高烟碱K326定向改良材料的创制与分析

为了明确NtJAZ1基因对烟碱含量（质量分数）和烟株生长发育及品质的影响,以烤烟品种K326为材料,利用CRISPR/Cas9技术对NtJAZ1基因进行敲除,获得了纯合突变株系NK-9。测序结果表明,NtJAZ1-1在1 587~1 641 bp之间大片段缺失,NtJAZ1-2在1 547~1 548 bp之间缺失了2个碱基,导致翻译提前终止。RT-PCR检测结果表明,NK-9烟碱生物合成关键基因NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT和NtQPT的表达水平显著提高。田间调查发现,NK-9株系生长发育正常,株高、叶数和叶宽显著高于对照K326,但叶长显著低于K326。显微观察表明,NK-9叶面腺毛密度较对照有所降低。对现蕾期、打顶期和成熟期烟碱含量检测发现,NK-9株系中部叶的烟碱含量分别比对照提高33.26%、36.41%和39.28%。烤后烟叶化学成分分析表明,NK-9常规化学成分比例协调,烟碱含量较对照提高44.91%;中性香气成分中新植二烯、类胡萝卜素类降解产物含量明显增加,但棕色化反应产物、苯丙氨酸类降解产物和茄酮含量有所降低。说明敲除NtJAZ1基因能够有效提高烟叶烟碱含量,对腺毛发育和叶面化学成分的积累也有一定影响。      

NtCycB2和NtJAZ1共敲除对烟草腺毛密度和烟碱含量的影响

为了提高烟草的腺毛密度、腺毛分泌物和烟碱含量,从而改善烟株抗性和烟叶品质,以NtCycB2突变的多腺毛K326突变株系（hairy K326）为材料,采用CRISPR/Cas9技术对NtJAZ1进行基因编辑,筛选出NtCycB2与NtJAZ1基因共敲除的纯合株系J-21,并以K326和hairy K326为对照,对J-21的农艺性状、腺毛发育、烟碱生物合成和烟叶化学成分进行了研究。结果表明,J-21植株生长发育正常,主要农艺性状与K326和hairy K326无显著差异,其叶片腺毛密度比hairy K326有所降低,但比K326显著提高,腺毛分泌物含量（质量分数）提高156.35%。J-21叶片烟碱含量在现蕾期比K326和hairy K326显著提高,在烟株打顶后提高幅度明显降低,成熟期叶片烟碱含量比K326和hairy K326分别提高37.14%和32.28%。J-21烤后烟叶化学成分协调,烟碱含量比K326和hairy K326分别提高39.81%和45.32%,西柏烷类降解产物茄酮含量比K326和hairy K326分别提高217.49%和48.45%。表明NtCycB2和Nt...     

烟草腺毛中NtHD-ZIP IV和NtJAZ家族基因表达分析

【目的】为探究NtHD-ZIP IV和NtJAZ家族基因在腺毛发生发育中的作用。【方法】通过实时定量PCR技术分析NtHD-ZIP IV和NtJAZ家族基因在高分泌型烤烟种质T.I.1068和非分泌型烤烟种质C110上的转录水平以及茉莉酮酸甲酯（Methyl Jasmonate,MeJA）处理C110后NtHD-ZIP IV和NtJAZ家族基因的转录水平。【结果】（1）C110的腺毛类型以短柄分泌型腺毛和非分泌型腺毛为主,T.I.1068的腺毛类型以长柄分泌型腺毛和短柄分泌型腺毛为主,MeJA处理后,C110的长柄分泌型腺毛密度增加。（2）Nt HD-ZIP IV-6、-7、-9和-14在C110和T.I.1068表皮毛中的表达水平均较高,NtHD-ZIP IV-1、-2、-3和-13在C110表皮毛中表达水平较高,NtHD-ZIP IV-12则在T.I.1068表皮毛中表达水平稍高。MeJA处理后,NtHD-ZIP IV-1、-2和-7的转录水平受到抑制,而NtHD-ZIP IV-5的转录水平上调。（3）与C110相比,Nt JAZ-1、-7、-9、-12、-13、-14和-15在T...     

烟草腺毛生物反应器材料的创制与性状分析

为提高烟草腺毛分泌物含量（质量分数），以高分泌型种质资源T.I.1068为材料，采用基因编辑技术敲除其腺毛发育负调控基因NtCycB2，获得了纯合突变株系TTB-1(tobacco trichome bioreactor-1)。结果表明：TTB-1植株生长旺盛，发育正常。显微观察发现与烤烟K326不同，TTB-1与T.I.1068表皮毛由腺毛组成，无保护毛；TTB-1腺毛密度比T.I.1068提高53.41%，是K326的7倍；与K326相比，TTB-1腺头更加饱满，罗丹明着色更深。烟株现蕾期中部叶片叶面化学成分检测结果显示，TTB-1与T.I.1068分泌物组分一致，但分泌物含量显著高于T.I.1068，分泌物总量比T.I.1068提高63.11%;TTB-1与K326分泌物组分不同，除西柏烷类二萜和Ⅰ～Ⅱ型蔗糖酯外，还含有赖百当类二萜和Ⅲ～Ⅴ型蔗糖酯，总量是烤烟品种K326的7.95倍。对上中下部成熟叶片进行分批采收和叶面化学成分萃取，浸膏产率分别为烟叶鲜质量的0.61%、0.43%、0.30%，平均每株浸膏产量为8.90 g；在盛花期进行一次性采收，浸膏产率为烟叶鲜质量的0.45...     

烤烟品种K326和云烟87对镉胁迫的生理响应及抗性差异

水培条件下,研究镉(Cd)胁迫后2个常用烤烟品种(K326和云烟87)对Cd的吸收及Cd在细胞中的分布,比较Cd处理前后烟株的生物质积累、叶绿素含量、根系活力、叶表及根尖微结构的变化.结果表明,外源Cd处理使K326的生物量比对照降低37.7%,云烟87生物量降低76.2%;K326的总叶绿素含量比对照降低64%,云烟87的降低53%;K326根的活跃吸收面积比对照降低33.3%,云烟87的降低13.9%.不加Cd时,2种烟草气孔大小均一,密度相近,Cd处理后,两者的气孔均减小,密度增大.在Cd的影响下,K326品种的细胞直径下降了35%,云烟87的下降不显著.Cd处理使完整饱满的根尖变得皱缩平秃.Cd处理使K326叶表腺毛腺头变小、腺毛变细,尤其腺基部变细更明显;Cd处理使云烟87叶表腺毛发育相对延迟.Cd主要存在于K326和云烟87的根部,分别占总量的82%和89.4%,在叶细胞的5个组分中,以可溶性组分中最高,且K326中Cd的含量高于云烟87.从生物质积累量来看,Cd处理对K326的影响小于对云烟87的影响,两个烟草品种耐受Cd的能力差异较大.     

茉莉酸甲酯对烟叶表面腺毛密度及蔗糖酯含量的影响

以烟草栽培品种K326、龙江911和翠碧1号3个品种为供试材料,利用组织化学染色法在体视显微镜下观察分泌蔗糖酯腺毛数,测定了蔗糖酯含量。研究了不同浓度的茉莉酸甲酯(MeJA)对烟草表面单位面积上蔗糖酯的相对含量及分泌蔗糖酯腺毛密度的影响。结果显示,4个浓度的MeJA处理中,3个品种的烟草表面蔗糖酯含量及蔗糖酯分泌腺毛密度随着MeJA浓度的增加而逐渐降低。烟草的这种反应对其合理分配代价、形成对害虫强有力的抗性可能更为有利。     

低浓度茉莉酸甲酯对烟草长柄腺毛发生发育的影响

茉莉酸甲酯（MeJA）对烟草长柄腺毛的发生具有强烈的诱导作用,但浓度过高时会抑制烟苗发育。本文以云烟87幼苗为材料,研究低浓度MeJA对腺毛发育和腺毛分泌物的影响,并利用qRT-PCR技术研究腺毛发生发育调控基因对MeJA的应答模式。结果表明,随着MeJA喷施浓度的升高,长柄腺毛的密度和腺头直径逐渐增加;喷施300μmol/L MeJA对长柄腺毛发生和发育有显著的诱导作用,且对叶片发育无明显影响;当MeJA喷施浓度达到600μmol/L时,叶片发育受到抑制。叶面化学成分分析发现,与未喷施MeJA的对照相比,喷施300μmol/L MeJA后西柏烷二萜、烷烃和蔗糖酯含量增加约一倍。基因应答模式研究发现,西柏烷二萜合成基因CBTS和CYP71D16,以及酯转运蛋白基因Nt LTP1受MeJA诱导表达;烟草腺毛发生调控基因ARF3、GIS、CD2、Wo和Cyc B2对MeJA处理均具有应答反应,其中ARF3和GIS的表达受到MeJA诱导,而CD2、Wo和Cyc B2的表达受到MeJA抑制。综上,300μmol/L MeJA可以调控腺毛发育相关基因的表达,安全、有效地促进长柄腺毛发生发育以及腺...     

不同生长物质复配处理对烤烟种子萌发的影响

为了更好地提高烟草催芽种子的质量,尤其是改善陈种子的萌发能力,实验采用不同浓度的MS营养液、GA3、IBA、6-BA及4者复配对K326、NC89新陈2类种子进行催芽处理,统计分析不同条件催芽处理后的种子萌发率、各项生理生化指标变化以及萌发相关基因的表达。结果表明,各因素单独催芽处理,在适宜浓度范围内均能促进种子萌发。而采用生长物质复配配方（1/20 MS＋100 mg/L GA3＋2 mg/L IBA＋0.2 mg/L 6-BA和1/20 MS＋100 mg/L GA3＋2 mg/L IBA＋2 mg/L 6-BA）催芽处理,种子萌发迅速且各项生理生化指标显著优于对照。此外,WRKY2基因的表达量在催芽处理后显著提高。     

茉莉酸甲酯诱导烟草抗虫的有效浓度和持效期

为阐明茉莉酸甲酯（MeJA）诱导烟草抗虫机制,用50 μmol/L和150 μmol/L的MeJA乙醇水溶液喷洒烟苗,24 h和48 h后取叶片分别喂食棉铃虫和甜菜夜蛾,每隔6 h监测取食量及体重变化,同时通过Folin-Ciocalteu比色法检测烟叶总多酚含量变化,并利用组织化学染色法统计分泌蔗糖酯的腺毛数。结果显示:（1）对于棉铃虫,50 μmol/L和150 μmol/L的MeJA喷施烟苗24 h~48 h后,试虫取食量和体重增加量均显著低于对照,而对于甜菜夜蛾,仅150 μmol/L MeJA处理烟苗24 h后引起试虫取食量和体重增加量明显降低;（2）MeJA诱导烟叶总多酚含量增加,增加量与MeJA浓度呈正相关;（3）MeJA导致烟叶分泌蔗糖酯的腺毛密度降低,腺毛密度与MeJA浓度呈负相关。MeJA诱导烟草抗虫具有一定的持效期且抗虫效果受其浓度影响,而总多酚含量增加和代谢改变或许是烟草产生抗虫性的部分原因。      

基于CRISPR/Cas9技术的烟草烟碱相关基因敲除及功能研究

CRISPR/Cas9是一种重要的基因组定向编辑技术,近年来在植物基因组的定向敲除和分子育种材料创制中得到了广泛应用。为了发掘可用于分子育种的低烟碱烟草,以烤烟品种K326为试验材料,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对控制烟草烟碱合成和转运的5个基因（PMT1、QPT1、A622、NtNUP1和JAT1）进行定向敲除,并对T2代纯合基因型烟草植株进行烟碱含量检测。结果表明,定向敲除5个基因后获得100株成功编辑的T0代烟草植株,突变检出率为29.9%,突变类型以单碱基插入或删除为主。对定向敲除烟碱合成基因QPT1和转运基因JAT1的T1代纯合基因型烟草植株进行序列分析,发现存在4种突变类型,分别是插入一个T、C、A碱基的插入突变和一个缺失44个碱基的缺失突变,从而引发移码使得翻译的氨基酸链大幅缩短,其T2代植株上部叶烟碱含量显著低于野生型植株。综上所述,CRISPR/Cas9技术能够高效定向敲除烟碱关键基因,为低烟碱烟草分子育种提供了理论和技术支撑。     

低烟碱品种及栽培模式对烤烟化学成分及感官质量的影响

【目的】为研究低烟碱品种结合低烟碱栽培模式对烟碱的降低效果及其他烟叶化学成分和烟叶质量的影响。【方法】在河南省许昌市,以常规品种中烟100、低烟碱品种ITB687和超低烟碱品种NC926为材料,设置当地常规栽培模式（LCCP）和低烟碱栽培模式（LNCP）进行栽培试验。【结果】（1）不同品种在LCCP下农艺性状差异较小,而LNCP模式对其生长后期影响较大,叶片长宽比增加,上部叶面积和单叶重显著下降。（2）在LCCP下3个品种的生物碱含量差异极大,NC926上部叶和中部叶调制后烟碱含量分别为0.28%、0.21%。LNCP显著降低烟叶烟碱和总生物碱含量,但低烟碱品种在LNCP下烟碱降幅相对较小,其中NC926上部叶调制后烟碱含量降低38.03%,中部叶无显著差异;高烟碱品种采用LNCP降低幅度相对较大,其中中烟100上部叶和中部叶调制后烟碱含量分别降低44.11%、30.01%。（3）在LCCP下不同品种同一部位烤后烟的还原糖、总糖、总氮含量均表现为中烟100>ITB697>NC926,LNCP下烟叶总氮含量降低,上部叶还原糖、总糖含量增加,但中部叶还原糖、总糖含量降低。（4）...     

外源CBD缓解烟草Cd胁迫的代谢组学分析

【目的】探究外源大麻二酚（CBD）对镉（Cd）胁迫下烟草的缓解效应。【方法】以烟草品种K326为研究对象，施用乙酸镉，并将CBD喷施于Cd胁迫烟株叶面，测定各处理烟株Cd含量，并基于GC-MS和LC-MS/MS的靶向和非靶向组学方法分析烟株代谢物的差异。【结果】（1）CBD能提高烟株的Cd耐受系数，显著降低烟株地上部分的Cd积累量。（2）不同处理烟株代谢物存在明显差异，其中有15种初生代谢物、8种生物碱、12种植物激素差异显著。（3）施用CBD后，Cd胁迫下烟株根部的有机酸（苏糖酸、棕榈酸、丁二酸、乙醇酸、葡萄糖酸）、肌醇半乳糖苷、丙氨酸等初生代谢物含量减少；生物碱与植物激素合成趋于正常水平。（4）烟株中葡萄糖酸、乙醇酸、乳酸、肌醇半乳糖苷、甘油含量与烟碱呈正相关，其可能是重金属胁迫下，调控生物碱合成的潜在物质。（5）CBD可以调节烟株色氨酸、酪氨酸代谢等响应胁迫的代谢通路恢复正常，并通过调节硫代谢，改善植株对养分的吸收利用，使TCA循环等能量代谢通路恢复，保证烟草中生物碱类等特异性次生代谢物的稳定合成。【结论】外源CBD可通过改变代谢途径缓解烟株Cd毒害，为降低烟草重金属污染提供新途...     

复合盐碱处理下烤烟品种发芽特性及耐盐性评价

为探讨不同烤烟种子萌发期耐盐特性,以5个烟草品种为供试材料,在发芽期采用不同质量浓度的复合盐碱处理,研究其对烟草品种主要发芽特性的影响。结果表明,低浓度盐碱(0.2%、0.4%)不同程度提高了K326、红花大金元和云烟97的发芽率和发芽势,红花大金元和K326的发芽指数也较对照有所增高;中高浓度盐碱(≥0.6%)降低了各品种种子的发芽率、发芽势及发芽指数,而干重始终随盐碱浓度增大而减小,盐害率则随浓度增大而增大。低浓度的复合盐碱促进部分烤烟品种(K326、红花大金元、云烟97)萌发,而高浓度盐碱对供试品种的萌发有强烈的抑制作用。不同品种对盐碱的耐受力不同,低盐碱下红花大金元、云烟87和K326表现相似且良好,云烟97次之,中烟100较弱;中高盐碱处理下,K326和云烟87、云烟97表现较好,红花大金元次之,中烟100较弱。     

烟草种子附生细菌群落结构与多样性分析

为揭示烟草种子附生细菌的群落结构和多样性,采用分离培养法分析了6个烟草品种（烤烟K326、云烟85、云烟87及红花大金元,雪茄烟301和白肋烟L8）种子可培养附生细菌种类,并采用Illumina高通量测序技术研究了4个品种（K326、云烟85、雪茄烟301和白肋烟L8）种子附生细菌的群落结构与多样性。结果表明:6个品种种子上共分离鉴定出细菌35株,可培养优势附生细菌有假单胞菌（Pseudomonas）、芽胞杆菌（Bacillus）、肠杆菌（Enterobacte）、泛菌（Pantoea）、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）等菌属。高通量测序结果表明:K326、白肋烟L8和云烟85种子的附生细菌结构上存在共性与差异,共有的优势菌有假单胞菌、泛菌、鞘氨醇杆菌（Sphingobacterium）、肠杆菌、糖芽胞杆菌（Saccharibacillus）、寡养单胞菌（Stenotrophomonas）、根瘤菌（Rhizobium）等菌属,烟草品种附生细菌多样性排序依次为云烟85＞K326＞L8＞301。      

烟草腺毛优势表达基因NtMYB108b的克隆及分析

为揭示NtMYB108转录因子在烟草中的功能,从栽培烟草K326的叶片腺毛中克隆到1条MYB基因的全长cDNA序列,命名为NtMYB108b。NtMYB108b的开放阅读框为828 bp,编码275个氨基酸。生物信息学预测显示,NtMYB108b蛋白定位于细胞核,属于R2R3-MYB型转录因子S20亚组成员,与绒毛状烟草亲缘关系最近,序列相似性为100.00%。实时荧光定量PCR分析显示,NtMYB108b在烟草腺毛中优势表达;NtMYB108b在团棵期叶片中相对表达量最高,在现蕾期5个叶位中的表达无显著差异。经乙烯利（ET）和水杨酸（SA）处理后,NtMYB108b的表达量显著上调,而经茉莉酸甲酯（MeJA）、赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）处理后其表达量无显著变化;使用聚乙二醇（PEG）处理模拟干旱胁迫,处理2 d后NtMYB108b表达量上调,这说明NtMYB108b的功能可能涉及ET、SA信号转导和干旱胁迫。     

MS培养液和植物生长调节物质催芽处理烤烟种子的效果

为提高烤烟催芽包衣种子的出苗速率、整齐度和幼苗素质,采用不同浓度MS培养液、赤霉素、萘乙酸组合配比对中烟201种子进行催芽处理,统计分析不同催芽处理后种子萌发和幼苗根长及下胚轴长度。结果表明,MS培养液、赤霉素(GA3)、萘乙酸(NAA)单独催芽处理烟草种子,在适宜浓度下均能促进种子萌发,其中采用MS培养液+植物生长调节物质配方(1XMS+100 mg/L GA3+2 mg/L NAA)催芽处理的种子在萌发率和幼苗生长状态上表现最好。经其催芽处理后的种子,播种后第2天萌发率达到84%,而未经催芽处理和单独用水催芽处理的种子的萌发率仅为0和22%。播种后两周测量幼苗根长和下胚轴长度,经MS培养液+植物生长调节物质配方催芽处理后的种子幼苗根长和下胚轴长度分别为1.55 cm和0.96 cm,并且已分化出侧根;未经催芽处理的为0.66 cm和0.67 cm,用水催芽处理的为0.88 cm和0.63 cm,均未见侧根分化。     

典型烤烟品种腺毛形态及分泌特性比较分析

为探讨烤烟叶面化学特征及其形成机制,本文以K326、红花大金元、中烟100、翠碧1号、豫烟11等代表性烤烟品种为试验材料,采用超景深显微技术、GC-MS分析检测技术和荧光定量PCR技术,对叶面腺毛形态、叶面化学成分以及腺毛分泌物合成关键基因表达进行了比较分析。结果发现:（1）烤烟腺毛由长柄分泌型腺毛、短柄分泌型腺毛和非分泌保护毛等不同类型组成,翠碧1号和豫烟11中分泌型腺毛含量较高,而中烟100中非分泌型腺毛相对丰富。（2）西柏烷类化合物是烤烟叶面的主要化学成分,以K326中的含量为最高;赖百当类化合物在烤烟中含量极少,但豫烟11中顺冷杉醇和赖百当二醇含量较高。（3）西柏烷类合成酶关键基因CYC和CYP71D16在K326中表达活跃,赖百当合成酶关键基因CPS2在豫烟11中的表达量明显高于其它品种。不同烤烟品种之间叶面腺毛形态、基因表达及分泌物含量所存在的明显差异,可能与品种特色密切相关。      

仿生型信号分子对烟草主要生物碱的抑制作用

用源于取食烟草的寡食性昆虫口腔分泌物的仿生型信号分子(BSM)在不同条件下、对不同类型烟草在打顶后进行涂抹处理,并用HPLC检测BSM处理株和对照株烟草主要生物碱的含量,分析探讨BSM在不同条件下对烟草生物碱的调控作用。结果表明:BSM物质对不同类型烟草打顶后叶片上生物碱的积聚有不同程度的抑制作用。BSM对烤烟9717中降烟碱的影响最大,中部和上部分别降低55.78%和63.40%,上部叶各生物碱降幅均大于中部叶,其中烟碱和总生物碱分别降低25.49%和26.28%。BSM浓度对白肋烟中生物碱的抑制效应也有影响,0.1mol/L的BSM对烟碱的影响最大,中、上部叶的降低率分别达22.99%和42.45%,总生物碱则分别降低22.21%和37.73%;0.2mol/L的BSM可使降烟碱的量显著降低,中部和上部叶分别降低62.94%和58.53%。施氮量对BSM的调控作用也有影响,在高的施氮量(9kgN/667m2)下抑制作用更大,可使K326上部叶总生物碱降低34.76%。     

复合盐处理对不同烤烟品种发芽特性的影响

为了考察烟草品种的耐盐性,筛选出烤烟耐盐品种,以5个烤烟品种(红花大金元、K326、云烟87、云烟97和中烟100)为材料,设置不同质量浓度(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%)的复合盐(NaCl和Na_2SO_4物质的量比为1∶1)处理烟草种子,并测定了不同烟草品种的发芽特性指标。结果表明:(1)低浓度的复合盐溶液可促进部分烤烟品种(云烟87、K326、云烟97、中烟100)的种子萌发,而高浓度的盐处理对供试品种的种子萌发有强烈抑制作用。(2)不同烤烟品种对盐分的耐受力不同。在0.2%~0.6%质量浓度的中低盐度处理下,各品种的发芽指数及活力指数差异不大,云烟97和云烟87的发芽率相对较高,中烟100的发芽势较低,而云烟97则较高;在0.8%和1.0%质量浓度的高盐度处理下,云烟87的各发芽指标表现良好,红花大金元、云烟97次之,中烟100、K326的发芽指数显著下降。     

硫化氢对烟草种子萌发和幼苗生长的影响

为了明确硫化氢(H₂S)对烟草种子萌发和幼苗生长的影响,以烟草品种K326为材料,用不同浓度H₂S浸泡处理后观察种子萌发情况;采用水培法对正常萌发后的烟草幼苗进行不同浓度H₂S、H₂S抑制剂(HA)、H₂S清除剂(HT)以及盐胁迫处理,观察其对烟草幼苗生长的影响。结果表明：与对照相比,低浓度(0.05 mmol/L、0.1 mmol/L)H₂S处理对种子萌发具有促进作用,高浓度(0.25 mmol/L、0.5 mmol/L)H₂S处理明显抑制种子萌发。HA浓度为0.15 mmol/L、HT浓度为0.2mmol/L的处理可显著抑制幼苗的根系生长。0.05 mmol/L的H₂S处理对烟草幼苗生长具有促进作用,同时可以缓解盐胁迫对幼苗生长和根系发育的抑制作用。