铁蓄积对斑马鱼幼鱼骨发育的影响

目的 通过对斑马鱼受精卵进行高铁环境干预，观察铁积蓄对斑马鱼幼鱼骨代谢的影响，探讨铁蓄积对于骨代谢的影响。方法 不同浓度的枸橼酸铁铵（ferric ammonium citrate，FAC）（25、50、100、200 mg/L）干预野生斑马鱼交配，收集鱼卵置于4个含相应FAC浓度的水环境中，每24小时予以更换含同样浓度FAC的水1次，同时设不含FAC为对照组，观察斑马鱼在不同铁环境下生存的情况。于第4天采用实时荧光定量聚合酶链反应（fluorescent quantification-polymerase chain reaction，FQ-PCR）法检测相关成骨代谢的基因表达，比较和对照组基因组的成骨下游基因的差异，并测量幼鱼的铁含量及铁染色，观察铁含量变化；于第9天进行茜素红染色，比较与对照组的硬骨形态差异。结果 不同浓度FAC处理后，斑马鱼骨矿化面积成剂量依赖性降低，其中200 mg/L FAC组与对照组对比T值为40.567（P<0.01）；FQ-PCT结果显示：相关早期表达成骨代谢的基因表达量与对照组斑马鱼成骨基因表达相比显著下调，差异有统计学意义（P<0.05）；铁染色结果显示：FAC组斑马鱼色素沉着变深，与对照组相比，100和200 mg/L两组的幼鱼铁含量升高[（21.5±3.4）μg/L vs.（12.5±3.6）μg/L，（22.8±2.9）μg/L vs.（12.5±3.6）μg/L]，差异有统计学意义（P<0.05）；茜素红染色结果显示：与对照组相比，FAC组硬骨染色变浅且肋骨及尾鳍未发育。结论 高铁环境下造成斑马鱼体内铁蓄积，使斑马鱼成骨基因降低，造成骨发育迟缓，矿化障碍。     

高铁环境对斑马鱼骨形成的影响

目的观察高铁环境对斑马鱼骨形成的影响,探讨铁过载对骨代谢影响的机制。方法以受精后第2天斑马鱼幼鱼为模型,用不同浓度枸橼酸铁铵(FAC)(0、25、50、100、200μg/mL)干预斑马鱼,受精第6天进行茜素红染色并统计骨矿化面积。在200μg/mL FAC干预6 d基础上,停止添加FAC,加入100μmol/L去铁胺(DFO),第10天行茜素红染色,统计斑马鱼椎体个数,并用实时定量PCR方法检测骨钙素(BGP)基因表达变化。结果不同浓度FAC处理后,斑马鱼骨矿化面积成剂量依赖性降低,100及200μg/mL FAC组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);100μmol/L DFO加入200μg/mL FAC干预组后,斑马鱼椎体个数较未加入DFO组增加,但仍低于对照组(P<0.05);加入100μmol/L DFO组骨钙素(BGP)表达量较未加入DFO组上调,差异有统计学意义(P<0.05),但仍低于正常对照组(P<0.05)。结论高铁环境抑制斑马鱼骨形成。     

miR-30a抑制BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2的成骨分化

目的:确认miR-30a在BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:首先用Ad-BMP9处理间充质干细胞C3H10T1/2,通过碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒检测早期成骨指标ALP、Western blot和PCR检测晚期成骨指标OPN,茜素红S染色检测钙盐沉积了解BMP9对C3H10T1/2细胞的成骨分化作用,同时用Real-time PCR检测miR-30a在该成骨分化中的变化。然后用BMP9条件培养基分别作用Ad-mmu-miR-30a和Ad-RFP预处理10h的C3H10T1/2细胞,检测早期成骨指标ALP、晚期成骨指标钙盐沉积和骨钙素OPN的表达。最后探讨miR-30a在BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化中的可能作用机制。结果:Ad-BMP9处理C3H10T1/2细胞5d,7d后,ALP的活性的表达增高;第9d后,OPN的表达增加;第14d后,钙盐的沉积明显增多。而miR-30a过表达后,抑制了这一现象。同时发现过表达miR-30a后,Runx2蛋白水平较对照组下降而mRNA水平基本没有变化。结论:miR-30a可以抑制BMP9诱导C3H10T1/2细胞的成骨分化,其作用机理可能和Runx2相关。     

膜铁转运蛋白1突变斑马鱼骨形态及骨钙素的变化

目的观察膜铁转运蛋白1(ferroportin1,FPN1)突变斑马鱼(铁过载动物模型)骨发育及骨量变化,初步了解铁过载状况对骨代谢的影响。方法分别对受精后36和48h的突变体(weh)和野生型(WT)斑马鱼进行邻联茴香胺血液染色,观察weh及WT血红蛋白量的变化,比较铁过载状况;对受精后第14天的weh和WT进行阿尔辛蓝/茜素红染色,比较骨形态差异;分别提取受精后第5天和第7天的weh和WT总RNA,采用实时定量PCR方法检测骨钙素(BGP)的基因表达,比较骨代谢差异。结果邻联茴香胺血液染色后,与WT相比,weh在受精后36h未能着色,48h后轻微着色;对受精后第14天斑马鱼进行阿尔辛蓝/茜素红染色并与WT比较结果显示,weh茜素红着色较浅且肋骨及尾鳍未发育;与WT相比,受精后第5天和第7天weh骨钙素表达量较低(P<0.05)。结论 FPN1突变斑马鱼体内铁代谢异常,同时骨量减低,骨发育迟缓。     

BMP9经Smad信号通路调控iSCAP成骨/成牙本质分化

目的:研究BMP9是否能够激活i SCAP细胞中的Smad信号通路,以及Smad信号通路在BMP9诱导i SCAP细胞成骨/成牙本质向分化过程中的作用。方法:首先,采用Western印迹实验检测Ad-BMP9转染i SCAP后Smad1/5/8蛋白的磷酸化水平。随后,利用dn ALK1重组腺病毒和BMP9条件培养基作用于i SCAP,Western印迹实验检测Smad1/5/8蛋白磷酸化水平;采用碱性磷酸酶(ALP)活性检测和染色方法分析早期成骨/成牙本质指标变化,茜素红染色法检测钙盐沉积程度;RT-PCR成骨/成牙本质相关基因Runx2、OCN、OPN和DMP1表达的影响。结果:BMP9可上调i SCAP中Smad1/5/8的磷酸化水平;dn ALK1抑制BMP9条件培养基作用后,可抑制Smad1/5/8的磷酸化,i SCAP细胞中早期成骨/成牙本质标志物ALP活性和晚期成骨/成牙本质标志钙盐结节减少,重要成骨转录因子Runx2基因表达减少,成骨/成牙本质相关基因OCN、OPN、DMP1的表达也受到了抑制。结论:Smad信号通路在BMP9诱导i SCAP成骨/成牙本质过程中存在并起着重要作用。     

PI3K/Akt信号通路在骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化调控中的作用

目的研究PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖及分化的影响。方法采用贴壁法体外分离人骨髓间充质干细胞(hMSCs),加入PI3K抑制剂LY294002(1、10μmol/L),应用MTT法测定细胞增殖,常规成骨诱导分化培养3或7 d,采用碱性磷酸酶(ALP)染色观察成骨分化水平,化学比色法测定ALP活性,茜素红染色后观察矿化钙结节数量并定量分析,Western blot检测磷酸化Akt蛋白表达,应用Realtime-PCR检测各组细胞BMP2、Runx2、OPN及Osterix等成骨分化标记物的基因表达水平。结果从24至72 h,LY294002对hMSCs增殖均产生显著抑制,随时间推延,可见抑制增殖效果增强(P<0.05)。ALP染色和定量测定提示10μmol/L的ALP活性最强,在不同时间显著高于对照组和1μmol/L组(P<0.05)。成骨诱导培养3和7 d,1、10μmol/L组矿化量都显著高于对照组(P<0.05)。10μmol/L组矿化量在成骨诱导7 d也显著高于1μmol/L组(P<0.05)。Western blot检测结果证实成骨诱导可激活Akt磷酸化蛋白表达,但LY294002可抑制该蛋白磷酸化。成骨诱导分化7 d,1、10μmol/L均明显促进BMP2、Runx2、OPN、Osterix 4种基因mRNA表达(均P<0.05)。结论 PI3K/Akt信号通路参与hMSCs增殖和分化过程。成骨分化伴随下游Akt蛋白表达。PI3K抑制剂可抑制hMSCs增殖,但同时促进其向成骨分化和矿化。     

Wnt/β-catenin信号通路介导糖基化终未产物对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)对体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增生及成骨分化的影响及可能机制。方法采用全骨髓法分离培养4周龄SD大鼠的BMSCs。将BMSCs随机分为成骨诱导液、BSA组、AGEs3组,Western blot法检测AGEs对BMSCs成骨分化过程中β-catenin、OSX、RUNX2、RAGE (AGE受体)蛋白表达量的影响,茜素红染色观察AGEs对BMSCs成骨分化过程中矿化的影响。抑制RAGE后实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)及Western blot法再次测定上述指标水平。结果 0. 2 g/L AGEs作用于体外培养SD大鼠BMSCs,上调RAGE蛋白表达(0. 88±0. 04),β-catenin、OSX、RUNX2蛋白表达降低(分别为0. 21±0. 02,0. 25±0. 03和0. 21±0. 01,P<0. 05)。RAGE中和抗体阻断RAGE作用后,AGE+RAGE中和抗体组RAGE蛋白表达下调(0. 30±0. 03),β-catenin、OSX、RUNX2蛋白表达增高(0. 90±0. 02,0. 84±0. 03和0. 88±0. 02,P<0. 05)。结论 AGEs通过Wnt/β-catenin信号通路抑制BMSCs成骨分化。     

RUNX2对BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响

目的:研究和确认RUNX2在骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:通过Western blot、RT-PCR、荧光素酶活性分析检测BMP9对RUNX2表达的影响;分别在过表达RUNX2和RNA干扰抑制RUNX2表达的情况下,利用碱性磷酸酶(ALP)活性测定和染色、钙盐沉积实验,免疫细胞化学和裸鼠皮下异位成骨实验分析RUNX2对于BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的影响。结果:BMP9可以促进RUNX2的表达;RUNX2体外可促进BMP9诱导的C3H10T1/2的ALP活性和钙盐沉积,却抑制了OCN表达,RUNX2还可促进BMP9诱导的裸鼠皮下异位成骨;而在降低RUNX2表达后,BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积、OCN表达和裸鼠皮下异位成骨均受到抑制。结论:RUNX2可以促进BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化。     

DLX1对BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响

目的:分析和确认转录因子DLX1在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:首先,BMP9腺病毒感染C3H10T1/2细胞,RT-PCR和Western blot检测DLX1表达变化;随后,利用重组腺病毒技术分别过表达DLX1和RNA干扰(RNA Intenference,RNAi)抑制DLX1的表达,并利用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)染色、钙盐沉积实验(茜素红染色),免疫细胞化学检测骨钙素(osteocalcin,OCN)表达和裸鼠皮下异位成骨实验分析DLX1对于BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化的影响。荧光素酶报告基因实验和Western blot分析DLX1对于BMP9诱导的C3H10T1/2细胞Smad1/5/8信号途径的影响。结果:BMP9可以促进C3H10T1/2细胞中DLX1基因和蛋白表达水平;过表达DLX1在体外可进一步促进BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积以及OCN的表达,过表达DLX1亦可促进BMP9诱导的裸鼠皮下异位成骨;反之,RNAi抑制DLX1表达后,由BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积、OCN表达和裸鼠皮下异位成骨均相应受到抑制。过表达DLX1可进一步增强BMP9诱导的C3H10T1/2细胞中Smad/1/5/8的转录调控活性,RNAi降低DLX1表达则可抑制BMP9诱导Smad/1/5/8的转录调控活性。但是,无论过表达DLX1和RNAi降低DLX1表达均不会对BMP9诱导的Smad/1/5/8磷酸化造成影响。结论:DLX1可以调节BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化,其调节作用可能是通过影响Smad1/5/8信号的转录调控活性而实现的。     

胰岛素在氟诱导成骨作用中的地位

采用实时PCR测试了投氟大鼠的骨组织成骨和胰岛素受体等基因表达情况,采用免疫组化技术观察了胰岛分泌胰岛素情况,以及采用生化方法检测血清中的胰岛素、血糖和血脂等变化,利用体外成骨细胞染氟考察了胰岛素受体在成骨细胞内表达及氟联合胰岛素对骨髓间充质干细胞的成骨作用影响。结果表明:给予低剂量氟3个月后,大鼠骨组织碱性磷酸酶、骨钙素、Runx2(Runt相关转录因子)及胰岛素受体表达显著提高,而高氟组成骨标志基因碱性性磷酸酶、骨钙素、Runx2也明显提高,说明给予大鼠氟3个月能够诱导成骨;给与低剂量氟从1个月到3个月后,大鼠血清的胰岛素浓度明显提高,高氟作用3月后,胰岛素分泌降低,这与高剂量氟给氟3月大鼠胰岛素受体表达明显下降相一致。体外实验中,ρ(F-)=2mg/L和8mg/L氟明显促进了成骨细胞内抗胰岛素受体荧光抗体的强度,而且10μg/mL胰岛素联合ρ(F-)=1mg/L和4mg/L能够刺激成骨细胞活性。氟ρ(F-)=1mg/L和4mg/L刺激了成骨细胞碱性磷酸酶的活性。体内氟中毒大鼠模型实验结果表明,低剂量氟作用3个月刺激成骨作用的同时,伴随着胰岛素分泌增强,并促进成骨细胞内胰岛素受体表达增多,体外实验也表明了胰岛素刺激成骨细胞增生的作用,这些实验数据说明胰岛素参与了低剂量氟诱导成骨作用机制。