添加扩增内标的PCR方法快速检测食品中的阪崎克罗诺杆菌

为了解决常规PCR方法检测阪崎克罗诺杆菌时因检测过程中环境和食品理化因素的影响而导致的假阴性结果的产生,本研究以细菌16S rRNA基因为扩增内标对照,以阪崎克罗诺杆菌特异性基因grx B为靶基因设计了一对特异性引物,并通过优化PCR反应条件,最终建立了一种添加扩增内标的阪崎克罗诺杆菌PCR检测方法,可以指示PCR过程中因存在DNA聚合酶抑制剂而导致的假阴性结果。通过对20种细菌进行PCR检测显示,该方法对阪崎克罗诺杆菌具有良好的特异性。灵敏度实验结果表明,该检测方法对阪崎克罗诺菌纯DNA模板的检测灵敏度为2.15×102fg/μL,对阪崎克罗诺杆菌纯培养物的检测灵敏度为9.4×103CFU/m L。对人工污染婴幼儿奶粉的检测结果显示,阪崎克罗诺杆菌接种量为0.94 CFU/g的婴幼儿奶粉样品经过8 h增菌培养后,即可检出。食品样品检测结果表明,不添加扩增内标的PCR检测方法中出现的假阴性结果可被本方法检出。该检测方法特异性强、灵敏度较高,能消除阪崎克罗诺杆菌常规PCR检测方法中可能出现的假阴性结果,适用于婴幼儿配方乳粉、乳制品等食品中阪崎克罗诺杆菌的快速检测。     

添加扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法的建立与应用

以单增李斯特菌inl A基因为靶基因,设计一对特异性引物,以16S rRNA为扩增内标对照,建立了一种含有扩增内标的单增李斯特菌PCR检测方法。优化了PCR反应体系,并对PCR检测方法的特异性、灵敏度、人工污染样品及食品样品检测效果进行了测试。对2株单增李斯特菌、1株英诺克李斯特菌以及19株非李斯特菌菌株进行PCR检测,结果显示,只有2株单增李斯特菌能被检出大小为826 bp的特异性片段,其余20株细菌只能检出1 500 bp的扩增内标片段。灵敏度实验结果显示,基因组DNA和纯培养物的最低检出限分别为1.80×10~2fg/μL和1.21×10~2CFU/m L。当人工污染牛乳样品中单增李斯特菌在最低接种量为0.48 CFU/m L时,经8 h增菌培养后可被该方法检出。采用该研究建立的检测方法对36种食品样品进行检测,证实了该检测方法可以指示检测过程中出现的假阴性现象。综上所述,该研究建立的PCR检测方法能特异性的检测单增李斯特菌,并可有效排除检测过程中出现的假阴性现象,提高检测的准确性。     

LAMP技术快速检测海产品副溶血弧菌的条件优化

本研究以副溶血弧菌不耐热溶血素tlh为目标基因设计特异性引物,优化反应条件,并对特异性、灵敏度进行了验证。LAMP最佳反应条件为,外内引物浓度比为1∶8,Mg2+反应浓度为4 mmol/L,d NTPs浓度为3.5 mmol/L,温度为65℃,反应时长为1 h,只对副溶血弧菌产生扩增反应,与其余细菌不产生扩增反应,细菌基因组DNA和纯培养物的灵敏度约为5.45×101 fg/μL和140 cfu/m L,对人工污染食品样品进行检测,检出限为2.8×102 cfu/m L。该方法反应时间短、特异性强、灵敏度高。     

SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法快速检测沙门氏菌

为建立检测沙门氏菌的快速、特异、灵敏的荧光定量PCR方法,以沙门氏菌inv A基因为目的基因设计引物,并进行特异性、灵敏度和重复性实验。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测沙门氏菌的方法具有极强的特异性,其中沙门氏菌检出限为86copies/m L,标准曲线的相关系数为0.999,扩增效率为104%,不同浓度质粒重复性扩增实验Ct值的变异系数均3%,符合WHO对中等实验室提出的标准(CV 3%),显示了良好的重复性。结果表明该方法具有快速、简单、灵敏度高、特异性强等优点,可应用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等领域。     

环介导等温扩增技术快速检测肉中沙门氏菌

应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了一种快速、高效、灵敏的肉中沙门氏菌的检测方法。针对沙门氏菌的属特异性基因inv A设计2对引物,对人工污染肉样以及实际肉样分别进行检测。结果表明:所建立的LAMP反应能够特异性的检测沙门氏菌,对沙门氏菌纯菌的检测灵敏度为普通PCR的100倍,可达到9.8×100CFU/m L。LAMP检测人工污染沙门氏菌肉样的检测限为9.8×101CFU/m L。因此,本实验利用LAMP建立的沙门氏菌检测方法具有快速、灵敏、特异、操作简便的特点,具有广泛发展前景。     

基于TaqMan探针双重荧光PCR检测食品中肠道沙门氏菌和肠炎沙门氏菌

建立基于TaqMan探针双重重实时荧光PCR检测肠道沙门氏菌(Salmonella enterica,SP)和肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis,SE)的方法。根据SP的aceA基因(Gen Bank:U43344.1)、肠炎沙门氏菌特异序列SEP(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,在ace A探针的5′端标记FAM和SEP探针的5′端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法。试验结果,58株29种不同血清型肠道沙门氏菌均扩增出ace A基因扩增曲线,SEP特异性地扩增出15株SE,而28种不同血清型沙门氏菌和17株变形杆菌等阴性对照株扩增结果均为阴性。ace A和SEP的双重荧光PCR扩增效率分别为100%和104%,R2分别为0.999和0.998,最低检测浓度分别达到280 cfu/m L和260 cfu/m L。建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31 h完成,是快速检测SP和SE的有效方法,可用于食品中SP和SE的特异性检测。     

三重PCR（聚合酶链式反应）检测鸡肉中常见病原菌的研究

建立鸡肉中常见3种致病菌即小肠耶尔森氏菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的多重PCR(聚合酶链式反应)检测方法。方法:分别选择小肠耶尔森氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7基因组中高特异性的ail基因、inv A基因和ECs3032,设计并筛选具有高特异性的引物用于PCR(聚合酶链式反应)扩增。建立一种此3种致病菌的三重PCR检测方法,并通过人工污染实验对该法进行验证。结果:3对引物能特异地扩增出251、347、469 bp的目的条带;灵敏度:对这3种致病菌的单菌培养物检测灵敏度均为101CFU/m L。同时检测3种菌的灵敏度为103 CFU/m L。结论:该检测方法高效、精确、特异性强、灵敏度高,6 h~8 h内可同时快速检测多种致病菌,节省了大量时间。在实际检测中具有很好的实用价值和开发前景,可在食品检测和临床检验等领域大力推广。     

食品中荧光假单胞菌聚合酶链式反应检测体系的建立和评价

建立用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测食品中荧光假单胞菌的方法。分别针对16～23S rRNA基因间隔区序列、gyrB基因以及通过生物信息学方法发掘到的4个种特异性基因设计6对检测引物,通过初步特异性实验,筛选出一对种特异性最佳的引物。最终建立以gyrB基因为检测靶点的PCR扩增体系,并对体系进行系统评价。结果表明:该方法可特异检测荧光假单胞菌的存在,纯DNA检测灵敏度为14.9fg/μL(2～3拷贝/μL),纯培养物检测灵敏度为2.8×102CFU/mL。豆奶样品经15h充分增菌可提高检测灵敏度至0.28CFU/25g。     

沙门氏菌的依赖于核酸序列恒温扩增检测方法的建立

采用自行建立和优化的依赖于核酸序列恒温扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)检测体系,对沙门氏菌进行检测。采用沙门氏菌的invA基因为目的片段设计特异性引物,建成可快速检测沙门氏菌的NAS-BA检测法,并进行了特异性和灵敏度试验。结果表明:所建立起的NASBA检测方法,灵敏度为7.1×102cfu/ml,高于普通PCR方法。     

沙门氏菌PCR检测方法的建立及其在蔬菜检测中的应用

为了对蔬菜中沙门氏菌进行快速检测,本论文建立了一种检测沙门氏菌的PCR方法。根据沙门氏菌特异基因设计4对引物进行PCR扩增,并通过检测不同浓度沙门氏菌菌悬液的PCR产物、测定OD600nm值与平板菌落数的对应线性关系确定沙门氏菌的检出限。结果筛选出invA基因为稳定的沙门氏菌特异性基因,此PCR技术对沙门氏菌的检出限为1550cfu/mL,对香菜的检出限为63cfu/g。通过此方法检测大连开发区180份市售蔬菜样品,6份检出沙门氏菌,检出率为3.33%,实验结果表明本文建立的沙门氏菌PCR检测方法可用于检测蔬菜中沙门氏菌的污染状况。     

实时荧光PCR法鉴定食品中双歧杆菌

根据双歧杆菌属16S rRNA基因的保守区序设计特异性引物和探针,建立一种鉴定食品中双歧杆菌属的实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。对方法的特异性、灵敏度、重复性和体系抗干扰能力进行验证,最后采用该方法对市售25份标示含双歧杆菌样品进行检测。结果表明:该检测方法可特异性检测双歧杆菌属细菌,对近缘的乳杆菌属、链球菌属及食品中常见菌群包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等均无扩增。双歧杆菌DNA检测绝对灵敏度可达到2 pg,相对灵敏度可达到10~4 CFU/m L。重复性测试表明相对标准偏差小于1%。同时进行了杂菌干扰检测实验,在培养物水平和纯基因组DNA水平上将青春双歧杆菌ATCC15703与大肠杆菌ATCC25922混合进行检测,检出Ct值较纯菌检测时无显著影响,表明建立的荧光PCR方法抗干扰能力良好。对25份市售实际样品进行测试,有5份标识含有“双歧杆菌”的样品未检测出双歧杆菌成分。本研究所建立的实时荧光PCR法能准确、快速检测食品中双歧杆菌属细菌。     

环介导等温扩增方法在食品中沙门菌检测的应用和评价

将环介导等温扩增检测方法应用于食品中沙门菌的检验,并在检测方法特异性、灵敏度等方面与实时荧光PCR和传统检测方法进行比较。方法 针对沙门菌属高度保守的fimY基因设计环介导等温扩增检测引物并优化反应体系,在特异性、灵敏度和实际样品检测等方面与实时荧光PCR及传统检测方法比对。结果 本研究建立的LAMP方法检测沙门菌93株和非目标菌31株,具有良好的特异性。在纯培养、无需增菌情况下,其检测灵敏度为6.4×10²cfu/ml,与实时荧光PCR方法相当。食品基质添加试验中,环介导等温扩增方法检测低限为2cfu/25g样品;对45份实际食品样品检测结果表明,该方法实际样品检出率为11.1%,与实时荧光PCR及传统方法检测结果一致。结论 本研究建立的沙门菌环介导等温扩增检测方法具有良好的特异性,检测灵敏度与实时荧光PCR相当,适用于沙门菌的快速筛选。     

溶藻弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立溶藻弧菌(VA)的快速检测方法,本研究以VA Collagenase基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针,建立了实时荧光定量PCR快速检测VA的方法。结果显示,对15株实验菌株进行荧光定量PCR检测,只有VA菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为18 cfu/m L;稳定性和重复性实验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值的变异系数均小于2%;利用该检测方法对采集的165份样品进行检测,共计检出2份VA阳性样品,与SN/T2564-2010行标法检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。     

环介导等温扩增法快速检测乳中阪崎肠杆菌

利用环介导等温扩增方法的快速、简便等优点,建立一种检测乳中阪崎肠杆菌的方法.以阪崎肠杆菌的OmpA序列为靶基因,设计特异性引物.优化并建立LAMP检测乳中阪崎肠杆菌的方法.结果表明,LAMP检测阪崎肠杆菌纯培养物的灵敏度为3.7×101cfu/mL,其灵敏度是PCR方法的10倍.人工污染阪崎肠杆菌灭菌乳的检测限为4.3×101 cfu/mL.对23株致病菌进行特异性实验,特异性良好.该方法具有特异性强、灵敏度高、设备简便、耗时短等优点,在食品检测中具有良好的应用前景.     

肉制品中蜡样芽胞杆菌实时荧光PCR检测方法的研究

根据蜡样芽胞杆菌肠毒素基因片段序列,用Primer express 3.0设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立蜡样芽胞杆菌实时荧光PCR检测方法。通过对梯度含量的蜡样芽胞杆菌标准菌液样品DNA和多种细菌的DNA进行实时荧光PCR检测,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。实验结果表明,只有蜡样芽胞杆菌产生扩增曲线,其他细菌无扩增,说明引物及TaqMan探针特异性较好,检测灵敏度为1×10~3CFU/m L。该方法具有很好的研究价值和应用前景。     

环介导恒温扩增技术可视化检测携带tdh基因的致病性副溶血性弧菌

建立了环介导恒温扩增技术检测携带tdh基因的致病性副溶血性弧菌。基于副溶血性弧菌高度保守的tdh基因序列,设计了6条特异性引物,两条外引物F3、B3,两条内引物FIP、BIP及两条环引物LF、LB。在Bst DNA Polymerase作用下,60℃恒温水浴进行扩增。对10种细菌共21株菌进行LAMP扩增,所试6株副溶血性弧菌均为阳性,说明引物具有高度特异性。本LAMP方法对纯培养物的灵敏度可达到9.42cfu/m L。对污染食品中副溶血性弧菌的灵敏度为25.3cfu/25g,40~60min内即可完成检测。本方法操作简便、特异性强、灵敏度高,可以为临床提供简单、快速、高灵敏度和高特异性的检测应用。     

采用荧光定量PCR方法快速检测蔬菜中沙门氏菌

为快速检测蔬菜中的沙门氏菌,建立一种荧光定量PCR检测方法。筛选出特异性引物可稳定的扩增沙门氏菌特异性基因inv A。利用循环次数Cq值和菌落数对数的线性关系得出荧光定量PCR方法对沙门氏菌检出最低浓度为18 cfu/m L。利用建立的荧光定量PCR检测方法对大连开发区3个地点采样10种蔬菜共60份样品进行检测,检测结果显示,在60份样品中有5份样品确定存在沙门氏菌,检出率为8.33%。试验证明,荧光定量PCR检测方法具有快速简便和高效特异等优势,并可定量分析,可用于蔬菜中沙门氏菌的快速检测。     

FTA滤膜与多重PCR结合检测肉中3种食源性致病菌

采用FTA滤膜从肉中直接提取模板DNA,根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的IpaB基因、福氏志贺氏菌的ipaH基因设计3对特异性引物,进行多重PCR检测.结果表明,3对引物能特异性扩增出210、280、393bp大小的目的条带;在不增菌的情况下,多重PCR同时检测肉中3种致病菌的灵敏度均为102 cfu/g,检测时间6 h.该检测方法准确、快速、高效,为同时检测肉中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、福氏志贺氏菌奠定了基础.     

多重PCR检测原料乳中沙门氏菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的研究

目的:建立快速检测沙门氏菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR方法。方法:根据沙门氏菌(Salmonella)组氨酸转运操纵子基因、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的STRA-Agl-23-1D基因和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的耐热核酸酶nuc基因分别设计引物,进行PCR扩增及反应条件的优化,建立这3种菌的多重PCR检测方法。结果:通过建立多重PCR方法,3对引物同时特异性地扩增出495 bp、360 bp和279 bp目的片段;3种菌的检测限:沙门氏菌1.9×102 cfu/mL、无乳链球菌2.0×102 cfu/mL、金黄色葡萄球菌2.9×102 cfu/mL;3种菌DNA含量的(最低)检出限分别为3.86、25.5、3.47pg。结论:本文建立的多重PCR检测方法,简单、快速、灵敏度高,具有很好的应用前景。     

食源性肠球菌荧光定量PCR检测方法的建立与评价

利用基因组序列比对分析等生物信息学方法发掘肠球菌新的属特异性靶点,根据42个候选靶点序列设计50对引物,结合普通PCR初筛和荧光定量PCR复筛,挑选特异性和灵敏度等检测性能最佳的引物,建立相应的荧光定量PCR检测方法,并对该方法应用于食品中肠球菌检测时的效果作出评价。分析结果显示,特异性最强的引物为EF1902,利用该引物建立的荧光定量体系检测肠球菌时均产生特异性扩增信号,而检测非肠球菌菌株时均无特异性扩增信号形成。经优化PCR体系后,该方法的基因组DNA检测灵敏度为13.78拷贝/PCR,纯培养物灵敏度为38.4 cfu/PCR。以肠球菌人工污染牛奶,当初始接菌量为2.63 cfu/mL时,只需增菌6 h即可用该方法检出肠球菌。对52份食品样品进行检测准确率为94.23%,证实了该方法可应用于食源性肠球菌的快速检测。综上所述,作者建立的肠球菌荧光定量PCR方法,特异性强且灵敏度高,可应用于食品中肠球菌的快速检测。