幽门螺杆菌黏附素A的原核表达、纯化及其结晶条件搜索

目的原核表达、纯化幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)黏附素A(H.pylori adhesin A,HpaA),并初步搜索其结晶条件。方法采用TMHMM和SignalP-4.1软件预测HpaA蛋白中的跨膜序列和信号肽序列,根据GenBank中登录的编码HpaA的基因序列hp0797去掉预测出的信号肽序列后设计引物,以H.pylori标准株26695基因组为模板,PCR扩增编码HpaA的基因序列,插入原核表达载体pET-22b,构建重组表达质粒pET-22b-HpaA,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG 25℃诱导表达,表达的重组蛋白经亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析进行纯化。将纯化产物浓缩至10 mg/ml,采用结晶搜索试剂盒,通过悬滴汽相扩散法搜索HpaA的结晶条件,并在此基础上配制条件进行优化。结果去掉序列中编码信号肽区域或跨膜结构域的密码子,选择HpaA的36~260位氨基酸进行克隆,构建的重组原核表达质粒pET-22b-HpaA经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白HpaA相对分子质量约27 000,表达量约占菌体总蛋白的10%以上,主要以可溶形式表达,纯化后的纯度可达99%以上。在多种条件下,均有结晶生长,晶体多为薄片状、针状或簇状,在20%PEG3350,0.1 mol/L HEPES(pH 7.0)条件下,晶体形状类似长方体,外形有所改善。结论成功表达了HpaA蛋白,初步掌握其结晶条件,为下一步晶体结构学的研究及其在H.pylori感染与致病中的作用机制奠定了基础。     

幽门螺旋杆菌尿素酶多表位疫苗CTB-UE的生物信息学分析及其表达

目的通过生物信息学软件评价幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶多表位疫苗CTB-UE的抗原结构,并在E.coli中表达、纯化融合蛋白CTB-UE。方法应用生物信息学软件DNAstar、Geno3D、MOE分析Hp尿素酶多表位疫苗CTB-UE的二级结构和三级结构;将人工合成的尿素酶多表位肽基因UE插入含CTB基因的重组质粒p ETC中,构建重组表达质粒p ETCUE,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,通过Ni-NTP镍离子亲和层析纯化重组蛋白CTB-UE,并进行Western blot分析。结果生物信息学软件分析显示,Hp尿素酶多表位疫苗CTB-UE具有合理的结构;重组表达质粒p ETCUE经双酶切和测序鉴定证实,融合基因CTB-UE与设计序列完全一致;表达的融合蛋白CTB-UE相对分子质量约为33 000,主要以包涵体形式表达,表达量占全菌蛋白的22.3%;纯化的融合蛋白CTB-UE纯度达95.6%,可与兔抗Hp多克隆抗体发生特异性结合。结论设计的Hp尿素酶多表位疫苗CTB-UE具有合理的结构,能在E.coli中高效表达,纯化后纯度较高,且具有较强的反应原性,为进一步研究针对尿素酶A、B双亚基的Hp多表位疫苗奠定了基础。     

幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆、表达及鉴定

目的　克隆幽门螺杆菌粘附素基因hpaA ,构建其原核表达系统并鉴定融合蛋白免疫原性。方法　采用PCR技术从幽门螺杆菌总DNA中扩增hpaA基因 ,T -A克隆后测定核苷酸序列 ,构建pET30a的HpaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用IPTG诱导表达 ,Ni2 + 柱纯化后经Westernblot鉴定其免疫原性。结果　所克隆的hpaA基因与报道的相应核苷酸序列同源性为 94 . 8%～ 97. 3% ,氨基酸序列同源性为 94 . 6 %～ 97 .7% ,在 134～ 139位存在一段KRTIQK结构 ,HpaA融合蛋白在pET30a载体中可高效表达 ,经纯化后可获得高纯度的重组蛋白。结论　成功构建HpaA原核表达系统 ,所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性 ,可作为Hp疫苗的候选抗原。     

肺炎链球菌表面蛋白A的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的原核表达、纯化肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,Psp A),并制备多克隆抗体。方法应用ANTHEWIN、DNAstar等分子生物学软件,对Psp A氨基酸序列进行分析,筛选出抗原表位富集区(第33~109个氨基酸),选用原核生物偏爱的密码子优化基因序列,化学合成全新的基因序列pspa,插入质粒p GEX-4T-2和p ET28a(+)中,构建重组表达质粒p GEX-4T-2-pspa和p ET28a(+)-pspa,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。分别纯化带有GST标签和His标签的Psp A重组蛋白GST-Psp A和His-Psp A,以His-Psp A作为免疫原,经背部多点免疫新西兰大耳白兔,间接ELISA法检测血清抗体效价,Western blot法检测血清抗体特异性。结果两种重组表达质粒p GEX-4T-2-pspa和p ET28a(+)-pspa经双酶切鉴定构建正确;表达的两种重组蛋白GST-Psp A和His-Psp A相对分子质量分别约为33 000和18 000,均为可溶性表达,纯化后目的蛋白条带均无降解,纯度约为95%,蛋白浓度分别为2和0.2 mg/ml;制备的兔抗血清效价较高,可达1∶200 000,且特异性较好。结论原核表达并纯化了肺炎链球菌Psp A融合蛋白,并制备了特异性良好的高效价兔抗血清,为下一步建立肺炎链球菌快速检测技术奠定了基础。     

幽门螺杆菌VacA-HpaA融合蛋白的表达及其免疫学特性

目的构建H.pylori细胞空泡毒素VacA与黏附素HpaA融合基因的原核表达载体,诱导其表达融合蛋白,并检测表达产物的抗原性与免疫原性。方法用PCR从pQE30-VacA质粒扩增出VacA基因,克隆至pTrc99A-HpaA载体中,与HpaA基因融合后,插入原核表达载体pQE30中,再将pQE30-VacA-HpaA转化入大肠杆菌DH5α,诱导表达并提纯融合蛋白,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达,Bradford法检测融合蛋白含量,Western blot鉴定特异性。将融合蛋白免疫家兔,得到多克隆抗血清,用双向免疫扩散和ELISA检测免疫原性。结果SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量约为65000,表达量在35%以上,主要以包涵体形式表达,蛋白含量为0·72mg/ml,具有良好的VacA和HpaA抗原性与免疫原性。结论VacA-HpaA融合蛋白已成功表达,且具有良好的免疫原性,为进一步研究制备H.pylori疫苗创造了条件。     

重组人脂蛋白相关磷脂酶A2的原核表达及其纯化

目的原核表达并纯化重组人脂蛋白相关磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2,LP-PLA2),并初步确定其保存条件。方法将重组表达菌pCold TF-LP-PLA2-BL21(DE3)和pET28-HRV 3C-BL21(DE3)分别经IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经SDS-PAGE鉴定后,经Ni-Sepharose 6FF金属螯合层析粗提重组蛋白,经HRV 3C蛋白酶酶切去除融合标签后,用Blue Sepharose誖6 Fast Flow(蓝胶)染料亲和层析及HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR分子筛进行分离纯化;通过人LP-PLA2临床检测金标准ELISA试剂盒验证重组蛋白;将重组LP-PLA2置于含10 mmol/L CHAPS和0.5 mmol/L PMSF的PBS溶液中,分别于4℃、室温、37℃保存1周以及-20、-80℃冻存4个月后,确立重组蛋白的保存条件。结果重组LP-PLA2相对分子质量约100 000,以可溶性形式表达,包涵体无表达;纯化后的重组LP-PLA2蛋白含量为3.68 mg/ml,蛋白回收率为21%,纯度可达95%,可被ELISA试剂盒识别,且具有良好的线性关系(R2=0.996 4);重组LP-PLA2于4℃保存1周,-20、-80℃冻存4个月,均无降解现象。结论成功表达、纯化了重组LP-PLA2,并初步确定了其保存条件。     

百日咳毒素、丝状血凝素和黏附素的纯化

目的采用新型层析介质对无细胞百日咳疫苗百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamen-toushemagglutinin,FHA)和黏附素(pertactin,PRN)3组分进行分离纯化。方法调整PT和FHA发酵液上清的pH值和电导后,PT经Capto SP ImpRes和Capto MMC进行两步层析,FHA经Capto SP ImpRes进行一步层析;PRN热处理原液经Capto Adhere和Capto SP ImpRes进行两步层析。纯化产物经4%～12%NuPAGE进行鉴定,ImageQ分析纯度;LC-MASS(Thermo LTQ Velas)进行蛋白质的质谱检测;PT和FHA经BiaCore T200进行定量分析,并计算各步回收率。结果纯化后,无细胞百日咳疫苗3组分纯度均达95%以上;PT和FHA的总回收率均在30%左右;电泳图谱上的各组分条带经LC-MASS鉴定,均与Uniprot Bordetella pertussis数据库数据高度同源。结论采用新型层析介质有效纯化了无细胞百日咳疫苗PT、FHA和PRN,提高了抗原纯度,大大缩短了生产时间。     

重组幽门螺杆菌粘附素的纯化工艺

目的纯化大肠杆菌表达的重组幽门螺杆菌粘附素。方法将表达HpaA蛋白的工程菌经高压均质机破菌获得包涵体,经洗涤、变性、复性,Q Sepharose High Performance阴离子交换层析和亲和层析分离纯化。采用SDS-PAGE和HPLC检测纯度,用Western blot检测其抗原性。结果纯化后HpaA蛋白纯度高达95％以上,具有良好的抗原性。结论建立了从包涵体中获得高纯度HpaA纯化工艺,为进一步的研究打下了基础。     

肺炎球菌表面黏附素A和表面膜蛋白A的研究进展

肺炎球菌表面黏附素A(Pneumococcal surface adhesin A,PsaA)为脂蛋白,属于ABC型转运蛋白复合物(ATPbinding cassette transporter),存在于各型肺炎球菌中,是其重要的毒力因子和黏附因子,编码基因高度保守,具有转运Mn2+及黏附功能。肺炎球菌表面膜蛋白A(Pneumococcal surface protein A,PspA)是与其毒力相关的一种重要的表面抗原,在目前发现的所有临床分离的肺炎球菌中几乎均存在,其编码基因变异性较大。PsaA和PspA均为肺炎球菌的保护性抗原和新型肺炎球菌疫苗的研发热点之一。本文就这两种蛋白的结构、功能、免疫学特性及应用的研究进展作一综述。     

抗幽门螺杆菌黏附素蛋黄抗体与HP1188蛋黄抗体在小鼠体内防治幽门螺杆菌感染的比较

目的比较抗幽门螺杆菌黏附素(Helicobacter pylori adhesin A,HpaA)蛋黄抗体(immunoglobulin yolk,IgY)(HpaA-IgY)及抗H.pylori HP1188 IgY(HP1188-IgY)在BALB/c小鼠体内预防和治疗H.pylori感染的最低浓度,并评价治疗效果。方法 Western blot鉴定HpaA-IgY及HP1188-IgY抗原特异性。制备1×109 CFU/mL H.pylori菌液,将BALB/c小鼠随机分为阳性对照组(灌喂H.pylori菌液0.5 mL)、阴性对照组(以布氏肉汤替换H.pylori)、预防组(先灌喂1、3、5 mg/mL HpaA-IgY或HP1188-IgY及PBS各1 mL,再灌喂H.pylori菌液0.5 mL)、治疗组(先灌喂H.pylori菌液0.5 mL,再灌喂1、3、5 mg/mL HpaA-IgY或HP1188-IgY及PBS各1 mL)。处理完成后,取各组小鼠胃组织进行H.pylori培养、快速尿素酶试验(rapid urease test,RUT)及组织学检查,观察H.pyl...     

人血管生成抑制素基因的克隆、表达及纯化

目的 构建携带人血管生成抑制素基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的血管生成抑制素。方法 用PCR法从人纤溶酶原cDNA中扩增出Kringle 1-3基因,克隆入pET21a(+)载体中,在大肠杆菌BL 21中表达,表达产物经亲和层析纯化。结果 所构建的原核表达载体为高效表达系统,所表达的产物经层析纯化后可获得重组人血管生成抑制素。结论 可获得大量纯化人血管生成抑制素,为进一步临床应用奠定基础。     

A群链球菌四价重组蛋白的表达、纯化及其免疫原性

目的原核表达并纯化A群链球菌M1、3、6、18型四价重组蛋白,并检测其免疫原性。方法以克隆质粒pUC18-Strep4为模板,PCR法扩增四价重组蛋白基因,克隆至表达载体pQE30中,构建重组表达质粒,转化E.coilM15,筛选阳性克隆,IPTG诱导表达。采用Ni2+-NTA凝胶亲和层析纯化重组蛋白。以该蛋白免疫家兔,ELISA法检测血清抗体滴度;间接免疫荧光法(IFA)检测A群链球菌型特异性抗体;体外杀菌试验检测杀菌抗体活性。结果四价重组蛋白表达质粒pQE30-Strep4经双酶切和测序,证明构建正确。重组蛋白相对分子质量与预期相符,表达量约占菌体总蛋白的30%,为可溶性表达。纯化后蛋白纯度可达90%以上,并可诱导家兔产生高滴度的M1、3、6型特异性杀菌抗体。结论已成功表达了A群链球菌四价重组蛋白,纯化后的蛋白可诱导家兔产生针对A群链球菌M1、3、6三个血清型菌株的特异性杀菌抗体。     

人Bik基因的克隆、表达与纯化

目的克隆人Bik基因,并进行表达及纯化。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增Bik基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物进行GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到483bp的DNA片段,重组质粒pGEX-6p-1-Bik经酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的重组蛋白占菌体总蛋白的38%,纯化后蛋白纯度达96%。结论已成功克隆并利用原核表达系统表达了人Bik基因,为进一步研究Bik蛋白结构和功能奠定了基础。     

百日咳黏附素的原核表达及其单克隆抗体的制备

目的原核表达百日咳黏附素(Pertactin,Prn),并制备抗Prn单克隆抗体。方法从无细胞百日咳疫苗生产菌株CS株基因组DNA中克隆Prn基因,插入表达载体pQE-30中,构建重组表达质粒pQE-30-Prn,转化E.coli M15,IPTG诱导表达。表达的重组Prn蛋白经阳、阴离子交换层析纯化后,采用Western blot和ELISA法鉴定重组Prn蛋白的反应原性。以纯化的重组Prn蛋白为免疫原,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并对制备的单抗进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切和测序鉴定构建正确;表达的重组Prn蛋白相对分子质量约为69 000,主要以包涵体形式表达;纯化的重组Prn蛋白的纯度达95%以上,产量可达25 mg/L,能与不同来源的抗Prn-Ab血清特异性结合。获得2株分泌抗Prn单抗的杂交瘤细胞株,分泌的单抗均为IgG1类,轻链类型均为κ,效价均达1∶105以上,并能特异性识别Prn蛋白,而与百日咳杆菌其他抗原蛋白无交叉反应。结论原核表达、纯化了重组Prn蛋白,并制备了2株效价高、特异性强的单抗,为无细胞百日咳疫苗的质量控制及百日咳杆菌致病机制的研究提供了材料。     

多杀菌素A的纯化方法研究

采用柱层析的方法从多杀菌素原料药中提取多杀菌素A和D的混合物(85∶15),然后采用重结晶的方法从多杀菌素A和D的混合物中提取多杀菌素A。多杀菌素A提取的优化条件为:甲醇为重结晶溶剂,多杀菌素A和D混合物质量与甲醇体积比为0.1 g/mL。在该条件下多杀菌素A的重结晶收率为64%,纯度为98.7%。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的可溶性表达及纯化条件的优化

以人胎盘cDNA为模板,通过PCR技术特异性扩增出约500bp的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的可溶性片段(Soluble TNF-related apoptosis-inducing ligand,sTRAIL)基因。经双酶切后插入到原核表达载体pTASH的Eco RⅠ和HindⅢ之间,转化大肠杆菌JM109菌株。宿主菌主要以可溶形式表达sTRAIL,可溶形式sTRAIL蛋白达到60%。采用两种方法纯化sTRAIL,比较两者对目的蛋白的影响。SDS-PAGE结果显示,破碎上清经过SP-Sepharose FF和RP-HPLC两步纯化后,纯化的蛋白为19kD单一条带,纯度达98%以上;而经过SP-Sepharose FF和Q-Sepharose FF两步纯化的蛋白,纯度只达到93%。Western blot鉴定表明纯化产物为sTRAIL。用HepG2细胞测定sTRAIL的生物学活性,发现重组蛋白在体外能明显诱导肿瘤细胞凋亡。     

人肌红蛋白基因的克隆、表达及其抗体制备

目的克隆、表达人肌红蛋白基因,并制备人肌红蛋白多克隆抗体。方法应用RT-PCR方法从人骨骼肌总RNA中扩增肌红蛋白基因(hMb)编码序列,克隆入原核表达载体pRSETc中,并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达。表达产物经亲和层析和凝胶层析纯化。纯化蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,并用Westernblot检测其特异性。结果测序表明RT-PCR所得的肌红蛋白基因hMb序列与GenBank(NM203377)中报道的序列一致。该基因在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化,获得电泳纯的蛋白。重组人肌红蛋白的表达水平达12.8%。每升发酵液中可获得纯化的目的蛋白6.438mg。Western blot分析表明该蛋白为融合有6个His的hMb蛋白。ELISA法测得抗体效价为1∶12800,Western blot证实其具有较好的特异性。结论已成功克隆人肌红蛋白基因,在大肠杆菌中获得了可溶性表达,并制备了抗人肌红蛋白的多克隆抗体。     

克罗诺杆菌IbpA蛋白的表达、纯化及其免疫原性

目的表达并纯化克罗诺杆菌Ibp A蛋白,检测其免疫原性。方法提取克罗诺杆菌菌株CMCC45402的基因组,经PCR获得ibp A基因片段,连接至表达载体p ET30a(+),构建重组质粒p ET30a(+)-ibp A。将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株,用不同终浓度的IPTG(0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mmol/L)分别于30和37℃诱导表达不同时间(2.5、4、5 h),进行SDS-PAGE及Western blot分析。表达产物经Ni凝胶亲和层析纯化后,经腹腔免疫BALB/c小鼠,每2周加强免疫1次,共2次,末次免疫1周后,经小鼠眼球采血,分离血清,ELISA法检测血清效价。同时检测热激对Ibp A蛋白表达水平的影响。结果重组质粒p ET30a(+)-ibp A经双酶切鉴定证明构建正确。最佳IPTG诱导终浓度为0.2 mmol/L,最佳诱导温度为30℃,最佳诱导时间为5 h。诱导表达产物相对分子质量约24 000,主要以可溶性形式存在,可与抗His-Tag单克隆抗体特异性结合;纯化蛋白的纯度可达96%;小鼠免疫血清效价均可达1:25 000以上。用小鼠血清可检测到热激后克罗诺杆菌Ibp A的表达。结论本实验成功构建了ibp A基因的高效原核表达系统,获得了高纯度重组蛋白,制备了高效价抗血清,为后续ibp A基因和克罗诺杆菌热抗性关系的研究奠定了基础。     

重组李斯特菌细胞溶解素LLO蛋白表达纯化及溶血活性鉴定

目的克隆单核细胞增生症李斯特菌细胞溶解素O(LLO)基因hlyA,构建其原核表达系统,鉴定融合蛋白LLO的抗原性和溶血活性。方法采用PCR技术从Lm总DNA中扩增hlyA基因,与基因库中其它9株hlyA基因序列相比较。用pET30a载体构建LLO原核表达质粒pET30ahlyA,在E.coliBL21(DE3)宿主菌中用IPTG诱导表达,Ni2+柱纯化后,Westernblot鉴定其抗原性。用人红细胞检测溶血活性。结果所克隆的hlyA基因PEST样结构与GenBank上9个菌株的相应氨基酸序列相比,最多有3个氨基酸替代。LLO融合蛋白在大肠杆菌中可高效表达,纯化后获得高纯度的重组蛋白,具有较高的抗原性。在酸性pH5.5条件下,LLO溶血活性最大为1.41×104HU/mg。结论已成功构建LLO原核表达系统,所表达的蛋白具有较高的抗原性和溶血活性。     

肺炎支原体P30黏附素基因的原核表达及初步应用

目的构建肺炎支原体P30黏附素基因原核表达质粒并进行表达;以纯化的rP30蛋白为抗原,建立间接斑点-ELISA(dolt-ELISA)法,用于评价rP30蛋白在肺炎支原体(MP)感染诊断中的价值。方法以MP基因组DNA为模板,PCR扩增P30基因,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)/P30,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;Western blot检测表达产物的反应原性;以纯化复性后的rP30蛋白为抗原,建立间接dolt-ELISA法,对40份临床疑似肺炎支原体感染患儿血清进行检测。结果表达的rP30蛋白相对分子质量约为52 000,表达量约占菌体总蛋白的13%,主要以包涵体形式存在,经Ni2+-NTA树脂纯化后,纯度约为93%。Western blot证实,rP30蛋白可与阳性肺炎支原体感染患儿血清发生特异性反应。用rP30蛋白建立的间接dolt-ELISA法,其敏感性和特异性分别为95.45%和72.22%,准确性为85%。结论已成功地在大肠杆菌中表达了rP30蛋白,为MP感染的快速诊断提供了一种新的方法,也为进一步探讨P30蛋白的功能及其在MP感染发病机制中的作用奠定了基础。