杂色鲍组织蛋白酶L的分离纯化与性质研究

通过硫酸铵分级沉淀、SP-Sepharose阳离子交换层析、Sephacryl S-200HR凝胶过滤和Hydroxyapatite羟基磷灰石层析,从杂色鲍（Haliotis diversicolor）内脏中分离纯化了组织蛋白酶L。SDS-PAGE结果显示,纯化蛋白的分子量约为28ku。该酶最适温度37℃,最适pH5.5。当温度低于40℃,pH在5.0～6.5范围内该酶较稳定。底物特异性实验与抑制剂实验结果表明,该酶属于半胱氨酸蛋白酶。金属离子Mn2＋、Ba2＋和Mg2＋对该酶有不同程度的激活作用,而Co2＋、Cu2＋、Zn2＋、Fe2＋和Ca2＋等对该酶起抑制作用。     

鲤鱼组织蛋白酶L的分离纯化与酶学性质研究

对鲤鱼鱼背部白肌中的组织蛋白酶L进行分离纯化并研究了其酶学性质。结果发现,鲤鱼组织蛋白酶L提取液经酸处理、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose F.F.离子交换层析和SephacrylS-100凝胶过滤层析等步骤后得到部分纯化,纯化倍数为16.39。鲤鱼组织蛋白酶L的最适反应温度和pH值分别为40℃和5.0,在20～50℃和pH 4.5～5.5范围内具有较好的稳定性。     

凡纳滨对虾肌肉中组织蛋白酶L提取工艺优化及分离纯化

优化凡纳滨对虾肌肉中组织蛋白酶L提取工艺,分离纯化组织蛋白酶L并验证其对肌原纤维蛋白的降解作用.以凡纳滨对虾肌肉为原料,采用单因素试验、Plackett-Burman试验和双因素等重复试验对肌肉中组织蛋白酶L的提取工艺进行了优化.采用Tris-HCl缓冲液浸提、硫酸铵沉淀、Q-Seharose F.F阴离子交换层析、S...     

鲢鱼组织蛋白酶活性影响因素的研究

对鲢鱼中组织蛋白酶活性影响因素进行了研究,结果表明:组织蛋白酶对热的耐受性较强,温度超过65℃组织蛋白酶活性下降很快,到85℃基本失活;组织蛋白酶活性的最适pH5~7之间;漂洗和加盐擂溃可以有效地降低3种组织蛋白酶的活性,试验证明NaHCO3溶液是较理想的漂洗溶液;添加非肌肉蛋白和E64都可以显著地降低鱼肉中组织蛋白酶的活性。     

鱿鱼肝脏蛋白酶的鉴定及组织蛋白酶L的分离纯化

鱿鱼肝脏含有丰富的蛋白酶,为利用其内源蛋白酶进行可控的酶解,本研究以鲤鱼肌原纤维蛋白为底物对鱿鱼肝脏内源蛋白酶的种类和性质进行了研究。反应体系中添加E-64、1,10-菲啰啉和苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl?fluoride,PMSF)后,肌球蛋白重链(myosin?heavy?chain,MHC)的降解得到了显著抑制,确定了鱿鱼肝脏含有金属类、半胱氨酸类、丝氨酸类3类蛋白酶。半胱氨酸类蛋白酶热稳定性最好,在50℃以上仍然具有较大活性,可将肌原纤维蛋白酶解成小分子质量的降解产物。利用特异性底物对半胱氨酸蛋白酶种类进行鉴定发现,该酶只酶解Z-Phe-Arg-MCA,添加亮抑酶肽后相对酶活性为0%,添加E-64相对酶活性仅存0.6%,初步确定鱿鱼肝脏中的半胱氨酸蛋白酶主要为组织蛋白酶L。最后,通过硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤对组织蛋白酶L进行分离纯化,在电泳上得到了分子质量约为25?kD单一条带。     

腌干鲢鱼组织蛋白酶B、L活力变化的响应面法预测研究

以鲢鱼为原料,进行腌制和热泵干燥加工,研究内源组织蛋白酶B、L活性在加工过程中的变化。选取加工过程对鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)组织蛋白酶B、L活力影响较大的3个工艺参数(温度、pH值、盐质量分数)作为试验因素,并根据酶学特性和干燥过程中各理化指标的测定结果确定其试验水平。采用响应面法考察此3因素对组织蛋白酶B、L活性的影响,并根据回归方程对腊干鲢鱼加工过程中的组织蛋白酶活力进行预测。结果表明：回归方程可用于组织蛋白酶B、L实际活力预测;两种酶的潜在活力在加工过程中均呈下降趋势,加工结束时组织蛋白酶B和L的潜在酶活力分别为初始的43.18%和26.08%;通过回归方程对组织蛋白酶B、L在腌制前、腌制后、干燥2d、干燥5d、干燥7d实际活力进行预测,组织蛋白酶B实际酶活力分别为潜在酶活力的36.7%、39.9%、46.5%、46.5%和53.5%,而组织蛋白酶L则为6.6%、5.6%、10.4%、10%和12.6%。     

牛胰脏组织蛋白酶L的纯化和酶学性质

新鲜牛胰脏匀浆物经酸化粗提后,再通过盐析、柱层析等步骤纯化,制备了0.58 mg纯酶,纯化倍数达530.54。经凝胶电泳分析,该酶有2 个亚基,分子质量为29.1 kD和18.9 kD。牛胰脏组织蛋白酶L的最适反应温度为50 ℃,最适反应pH值为6.5。巯基还原剂二硫苏糖醇、L-半胱氨酸均明显激活了该酶活性,10 μmol/L的N-（反式-环氧丁二酰基）-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺（E-64）可完全抑制其活性。1 mmol/L的Zn2＋对酶活性有明显抑制作用。该纯化酶可水解苄氧羰基-苯丙氨酰-精氨酰-甲基香豆素（Z-Phe-Arg-MCA）,其Km值为3.52 μmol/L。     

生姜蛋白酶的分离纯化

生姜蛋白酶能够特异地水解P2位置是脯氨酸(Pro)的肽和蛋白质,这种对Pro的特异性使生姜蛋白酶成为一种非常有前途的用于蛋白质测序和蛋白质中稳定结构域识别的工具酶。中国传统食品“姜撞奶”采用姜汁作为凝乳剂,其中的凝乳因子已被证明是生姜蛋白酶。生姜蛋白酶的凝乳性质使之有望成为奶酪生产中小牛皱胃酶的替代品。此外,生姜蛋白酶在工业上还有更广阔的应用前景。本研究针对生姜蛋白酶的特点,制订一套简便有效的纯化方案,为进一步的基础研究和应用研究提供合格的样品酶。经过实验确立了以下纯化方案:将生姜制成丙酮粉,然后用20倍(W/V)0.1mol/L,pH8.0的磷酸缓冲液提取;上清液加硫酸铵至40%饱和度,其间控制pH>7.0,离心弃去沉淀,上清液继续加硫酸铵至80%饱和度,离心,取沉淀;将沉淀先对0.1mol/L的氨水透析2h,然后对蒸馏水透析至无SO42-检出,最后对层析初始缓冲液进行延长透析至内外离子强度相等;上DEAE-纤维素DE-52柱;层析初始缓冲液为0.01mol/L,pH8.0Tris(含0.5mmol/LDTT,0.2mol/LNaCl),0.05～1mol/LNaCl梯度洗脱,柱1.55.0cm,流速0.75cm3/min,收集速度3ml/管,收集酶活峰,得到在SDS-PAGE上表现为一条带的样品C1和C2。     

建鲤组织蛋白酶L的克隆表达、纯化及活性特征鉴定

首先采用TA克隆技术克隆建鲤组织蛋白酶L（Cathepsin L,CAT L）成熟肽基因片段并进行双酶切鉴定,进而构建表达载体CAT L-p ET-30a并转入宿主菌E.coli BL21,经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）在37℃诱导2 h表达重组CAT L蛋白。而后经尿素梯度洗涤和镍离子亲和层析纯化目的蛋白,并利用SDS-PAGE检测诱导效果和纯化过程。最后以荧光合成肽底物（Z-Phe-Arg-MCA）测活法鉴定建鲤重组CAT L的热稳定性、p H稳定性,以及鱼糜生产和冻藏中常用添加剂对其活性稳定性的影响。双酶切鉴定结果表明成功克隆了目的基因片段,与鲤鱼CAT L基因序列相似性为99.11%。SDS-PAGE分析表明经诱导、尿素梯度洗涤及亲和层析后,成功获得高度纯化目的蛋白,分子量约28 ku。活性鉴定结果表明重组CAT L在20⁵0℃及p H3.0⁶.5范围内稳定;氯化钠、焦磷酸钠对重组CAT L活性的抑制作用呈现剂量依赖关系,而各浓度蔗糖、山梨醇则对其活性无明显作用。本研究成功克隆、表达和纯化了建鲤CAT L,并阐明了热、p H及鱼糜生产和冻藏中常用添加剂对该酶稳定性的不同影响。      

鲤鱼组织蛋白酶L活性的影响因素研究

主要研究了鲤鱼组织蛋白酶L活性的影响因素。结果表明,鲤鱼组织蛋白酶L具有较强的稳定性,在-20℃冻藏、20⁵0℃加热处理、不同酸性环境中均保留了一定程度的活性;鱼肉中组织蛋白酶L在漂洗工艺中并不能完全去除,漂洗后仍残存了45.65%活性。此外,鲤鱼组织蛋白酶L在豆科类蛋白、大米蛋白、鸡蛋清蛋白、马铃薯蛋白、茶多酚和大豆异黄酮等各种食品组分作用下,其活性发生明显的下降,且呈现良好的量效关系。      

白鲢鱼背侧肌焦磷酸酶的纯化及酶学特性

通过粗分离、50%～80%饱和度硫酸铵分级沉降、DE-52阴离子交换柱层析等步骤,从白鲢鱼背侧肌中分离纯化出焦磷酸酶。通过变性凝胶电泳分析,该酶在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱中仅有一个分子质量为40 kD的条带。酶学特性研究表明,白鲢鱼背侧肌焦磷酸酶可专一性地水解焦磷酸盐,反应初速率时间范围为0～15 min,最适反应温度为45 ℃,最适反应pH值为7.5。Mg2＋对该酶有明显的激活作用,在Mg2＋浓度为5 mmol/L时酶活力最高。5 mmol/L的Ca2＋、Zn2＋、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA）-Na2、EDTA-Na4、KIO3和1 mmol/L的NaF均对该酶有强烈的抑制作用。该酶水解焦磷酸四钠的最大反应速率为0.051 U/mg,米氏常数为0.54 mmol/L。     

Purification and Properties of Carp Muscle Cathepsin D

A carp muscle cathepsin was purified as an electrophoretically homogeneous preparation. The preparation represented about 2,000-fold purification and about 4% yield against the crude extract. The activity against hemoglobin was maximal at pH 2.6—2.8 with 0.6M buffer and near 3.2 with 0.12M buffer and at 50°C. The molecular weight was found to be 41,000 and the isoelectric point to be pH 5.4. From the effect of various inhibitors on the enzyme activity, the enzyme was identified as cathepsin D under the classification of Barret. Carp muscle cathepsin D hydrolyzed myofibrils optimally at pH 3–4, but did not above pH 6.0. The participation of the enzyme in autolysis is very doubtful.     

白鲢鱼肌肉脂肪氧合酶的分离纯化与鉴定

采用硫酸氨沉淀和羟基磷灰石柱层析法分离白鲢鱼肌肉脂肪氧合酶(lipoxygenase,LOX),同时采用反相高效液相(RP-HPLC)检测其反应产物,对鲢鱼肌肉LOX 进行鉴定,并研究鲢鱼肌肉LOX 的底物特异性。结果表明：白鲢鱼肌肉LOX 催化花生四烯酸主要形成12- 氢过氧化物,12-LOX 是鲢鱼肌肉中主要的LOX;白鲢鱼LOX的最适底物是亚麻酸。     

非肌肉蛋白对鲢鱼组织蛋白酶活性的影响

主要了大豆蛋白和马铃薯淀粉作为蛋白酶抑制对组织蛋白酶Ｌ的抑制作用，说明大豆蛋白和马铃薯淀粉可降低组织蛋白酶Ｌ活性，从而提高凝胶强度。     

酸碱法提取鲢鱼肌肉蛋白的胶凝特性

采用酸碱法(pH-shifting)提取鲢鱼肌肉蛋白,并研究不同工艺提取的鱼糜蛋白的胶凝特性。结果表明：与水洗鱼糜相比,酸提蛋白的肌球蛋白重链明显降解,肌动蛋白含量减少;碱提蛋白的肌动蛋白含量最高,加热胶凝造成碱提蛋白的肌球蛋白重链部分降解;酸碱提取蛋白胶凝温度和储能模量(G＇)降低;酸提蛋白胶凝热损失显著高于水洗鱼糜凝胶和碱提蛋白,但水洗鱼糜凝胶和碱提蛋白胶凝热损失之间没有显著差异(P＜0.05);酸提蛋白和碱提蛋白凝胶的保水性显著低于水洗鱼糜凝胶(P＜0.05);酸提蛋白凝胶的凝胶强度最低(46.81N×mm),但碱提蛋白凝胶(60.59N×mm)和水洗鱼糜凝胶(63.57N×mm)的强度之间没有显著差异(P＜0.05)。碱法是提取鲢鱼肌肉蛋白的合适方法。     

Mechanism of Polyphosphates Hydrolysis by Purified Polyphosphatases from the Dorsal Muscle of Silver Carp (Hypophthalmichthys Molitrix) as Detected by 31P NMR

The dynamic hydrolysis of tetrasodium pyrophosphate (TSPP), sodium tripolyphosphate (STPP) and polyphosphate compound, which was catalyzed by purified pyrophosphatase (PPase) and myosin‐ tripolyphosphatase (TPPase) from the silver carp dorsal muscle, was studied using ³¹P NMR spectroscopy. In the PPase + TSPP system, the pyrophosphate (PP) was hydrolyzed quickly and completely within 8 h and the hydrolysis rate of PP was 12.51%/h. In the TPPase + STPP system, the first‐order hydrolysis of tripolyphosphate (TPP) was not yet complete after 48 h, and the derived PP accumulated progressively. Given the coexistence of PPase and TPPase, only 1.20% of TPP in STPP alone remained after 48 h. However, the generation rate of Pi in the polyphosphate compound (TSPP: STPP: sodium hexametaphosphate = 1: 8: 1) was 0.76%/h, which was less than 0.88%/h in STPP alone. In the presence of polyphosphatases, the decrease of PP or TPP content in the polyphosphate compound was not as rapid as that in TSPP or STPP alone due to the inhibitory effect of PP on TPPase and the effect of low system pH on PPase. The understanding of polyphosphates hydrolysis mechanism was capable of developing the advanced polyphosphate mixture in order to reduce the phosphate residue in fish products.     

高速逆流色谱分离纯化红树莓果中的鞣花酸

建立高速逆流色谱分离纯化红树莓果中有效成分鞣花酸的新方法。两相溶剂系统为正丁醇∶异丙醇∶水(体积比)=2∶1∶3,上相为固定相,下相为流动相,流速为2 mL/min,转速为850 r/min,从120 g红树莓果中分离得到纯度为81.6%的鞣花酸35.2 mg。