并收集的高活性成分在可溶性蛋白为0.132 mg/mL ACE抑制率达到46.03%。最后将先后经过凝胶层析柱和离子交换层析柱收集到的ACE抑制率较高的组分通过反向高效液相色谱分析,出现2个洗脱峰,表明分离纯化效果良好。     

鱿鱼肝脏蛋白中α-葡萄糖苷酶抑制肽的研究

通过酶解技术和凝胶过滤分离等技术对鱿鱼肝脏蛋白水解液中活性肽进行研究,为鱿鱼副产物的高效利用奠定了理论基础。实验得出:6种蛋白酶(酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶)中,胃蛋白酶为鱿鱼肝脏蛋白水解的最佳酶类,同时以水解度和α-葡萄糖苷酶(AG)抑制活性为指标,得出胃蛋白酶水解的最佳条件:底物浓度0.4%,酶与底物的质量比3.0%,体系p H3.0,温度37℃,反应时间12 h。经过上述条件处理后的水解液用Sephadex LH-20凝胶层析柱进行分离,得到6个组分,其中组分Ⅲ的AG抑制活性最高,其半抑制浓度(IC50)达到0.215 mg/m L。同时对组分Ⅲ的稳定性和抑制动力学进行研究,得出组分Ⅲ对酸碱、热及消化道酶系统具有较高的稳定性。对AG为典型的非竞争性抑制,其米氏常数为50 mmol/L。     

凝胶过滤色谱分离大豆抗氧化肽活性的研究

利用木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白制备大豆肽的水解液,水解液经Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分子量分级,根据分离图谱确定柱层析的最佳条件。在最佳条件下绘制标准曲线,并根据标准曲线判断分离组分的分子量分布。采用铁离子还原/抗氧化能力测定法(FRAP)、二苯基苦基苯肼法(DPPH)以及金属铜离子螯合能力测定法研究不同分子量大豆肽的抗氧化能力,并对抗氧化活性最佳的肽段进行进一步的HPLC分离和氨基酸组成分析。     

小麦谷朊蛋白ACE抑制肽分离纯化研究

为了探讨和研究小麦谷朊蛋白ACE抑制肽分离提纯方法、技术参数及分离效果,首先采用超滤、纳滤膜技术将谷朊蛋白水解液按照相对分子质量的不同进行分离纯化,采用高效液相色谱法和SHR大鼠实验检ACE抑制抑制效果,并对高抑制活性的组分采用凝胶排阻色谱(Sephadex G-25)进一步分离纯化。结果显示膜过滤和凝胶排阻色谱(Sephadex G-25)能够有效分离和纯化谷朊蛋白抑制肽,IC50由0.125mg/mL降低到0.106mg/mL。一次性灌胃SHR大鼠一星期后动脉血压降低(8.86±2.23)mmHg,证明谷朊蛋白抑制肽经过分离纯化后具有良好的降血压效果。     

螺旋藻水解肽的制备及其抗肿瘤活性研究

以螺旋藻为原料,在反复冻融、均质和超声联用的基础上,比较了盐提和水提两种不同方式的蛋白提取率,并以水提螺旋藻蛋白为原料,利用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶分别进行单酶解、双酶解以及体外模拟胃肠道消化的三酶解,得到6种酶解肽。水解度及脱色前后的抗肿瘤活性鉴定结果表明,水解度与抗肿瘤活性无直接相关性,而脱色会降低酶解组分的抗肿瘤活性。对5种活性显著的酶解肽进行超滤,得到9个对乳腺癌和肝癌细胞株的体外生长均有显著抑制作用的组分,并对其中的碱性蛋白酶0~3 K组分进行Sephadex G-15分离纯化,得到对MCF-7和Hep G-2均有较强抑制作用的组分A3,其IC50值分别为64.59μg/m L和61.65μg/m L;得到对Hep G-2具有较强选择性抑制作用的组分A1,A4和A5,其IC50值分别为47.67μg/m L、79.44μg/m L和69.54μg/m L。本研究成果对以螺旋藻为原料的药品和保健食品的开发提供了理论基础。     

坛紫菜降血压活性肽的分离纯化及分子质量测定

用AS.1398 中性蛋白酶酶解制备坛紫菜(Porphyra haitanesis)ACE 抑制肽,并经超滤膜、Sephadex G-15 凝胶层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化,纯化产物测定其氨基酸组成,并运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定分子质量。结果显示：坛紫菜酶解液经超滤分离获得分子质量小于2000D 的组分ACE 抑制活性最高,IC50 为0.73mg/mL;该组分进行Sephadex G-15 凝胶层析分离得6 个组分,组分E 的IC50 最小,为0.67mg/mL。组分E 经RP-HPLC 分离得峰6 对ACE 的抑制率最高,达到89.54%;峰6 再次过RP-HPLC,又洗出2 个蛋白峰,说明峰6 并不是单一物质,还需进行多次反复纯化。测定峰6 的氨基酸组成主要含有Tyr、Val 和Phe,同时采用MALDI-TOF-MS 分析发现有8 个主要的质子峰,信号最强的质子峰为m/z 861.17,有4 个峰聚集在m/z 860 左右,说明峰6 平均分子质量大约为860D,推算出紫菜降血压肽含有3 个Val、2 个Phe、1 个Tyr,N 端为Val,可能的排序顺序有18 种。     

油菜蜂花粉ACE抑制活性酶解物的制备及分离

采用4 种蛋白酶水解油菜蜂花粉蛋白制备ACE 抑制活性物质,高效液相色谱法测定油菜蜂花粉蛋白水解物对ACE 的抑制率。结果表明：油菜蜂花粉蛋白酶水解物具有ACE 抑制活性,水解物对ACE 的抑制活性差异显著(P ＜ 0.05),其中碱性蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞酸性蛋白酶,碱性蛋白酶水解物的IC50 为0.35mg/mL。4 种蛋白酶水解物经Bio P-2 凝胶分离后,ACE 抑制活性较强的组分主要集中在保留时间70～120min,在此区间碱性蛋白酶水解物分离组分对ACE 的抑制率达到90% 以上,分子质量在376.4～1355D 之间。     

明胶抗氧化肽的分离、纯化及其清除羟自由基活性的研究

为制备具有抗氧化活性的明胶肽,本实验采用不同的酶水解明胶,并对酶解产物采用超滤技术分离,利用分光光度法检测超滤后所得多肽组分对羟基自由基(·OH)的清除能力;进一步对抗氧化活性较强的组分利用葡聚糖Sephadex C-25阳离子交换色谱、Sephadex G-50凝胶过滤色谱和C18反向高效液相色谱进行分离、纯化,并对其各组分清除·OH活性进行了研究,最后对所得洗脱组分中具有最强清除自由基活性的多肽组分的分析氨基酸组成,结果显示:组分中甘氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸含量较高的肽具有较好的抗氧化活性,·OH清除率达到55.37%。     

鱿鱼肝脏蛋白水解液及ACE 抑制肽的制备

为高效利用鱿鱼及其下脚料肝脏蛋白水解物,采用酶解技术和凝胶过滤分离等技术对鱿鱼肝脏蛋白水解液中抑制肽进行研究。结果表明：胃蛋白酶为鱿鱼肝脏蛋白水解的最佳酶类,同时以水解度和ACE 抑制活性为指标,得出胃蛋白酶水解的最佳条件：在36℃条件下酶解22h,酶与底物的质量比2%,底物质量分数2.5%。经过上述条件处理的水解液再经超滤处理(截留分子质量为20kD)后,用Sephadex G-50 进行分离,洗脱得到5 个峰,其中组分B 的ACE 抑制活性最高,其半抑制浓度(IC50)达到1.80mg/mL。     

小红豆抗菌蛋白的分离纯化及其功能活性

研究旨在从小红豆中分离纯化得到一种具有抗菌活性的蛋白,对其部分生物活性进行表征和研究。通过缓冲液抽提(NaAc-HAc,20 mmol/L,pH5.4)、硫酸铵分级沉降、Affi-gel blue gel亲和色谱、Sephadex SP C-25离子交换色谱及Sephadex G-50凝胶过滤色谱进行分离纯化,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析鉴定其相对分子质量,并对其抗真菌活性进行表征。结果表明,从小红豆中分离纯化出的一种抗菌蛋白,经SDS-PAGE鉴定达到电泳纯,且其相对分子质量约为4 kDa,通过纯化的抗菌蛋白对来自茄子、甜瓜及苦瓜的尖孢镰刀菌的抑制实验,证明此抗菌蛋白具有较强的抗真菌活性。从小红豆中分离纯化出的一种分子质量约为4 kDa的抗菌蛋白,其对真菌具有抑制作用,且其抑制率对浓度的依赖性较高。     

洋葱多肽的凝胶色谱分离及体外降糖活性研究

目的:建立洋葱多肽凝胶过滤色谱分离条件,构建体外降糖评价体系,评价洋葱多肽体外降糖活性。方法:通过正交实验确定洋葱多肽粗提物的凝胶色谱分离方法;以α-葡萄糖苷酶抑制率和α-淀粉酶抑制率为指标,比较洋葱多肽各组分的体外降糖活性。结果:洋葱多肽凝胶色谱最佳分离条件为0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH6.0,含0.05 mol/L NaCl)为洗脱液,进样浓度为8.0 mg/m L,收集P1~P4 4个组分。相同浓度下P1组分的α-葡萄糖苷酶抑制率和α-淀粉酶抑制率均明显高于其他组分,分别达到53.8%和92.6%。结论:利用凝胶过滤色谱可将洋葱多肽粗提物分离为4个组分,其中分子量较大的P1组分显示了较高的体外降糖活性。     

酶法制备牦牛乳酪蛋白源血管紧张素转换酶抑制肽

应用6种商业蛋白酶水解牦牛乳酪蛋白,研究其水解产物的血管紧张素转换酶抑制活性,结合蛋白水解度及蛋白回收率的结果,蛋白酶C适用于制备牦牛乳酪蛋白源血管紧张素转换酶抑制肽。     

碱性蛋白酶酶解魔芋飞粉制备抗氧化多肽

为优化碱性蛋白酶酶解魔芋飞粉蛋白制备抗氧化多肽的条件,采用响应面分析法,以·OH清除率为响应值,研究酶解温度、酶用量、酶解p H值对制备抗氧化肽的影响。此外,还研究了不同分子质量魔芋多肽的抗氧化活性,结果表明:最佳酶解工艺参数:底物质量分数2.25%、温度55℃、酶用量3 228 U/g底物、p H 7.84、水解时间270 min。该条件下抗氧化多肽(18.35 mg/m L)的·OH清除率为73.41%,多肽得率为75.37%。通过Sephadex G-25和Sephadex G-15串联柱分离得到5个多肽组分,其中分子质量为1 500 u和1 000 u的组分抗氧化活性较高,其清除DPPH·的IC50分别为2.82 mg/m L和3.65 mg/m L;清除·OH的IC50分别为9.03mg/m L和14.16 mg/m L;抑制大鼠肝脏自发性脂质过氧化的IC50分别为0.21 mg/m L和0.66 mg/m L;抑制大鼠红细胞H2O2诱导氧化溶血的IC50分别为0.11 mg/m L和0.22 mg/m L。     

酶解燕麦蛋白制备ACE抑制肽的研究

本研究以燕麦蛋白为原料,分别选用Alcalase、Neutrase 和Protamex 进行单独或联合水解,经活性炭YD-303脱色、大孔吸附树脂DA-201C Ⅱ脱盐及分级纯化、Sephadex G-25 凝胶色谱柱进一步分离,以获得高纯度、高活性的血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽。结果表明：单酶反应时,Alcalase 水解2h所获得的产物对ACE 的抑制率可达85.40%;YD-303 处理燕麦蛋白酶解液脱色最优工艺为添加量1.5%(W/V)、pH3.5、温度40℃、脱色时间75min。利用75% 乙醇洗脱大孔吸附树脂DA-201C Ⅱ所获得的组分ACE 抑制活性最高,其经Sephadex G-25 进一步分离纯化,得到四个分离组分,第四组分的ACE 抑制活性最高,抑制率为95.6%。     

牛乳酪蛋白抗氧化乳基料的制备及其分离纯化

为制备具有低过敏性和抗氧化作用的牛乳酪蛋白活性肽乳基料,以水解度和·OH清除率为指标,先后采用大孔吸附树脂和凝胶过滤色谱分离、纯化酪蛋白酶解物。结果表明：胰蛋白酶和中性蛋白酶组合酶解牛乳蛋白6h,其产物具有较高的水解度(36.80%)和较好的抗氧化活性,·OH清除率的半抑制浓度(IC50)值为3.12mg/mL;酶解物通过LS106大孔吸附树脂分离、纯化后,体积分数为75%的乙醇洗脱液具有较高的抗氧化活性,其·OH清除率的IC50值为0.14mg/mL;体积分数75%的乙醇洗脱组分经凝胶过滤色谱分离、纯化后,得到4个不同相对分子质量肽段,其中抗氧化活性较强肽段的相对分子质量为355.38～854.89,其·OH清除率的IC50值为0.09219mg/mL,与酶解物相比其抗氧化活性扩大33.84倍;相对分子质量小于3238.05的多肽占纯化后多肽总量的60.32%,30.09%多肽是由2～8个氨基酸组成的寡肽。牛乳酪蛋白经复合酶酶解后其抗氧化活性明显提高,过敏性明显降低,喷雾干燥后可以直接制备乳基料。