森林脑炎病毒不同感染途径对小鼠模型的感染性分析

目的分析森林脑炎病毒不同感染途径对小鼠模型的致病性、病毒分布及增殖动态。方法将适应原代地鼠肾(primary hamster kidney,PHK)细胞的森林脑炎病毒进行10倍系列稀释,取4个连续稀释度的病毒液,分别通过脑腔注射、灌胃、滴鼻、肌肉注射、腹腔注射的感染方式,对昆明小鼠进行攻毒,逐日连续观察14 d,计算半数致死量(median lethal dose,LD₅₀);并分别取攻毒后第3、5、7天发病典型的腹腔感染组小鼠脑、肺、肾脏、肝脏、心脏、小肠、血液7种组织器官,采用蚀斑法检测病毒滴度。结果脑腔、灌胃、滴鼻、肌肉注射和腹腔注射攻毒方式的LD₅₀分别为10、10^5.1、10⁵、10^1.2和10²PFU/mL。所有攻毒途径小鼠的脑腔中病毒滴度最高,达10⁹PFU/mL,肺组织为10^6.5PFU/mL,肾脏为10⁵PFU/mL,心脏和肝脏中病毒滴度较低,分别为10²     

狂犬病病毒PM株病毒滴度检测改良蚀斑法的建立

目的建立检测狂犬病病毒PM株病毒滴度的改良蚀斑法,并验证其精密度。方法于细胞接种病毒后第6天,分别加入不同浓度(0、50、75、100、200、400 mmol/L)HEPES溶液,以及分别于细胞接种病毒后第2、4、6、8天,加入最适浓度的HEPES溶液,确定HEPES最适加入浓度及蚀斑最适判定时间,建立改良的蚀斑法,检测48批狂犬病病毒毒力,并与小鼠脑内滴定法进行相关性比较;重复检测3次10批狂犬病病毒收获液毒力,计算变异系数(CV)。结果接种病毒后第6天后加入200 mmol/L HEPES溶液,形成的蚀斑清晰,易于计数。建立的蚀斑法与小鼠脑内滴定法具有高度相关性,3次检测结果的CV在0. 4%～3. 38%之间,重复性良好。结论加入HEPES溶液改良后的蚀斑法,操作便捷,是较为理想的滴定狂犬病病毒PM株毒力的方法,可替代小鼠脑内滴定法。     

直接免疫荧光法检测狂犬病病毒滴度条件的优化及验证

目的对直接免疫荧光法检测狂犬病病毒(rabies virus,RV)滴度的条件进行优化及验证。方法考察直接免疫荧光法中细胞不同接种方式(分步接种法、一步接种法)、病毒不同培养温度(34、37℃)及培养时间(6、12、24、48、72、96 h)对狂犬病病毒滴度的影响;对优化的方法进行试验间精密性和特异性验证,并与小鼠脑内滴定法的检测结果进行比较。结果选择一步接种法作为直接免疫荧光法的细胞接种方式;34℃作为病毒培养温度;病毒培养至96 h时进行染色,判定实验结果;病毒培养至第3天时进行荧光灶计数,计算病毒液中病毒的数量。两名操作人员12次检测结果的变异系数仅为0.05%;用该方法检测不同病毒,仅狂犬病病毒组出现特异性荧光,而犬瘟热病毒和犬细小病毒组未观察到荧光灶。采用直接免疫荧光法和小鼠脑内滴定法检测狂犬病病毒样品的病毒滴度结果差异无统计学意义(P0.05),具有较好的一致性。结论优化的直接免疫荧光法精密性良好,特异性强,操作简便,检测周期短,可用于狂犬病病毒滴度的定量检测。     

狂犬病病毒滴度直接免疫荧光检测法的建立及验证

目的 建立狂犬病病毒滴度的直接免疫荧光检测法,并进行验证.方法 将狂犬病病毒Pitman-Moore株(PM株)病毒液进行5倍系列稀释后,感染MRC-5细胞,37℃培养24 ～ 30 h;用FITC标记的抗狂犬病病毒特异性抗体进行染色,通过计数病毒感染细胞的荧光灶数计算病毒滴度,并验证方法的重复性、中间精密度及线性范围...     

应用蚀斑抑制中和法检测乙型脑炎疫苗效力

本文用BHK-21细胞系蚀斑抑制中和法(RRNT)检测乙型脑炎灭活疫苗效力,同时与小鼠免疫攻击法进行比较。PRNT每次均设病毒对照组、P_3免疫血清对照组,并用参考苗作判定标准。在四次试验中,病毒对照组的P值均>0.05;免疫血清对照组的50％空斑形成单位(PFU)减少率均在1:1600附近,重复性好。在小鼠免疫攻击法检测合格的24疫苗中,ID_(50)<0.0001的有4批用PRNT检测不合格,而另外ID50在0.00032～0.0001的8批中,用PRNT检测却全部合格。两法检测结果存在较大差异。     

应用蚀斑减少中和试验检测健康人血浆中抗乙型脑炎病毒中和抗体

目的 应用蚀斑减少中和试验,检测健康人血浆中抗乙型脑炎病毒中和抗体水平。方法 采用蚀斑减少中和试验。结果 四川和重庆地区健康人血浆中98％以上含有抗乙型脑炎病毒中和抗体,其中10％的健康人血浆中该抗体滴度高达1:500倍以上。结论 采用蚀斑减少中和试验方法用于健康人血浆中乙型脑炎病毒中和抗体测定是可行的。     

呼吸道合胞病毒培养及其病毒滴度检测方法的建立

目的确定呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)培养条件,筛选病毒保护剂配方,并建立检测病毒滴度的微量细胞病变方法。方法分别将Hep2、Vero和293R细胞以0.01 MOI接种RSV,选择病毒培养细胞基质;将RSV分别以0.005和0.02 MOI接种Hep2细胞,在4~9 d收获病毒液,检测病毒滴度,确定最佳MOI及病毒收获时间;将6种配方病毒保护剂分别加至病毒液中,反复冻融7次,检测病毒滴度,筛选最佳配方;将病毒分别在33和37℃条件下滴定,第7、9天判定结果,确定微量细胞病变方法的培养温度和判定时间。结果确定病毒培养细胞基质为Hep2细胞,以0.02 MOI RSV接种后,37℃培养7~9 d收获病毒液;配方1(0.1%人血白蛋白)为最佳病毒保护剂配方;微量细胞病变法的实验条件为37℃滴定,7 d判定结果。结论建立了稳定可靠的呼吸道合胞病毒培养及病毒滴度检测方法。     

细胞荧光转化灶法检测狂犬病病毒滴度

目的应用细胞荧光转化灶(fluorescence focus units assay,FFU)法检测狂犬病病毒滴度。方法将狂犬病病毒稀释后接种BSR细胞,培养22~24 h,用FITC标记的抗狂犬病病毒特异性抗体进行染色,计数病毒感染细胞的荧光灶数,计算病毒滴度。采用乳鼠半数致死量(median lethal dose,LD50)法和建立的方法分别测定14批狂犬病病毒滴度,分析两者间的相关性;取同一份病毒液,于不同时间点检测3次,每个时间点重复检测6次,验证方法的重复性;取3份滴度不同的病毒液,由2个操作者在不同时间重复测定3次,验证方法的中间精密性;将同一份病毒液按2倍梯度稀释,共9个稀释度,分别检测病毒滴度,重复测定3次,确定该方法的线性范围。应用建立的方法检测38批CTNCEC株狂犬病病毒滴度。结果乳鼠LD50法测定14批狂犬病病毒的-Lg LD50值范围为4.20~8.19,FFU法Lg FFU值范围为3.76~7.69,两种方法检测结果趋势相同,线性回归相关系数R-Sq(调整)=96.1%,存在良好的正相关性;同一个时间点检测6次及不同时间点检测3次的CV值均小于2.00%;两个操作者在不同时间重复测定3次的CV值均小于8.00%,两个操作者之间的检测结果差异无统计学意义(P>0.05);样品浓度与Lg FFU呈良好的线性关系,R-Sq(调整)=99.3%,线性范围为2.26~6.12。38批CTNCEC株狂犬病病毒滴度平均Lg FFU在3.63~7.69之间,SD值在0.021~0.57之间,CV值小于10.00%。结论建立的细胞FFU法准确性、重复性、中间精密度好,该方法可用于检测狂犬病病毒滴度。     

森林脑炎灭活疫苗加强免疫效果的临床观察

目的 评价森林脑炎灭活疫苗加强免疫后的免疫效果。方法 选择吉林市森林脑炎发病率较高的蛟河市、舒兰市既往有森林脑炎疫苗基础免疫史的400名8岁及以上健康人群,于基础免疫后18个月,进行1剂加强免疫,加强免疫1个月后,采集受试者静脉血,分离血清,使用森林脑炎Ig G ELISA试剂盒测定血清Ig G抗体水平。结果 400名受试者中,失访61人,共339人完成加强免疫,男女比例为3.35∶1;抗体阳性325人,阳性率为95.87%,GMC为3 391 VIEU/ml,其中8~16岁、17~59岁及60岁以上年龄组抗体阳性率差异无统计学意义(P>0.05),但GMC差异有统计学意义(P<0.01),男、女抗体阳性率及GMC差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 受试者加强免疫后抗体阳性率较高,产生了高滴度的保护性抗体。     

腮腺炎减毒活疫苗感染性滴度荧光定量RT-PCR检测方法的建立及验证

目的建立腮腺炎减毒活疫苗感染性滴度荧光定量RT-PCR检测方法,并进行验证。方法针对腮腺炎减毒活疫苗株S79血凝素(hemagglutinin,H)基因保守区域设计特异性引物和Taq Man荧光探针;以05008批腮腺炎减毒活疫苗S79株成品作为参考品,将参考品或供试品稀释后,接种于长成单层的Vero细胞中,采用低渗合并冻融法将细胞破碎,吸取上清,进行荧光定量RT-PCR。优化病毒感染时间,并对该方法的特异性、精密性及准确性进行验证。结果病毒感染的最佳时间为18 h;建立的荧光定量RT-PCR法只对腮腺炎减毒活疫苗具有特异性扩增,对灭活的腮腺炎减毒活疫苗、水痘病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、风疹病毒和Vero细胞均无扩增曲线出现;该方法检测4个浓度(1、1:5、1:52、1:53)样品6组数据的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均5%,不同操作人员于不同日期检测4个浓度(1、1:5、1:52、1:53)样品的标准曲线回归方程R2均大于0.97,RSD均5%;该方法与细胞病变法测得的11批腮腺炎减毒活疫苗成品的病毒滴度值之差均≤0.2 Lg CCID50/ml,两组数据差异无统计学意义(P0.05)。结论建立的荧光定量PCR法检测腮腺炎减毒活疫苗感染性滴度特异性较强,精密性和准确性良好,且快速方便,可应用于企业生产过程中的内部质控。     

CCID_(50)法检测流感病毒滴度方法的建立及验证

目的建立基于MDCK细胞的三价流感减毒活疫苗病毒滴度检测方法,并进行验证。方法以抗流感病毒血清中和三价流感减毒活疫苗中两种型别病毒,采用CCID_(50)法检测未中和型别病毒感染性滴度,并对方法的专属性、线性、准确性、精密度、耐用性进行验证。结果样品中的辅料成分、其他型别病毒和异源抗病毒血清均不会对病毒滴度测定结果产生干扰;该方法检测H1N1、H3N2和B型流感病毒滴度的线性范围分别为3.81~8.48、3.48~7.65和2.45~6.98 log CCID_(50)/0.2 ml,在线性范围内,线性回归系数(R~2)分别为1、0.994 6和0.994 5;该方法检测3种型别流感病毒滴度重复性和中间精密度的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于15%,平均回收率在85%~115%之间;同一样品不同时间点检出结果差异无统计学意义(P均0.05)。结论建立的CCID_(50)法专属性、准确度、线性、精密度、耐用性良好,是一种简便、快速、成本低、检测误差小的方法,可用于三价流感减毒活疫苗病毒滴度的检测。     

预灌封注射器森林脑炎灭活疫苗的临床前安全性及免疫原性评价

目的 评价0.5 mL/支的预灌封注射器森林脑炎（tick-borne encephalitis,TBE）灭活疫苗的临床前安全性和免疫原性。方法 采用兔肌内刺激性试验和豚鼠全身主动过敏反应试验评价新规格TBE灭活疫苗的安全性,并与原规格包装形式（1.0 mL/瓶,西林瓶）TBE灭活疫苗进行比对。将新规格及包材TBE灭活疫苗经腹腔免疫体质量10～12 g的昆明小鼠30只,免疫2次,间隔7 d,初次免疫后第14天攻毒（“森张”株TBEV）,试验组以10^-2～10^-6稀释度病毒,对照组以10^-6～10^-10稀释度病毒经腹腔攻毒,持续观察21 d判定结果,通过Reed-Muech法计算效价来评价TBE灭活疫苗的免疫原性。结果 兔肌内刺激性试验的所有动物均未见死亡或濒死情况,各组豚鼠全身主动过敏反应试验临床观察未见异常反应。3批原规格包装形式的TBE灭活疫苗的免疫原性（免疫保护指数）分别为1.0×10～8、1.3×10～8、1.0×10～8;3批新规格包装形式的TBE灭活疫苗的免疫原性（免疫保护指数）分别为1.1×10～8、1.0×10～8、1.3×10～8,符合《中国药典》三部（2020版）大于1.0×10～5的要求,新、旧规格疫苗免疫原性差异无统计学意义（F=0.063,P>0.05）。结论 0.5 mL/支的预灌封注射器TBE灭活疫苗的临床前安全性和免疫原性良好。     

不同细胞对乙型脑炎病毒蚀斑减少中和试验的影响

目的分别使用不同细胞测定乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)滴度及乙型脑炎灭活疫苗效价,分析不同细胞对检测结果的影响。方法将JEV P3株接种至长满单层的MDBK、Vero、LLC-MK2、BHK-21细胞的6孔板,采用蚀斑试验测定JEV的PFU;将乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)免疫小鼠,取静脉血,分离血清,经56℃灭能30 min后,与JEV P3株混合,接种至长满单层的Vero、BHK-21、LLC-MK2细胞的6孔板,采用蚀斑减少中和试验检测乙型脑炎灭活疫苗的效价。结果 JEV在4种细胞上均可产生细胞病变(cytopathic effect,CPE),但在MDBK细胞上不形成蚀斑,病毒感染的Vero、LLC-MK2、BHK-21细胞的收获液病毒滴度分别为10.02、9.42和9.21 lg PFU/ml;3种细胞测定乙型脑炎灭活疫苗效价T值VeroLLC-MK2BHK-21,其中Vero细胞与BHK-21和LLC-MK2细胞比较,蚀斑减少率及对应T值差异有统计学意义(P0.05),LLC-MK2与BHK-21细胞比较,蚀斑减少率及对应T值差异无统计学意义(P0.05)。结论 4种细胞感染JEV后均可产生CPE,但MDBK细胞不能形成蚀斑;不同细胞测定疫苗效价,蚀斑减少率及对应T值也不同,其中Vero细胞测定T值最大,BHK-21细胞测定T值最小。     

鼠细小病毒感染性滴度测定方法的建立及病毒制备

目的建立鼠细小病毒(MMV)感染性滴度测定方法,并制备高滴度的MMV,为生物制品病毒清除/灭活工艺的验证奠定基础。方法通过分析NB324K细胞接种量、培养时间及病毒吸附时间等参数,建立MMV病毒滴度测定的半数细胞感染剂量法(CCID5)0,并分析其精密性;以A9细胞制备MMV,分析感染复数(MOI)、收获时间及收获样本对病毒滴度的影响,并检测病毒的稳定性。结果NB324K细胞的最佳接种浓度、培养时间及病毒吸附时间分别为5×103个/孔、48h及2h,所建立的检测方法精密性较好;A9细胞沉淀中病毒滴度高于上清,且随病毒MOI值的升高而逐渐增加,在MOI为10时,感染后48h收获,病毒滴度最高。制备的病毒液的平均滴度为8.69CCID50/ml,4℃和37℃保存7d及反复冻融5次,稳定性良好。结论已建立了MMV感染性滴度测定方法,并制备了高滴度的病毒,为以MMV为指示病毒进行病毒清除/灭活工艺验证奠定了基础。     

人巨细胞病毒培养条件的优化及快速病毒滴度检测方法的建立

目的优化人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)的培养条件,并建立一种快速检测HCMV滴度的方法。方法以人胚肺二倍体细胞(MRC-5)为病毒传代和滴度测定用细胞,对病毒接种量、培养温度、保护剂种类等条件进行优化。将本实验室建立的快速微量中和试验-感染细胞核染色法用于病毒滴度检测,并与蚀斑形成法及微量细胞病变法进行比较,采用Behrens-Karher法计算病毒滴度。结果 HCMV接种MRC-5细胞后在37℃培养可出现明显病变;MOI为1.0时,病毒滴度基本达到平台;病毒收获时加入1%人血白蛋白或10%FBS保护剂可维持病毒滴度稳定。同一病毒液经蚀斑形成法检测病毒滴度为5.707 lg PFU/ml,微量细胞病变法和感染细胞核染色法检测病毒滴度分别为5.633和5.667 lg CCID50/ml,3种方法的检测结果差异无统计学意义(P0.05)。结论HCMV接种MRC-5的最佳培养条件为:病毒接种量1.0 MOI,在37℃培养,加入1%人血白蛋白或10%FBS作为保护剂。建立的感染细胞核染色法可用于HCMV滴度的快速测定,为抗病毒物质的开发及效果评价提供了一种新的技术手段。     

森林脑炎病毒单克隆抗体的研制及抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法的建立和应用

目的 制备森林脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)单克隆抗体,并建立TBEV抗原定量双抗体夹心ELISA检测方法,初步应用于疫苗生产过程中TBEV抗原含量监测.方法 以TBEV"森张"株灭活纯化全病毒作为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备小鼠单抗杂交瘤及腹水抗体,纯化后鉴定单抗...     

不同病毒培养方式制备森林脑炎灭活疫苗的比较

目的比较3 L转瓶及14 L篮式生物反应器培养病毒制备的森林脑炎灭活疫苗的产量及质量。方法分别采用3 L转瓶及14 L篮式生物反应器培养Vero细胞,3 L转瓶培养细胞96 h后感染SZV株森林脑炎病毒(MOI=0.01、0.04、0.1及0.4),培养至80~96 h收获第1次,每隔48 h收获1次(500 m L/次);14 L生物反应器培养Vero细胞7 d后感染SZV株森林脑炎病毒(MOI=0.01、0.04、0.1及0.4),感染后96 h开始流加病毒维持液,并收获病毒液,每24 h收获10~15 L。两种培养方式收获的森林脑炎病毒液经超滤浓缩、β-丙内酯灭活、柱层析纯化后获得疫苗原液,并进行相关检定。结果 4种MOI感染Vero细胞,采用3 L转瓶方式培养可连续收获6~7次,病毒液产量为3~3.5 L,收获液平均滴度为7.4 lgLD_(50)/m L;采用14 L篮式生物反应器培养可连续收获14 d,病毒产量140~160 L,收获液平均滴度高达8.4 lgLD_(50)/m L。两种方法制备森林脑炎灭活疫苗原液各项质量指标均合格,且14 L篮式生物反应器制备原液的效力及蛋白含量优于3 L转瓶。结论应用生物反应器培养工艺制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的产量及质量高于转瓶培养工艺,本实验为生物反应器制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的大规模生产及工艺改进奠定了基础。     

SV40感染滴度测定方法的建立及高滴度病毒的制备

目的建立稳定的SV40感染滴度测定方法,制备高滴度SV40,用于生物制品病毒清除/灭活工艺的验证。方法通过分析不同细胞感染SV40后出现病变的时间、病变程度及产毒量,确定SV40敏感细胞株。分析维持液、细胞培养时间、病毒吸附时间等对病毒滴定测定的影响,建立SV40滴度测定的方法。并分析病毒感染后不同时间及细胞不同部位SV40滴度的差异,制备大量的高滴度SV40。结果与Vero、Vero76及VeroE6细胞相比,CV-1细胞对SV40高度敏感,细胞病变出现时间最早,病变最明显,产毒量最高。SV40滴度与病毒接种前细胞的培养时间、细胞接种量和维持液无明显相关,但吸附时间对病毒滴度有一定的影响。病毒的最佳吸附时间为120 min。接种病毒后48 h收集细胞沉淀,所获得的SV40滴度最高,平均为8.81 lg CCID50/ml。结论已建立了稳定的SV40滴度测定方法,并制备了高滴度SV40,为病毒清除/灭活工艺验证研究奠定了基础。     

森林脑炎病毒Vero细胞适应株的全基因组序列分析

目的对森林脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)森"张"株在Vero细胞上的适应株(以下称SZV株)进行全基因组测序,并与TBEV远东亚型的其他毒株、欧洲亚型毒株进行比较。方法设计TBEV的特异性引物,提取SZV株病毒总RNA,以其为模板,采用RT-PCR方法分段扩增序列并测序,应用Vector NTI 9.0软件进行拼接,并与森"张"株、Gen Bank中报道的TBEV远东亚型Oshima 5-10株、Sofjin-HO株及欧洲亚型263株、Neudoerfl株的全长基因序列进行比对分析。结果 SZV株的全基因组由10 782个核苷酸组成,仅编码1个开放阅读框,长度为10 245个核苷酸,共编码3 414个氨基酸。SZV株与TBEV远东亚型的Oshima5-10株和Sofjin-HO株ORF区编码的氨基酸序列同源性分别为95.0%和94.6%,与TBEV欧洲亚型的典型毒株263株和Neudoerfl株ORF区编码的氨基酸序列同源性分别为91.1%和91.0%。结论对TBEV Vero细胞适应株SZV进行了全基因组序列测定及分析,为研制基于Vero细胞基质的森林脑炎疫苗奠定了基础。     

森林脑炎纯化疫苗的研究

目的 制备森林脑炎纯化疫苗。方法 将森林脑炎病毒感染地鼠肾单层细胞，收获病毒液，经超滤浓缩、柱层析纯化病毒后配制而成。结果 疫苗兔疫保护力指数均≥1 .0 ×106，杂蛋白去除率≥99％，小牛血清蛋白去除率＞99％，所有检测项目全部合格。结论 该纯化工艺制备的森林脑炎纯化疫苗抗原含量高，热稳定性好，免疫原性强，各项检测结果均符合2000年版《中国生物制品规程》标准。