天花粉蛋白的定点突变及聚乙二醇修饰

目的对天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)进行定点突变及聚乙二醇(PEG)修饰,并对修饰产物进行DNA酶活性分析。方法选择TCS分子上可能的抗原决定簇位点(YFF81-83和KR173-174)进行定点突变,将所构建的两个突变体(TCSYFF81-83ACS和TCSKR173-174CG)在大肠杆菌中表达,并纯化表达产物。通过第82位和173位引入的半胱氨酸残基,分别对突变体蛋白进行PEG定点修饰。通过与突变型TCS比较,分析两个PEG修饰型TCS的DNA酶活性。结果突变的TCS经酶切鉴定及测序分析,证明质粒构建正确,表达的目的蛋白相对分子质量约为30000,经PEG修饰后,相对分子质量约为40000。初步分析显示,与突变型TCS相比,所构建的两个PEG修饰型TCS也显示出类似DNA酶活性。结论成功进行了TCS的定点突变及PEG修饰,为基因工程及化学修饰方法改造TCS提供了一条可行的途径。     

谷氨酰胺转胺酶基因的结构分析及定点突变

根据分离得到的吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因,预测其三维结构,确定其酶活中心,并构建定点突变体。用PCR扩增谷氨酰胺转胺酶基因,通过SWISS-MODEL在线预测三维结构,找到酶活中心,确定突变位点,将361位的组氨酸(CAC)突变成赖氨酸(AAA),将突变后的基因片段连接到pET-22b(+)上得到重组质粒pET-22b(+)-MTG,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。结果显示,通过对比已有的三维结构模型,找到了酶活中心,并通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术成功构建了突变体。     

黄色短杆菌ilvN基因定点突变和ilvBN、ilvC串联表达对L-缬氨酸产量的影响

由ilvBN、ilvC基因编码的乙酰羟酸合成酶（AHAS）和乙酰羟酸异构还原酶（AHAIR）是L-缬氨酸合成途径的两个关键酶。本实验以黄色短杆菌Brevibacterium flavum MD515为出发菌株,通过PCR技术扩增其ilvBN和ilvC基因,对调节亚基ilvN进行定点突变,获得抗反馈抑制突变型编码基因ilvBN^rC;然后将其插入穿梭表达载体pZ8-1中,构建串联表达质粒pZ8-1-ilvBN^rC并转化出发菌株,筛选获得工程菌株B.flavum MD515/pZ8-1-ilvBN^rC。摇瓶发酵该工程菌株L-缬氨酸产量达29.5 g·L^-1,较出发菌株提高27.7%,同时生长速度和生物量也比出发菌株有所提高,丙氨酸含量降低,L-亮氨酸及L-异亮氨酸含量提高。在30 L发酵罐连续补料发酵60 h后L-缬氨酸产量达61.7 g·L^-1,糖酸转化率为39.2%。菌株MD515/pZ8-1-ilvBN^rC发酵液透光率较出发菌株高且蛋白含量低,这些特性有利于发酵液后期的分离提取。     

人内皮抑素基因的定点突变及其在大肠杆菌中的表达

目的对人内皮抑素(hES)基因进行定点突变,提高其在大肠杆菌中的可溶性表达量。方法根据Internet网站提供的关于hES的结构信息及其结构与功能方面的研究文献,设计突变位点;利用生物信息学的相关网站,对hES突变体进行结构预测,验证突变位点设计的合理性;采用重叠延伸PCR方法进行hES基因的定点突变,并将突变基因和未突变基因分别亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,在大肠杆菌中进行融合表达,比较突变前后目的蛋白的可溶性表达量。结果三级结构预测结果表明突变位点设计合理,序列分析结果表明实现了hES基因的定点突变。突变基因的表达产物中,可溶性部分约占总表达量的40%,而未突变基因的表达产物几乎全部为包涵体。结论已成功对hES基因进行了定点突变,突变后的hES可溶性表达量得到了提高。     

漆酶和木聚糖酶预处理对麦草浆漂白性能的影响

生物漂白主要目的在于通过对纸浆预处理,减少后续漂白时漂剂用量,降低漂白废水对环境污染,同时改善纸浆性能。通过漆酶/木聚糖酶体系(LXS)和重组木聚糖酶(X)对麦草浆预处理,比较它们对浆料脱木素能力和漂白性能的影响。结果表明:麦草浆经过两种酶预处理后,都能降低浆料卡伯值,而漆酶处理后降低的幅度更大,与原浆和木聚糖酶处理浆相比分别降低32.64%和6.47%,但是在木聚糖酶处理液中能检测到更多的还原糖;两种酶处理浆在后续漂白中漂白至与对照浆相近白度时均能节省50%漂剂用量,且能改善浆料物理强度;比较两种酶对浆料漂白性能的影响,则是在相同漂剂用量时木聚糖酶漂白浆的白度稍高,而浆料得率和强度稍低;两种酶处理浆料的纤维素结晶度测定表明酶处理前后浆料的纤维素的结晶结构没有明显的变化,而且纤维素的结晶度都有不同程度的提高。通过扫描电镜观察以及X射线光电子能谱(XPS)分析,从理论上说明两者脱木素的差异。     

稀土氧化物对LLDPE热氧稳定性的影响

通过热失重分析不同稀土氧化物对LLDPE热氧分解行为的影响,并采用氧化诱导期、转矩流变分析方法研究了稀土氧化镧对LLDPE热氧分解行为的影响机理.结果表明:LLDPE的热氧分解温度在添加Eu2O3、Gd2O3、La2O3、Nd2O3、Sm2O3、Yb4O7、Pr6O11、Y2O3、Dy2O3得到提高,CeO2则对LLDPE的起始分解温度没有影响,而加入TbO2、Er2O3、Ho2O3则使LLDPE的起始分解温度降低.稀土氧化物对LLDPE的热氧稳定的影响可能与稀土元素与氧的配位作用有关,部分稀土氧化物可能通过与氧的配位作用而减缓了氧分子在LLDPE热氧化形成的交联结构中的扩散速度,从而提高了LLDPE热氧稳定性.     

产气荚膜梭菌β_2毒素基因的克隆及定点突变

目的　克隆产气荚膜梭菌 β2 毒素基因 ,并选择可能影响其生物活性的氨基酸的相关碱基位点进行定点突变 ,构建β2 毒素基因的突变体。方法　利用PCR从C型产气荚膜梭菌基因组DNA中 ,扩增出约 0 7kb的基因 ,将其克隆至pGEM T载体上。经GOLDKEY软件分析抗原表位 ,PCR定点突变技术进行 2 34位半胱氨酸→苷氨酸的定点突变。结果　β2 毒素基因核苷酸序列与报道的一致 ,其突变基因 6 99位核苷酸由T→G。结论　已成功克隆了 β2 毒素基因 ,并准确实施了预期定点突变。     

定点突变提高菜豆环氧水解酶的对映选择性

为了提高菜豆环氧水解酶（PvEH1）催化对氯环氧苯乙烷（pCSO）的对映选择性,利用定点突变构建了PvEH1^W102L、PvEH1^P137K及PvEH1^I151V三种突变体,分别研究了突变体全细胞动力学拆分rac-pCSO的催化特性,优化了PvEH1^W102L动力学拆分rac-pCSO的初始底物浓度及反应时间,通过分子模拟分析了PvEH1^W102L对映选择性提高的机理。结果表明,最优突变体PvEH1^W102L的E值为25.5,相对酶活为212.6%,分别是PvEH1的11.6倍与2.1倍;PvEH1^W102L动力学拆分150 mmol·L^-1 rac-pCSO,反应4 h后,可获得（R）-pCSO（产率为45.62%,ee_s为96.30%）和（R）-对氯苯基乙二醇（产率为50.91%,ee_p为90.26%）。分子模拟结果分析表明,PvEH1的102位色氨酸（W）突变为亮氨酸（L）降低了酶与（R）-pCSO的结合能力,从而提高了PvEH1^W102L对pCSO的对映选择性。     

氧化物的性能对PVC热稳定性的影响

通过对氧化物的粒度分布和比表面积的测定研究了氧化物表面性能对PVC热稳定性的影响。结果发现,氧化物的粒径大小对PVC动态热稳定性的影响具有决定性的影响,而氧化物的比表面积决定PVC静态热稳定性。     

低聚合度木聚糖对木聚糖酶合成的影响

研究了木聚糖的聚合度和添加黄豆粉对里氏木霉合成木聚糖酶的影响,并以纯化木聚糖酶水解木聚糖。研究结果表明:木聚糖经酶水解后平均聚合度降低54%,戊聚糖含量为75.4%。采用低聚合度木聚糖为底物碳源和添加黄豆粉都可提高产酶效果。以12g/L低聚合度木聚糖添加2g/L黄豆粉,培养3d后木聚糖酶活力可达到113IU/mL,提高49.3%。通过对木聚糖酶进行纯化处理可以有效除去β 木糖苷酶。以体积分数10%的木聚糖酶水解35g/L木聚糖3h后,低聚木糖得率达到35.5%,而木糖得率仅为1.5%,低聚木糖与总糖的比值达到95.8%,随着酶解时间的延长,低聚木糖不会被降解。     

纳米水滑石对PVC热稳定性和烟密度的影响

研究了纳米水滑石（nano—HT）对聚氯乙烯（PVC）热稳定性和燃烧烟密度的影响。采用原位聚合并熔融加工得到PVC／纳米水滑石复合材料，纳米水滑石在PVC基体中分散均匀，分散尺度小于100nm。随着纳米水滑石含量增加，PVC／nano—HT复合材料的热分解温度和刚果红变色时间增加，热稳定性提高；分散均匀的纳米水滑石对PVC具有良好的抑烟效果，当PVC／nano—HT复合材料中纳米水滑石含量为1．25％和2．5％时，最大烟密度分别比空白PVC低40％和60％左右。     

pH值对木聚糖酶预处理麦草浆的影响

利用木聚糖酶对麦草浆进行预处理,可有效降低后续漂白时的有效氯用量.在不同的pH值影响下,酶与底物均有不同的解离状态,最终影响酶活力.结果表明:经过不同pH值下木聚糖酶的预处理,综合考虑纸浆的白度、卡伯值、强度等因素,最适的木聚糖酶预处理麦草浆的pH值为6.0.     

真空恒温热处理对PMMA热稳定性的影响

通过热重分析研究了270℃真空热处理条件下,不同热处理时间后聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)的热降解行为,并通过Flynn和Flynn-Wall-Ozawa法求取了这些PMMA样品的起始热分解活化能和热降解过程中不同质量损失率时的活化能。结果表明,在真空热处理过程中,只有具有不饱和末端的PMMA能被降解,而具有饱和末端的PMMA是热稳定的,热处理时间对PMMA的相对分子质量没有影响;通过热处理降解了PMMA中具有不饱和末端的分子链能够提高PMMA的低温热稳定性,热处理时间越长,PMMA中具有不饱和末端分子链的相对比例越低,PMMA的热稳定性越好;降低具有末端不饱和结构PMMA分子链的相对比例能够提高PMMA的起始热降解活化能和低温热降解活化能,但对热降解后期的热降解活化能没有影响。     

木聚糖成分对木聚糖酶合成的影响

分别以两种含有不同组成的木聚糖为碳原进行产酶研究,结果发现木聚精成分对里氏木霉产木聚糖酶的效果具有重大影响。实验结果表明,用全组分的木聚糖（即用酒精等有机溶剂沉淀下来的木聚糖）诱导合成本聚糖酶的效果要比仅以水不溶性高聚合度木聚糖的效果好。当以全组分的木聚糖为碳源产酶时,不仅产酶周期缩短（仅需2．5d）,而且有利于提高木聚糖酶活力,酶活力、比活力、酶得率及酶产率分别达到34．27IU／mL、78．21;IU／g蛋白质、4895．7IU／g木聚糖和13708．0IU／L·d,酶活力和酶产率分别是以水不溶性木聚糖为碳源时的2．7倍和3．3倍。     

耦合末端盐桥与定点突变的重组腈水合酶催化动力学

双亚基腈水合酶是催化丙烯腈水合生产丙烯酰胺的重要工业酶。通过Discovery Studio 2.5软件对C-末端盐桥耦合定点突变改造的耐热型基因重组腈水合酶NHaseM-TH-SBM(S344K-S346K-L347E-N362S-435DT436(+))进行盐桥网络分析,发现其全局盐桥总数有所下降,但双亚基界面间盐桥数量提高到7个。在重组大肠杆菌中表达了原腈水合酶NHaseM-TH(TH)、盐桥突变酶NHaseM-TH-SB(SB)和盐桥耦合定点突变的重组酶NHaseM-TH-SBM(SBM),研究了3种酶的催化反应动力学和失活动力学。结果表明,SBM的腈水合酶活性为543.9 U·mg?1,比TH提高了31.0%;其米氏方程催化速率常数Kcat比TH提高了20%。SBM的表观失活常数KD在25~42℃范围内均明显低于对照TH,在42℃时为TH的68.0%,显示了良好的热稳定性。SBM是活性和稳定性同时提高的重组腈水合酶。     

基于脯氨酸理论提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A的热稳定性

以枯草芽孢杆菌脂肪酶A(LipA)为研究对象,根据从RCSB数据库中获取的晶体结构,采用分子动力学模拟和分子生物学实验相结合的方法进行脂肪酶热稳定性位点突变的理性设计。首先,利用分子动力学模拟获得晶体结构中柔性较高的Loop区域;进而,结合"脯氨酸理论",将位于该区域附近的Gly残基突变为Pro,分析引入Pro突变对LipA热稳定性的影响,筛选得到Gly52和Gly158两个突变位点;最后,通过定点突变操作对突变株LipAG52P和LipAG158P进行热稳定性实验验证。结果显示,突变株LipAG52P、LipAG158P的比活力分别是野生型LipA的5.6倍和2.7倍,Tm值分别提高了15℃和7℃,催化效率分别提高了85%和22%。     

耦合末端盐桥与定点突变的重组腈水合酶催化动力学

双亚基腈水合酶是催化丙烯腈水合生产丙烯酰胺的重要工业酶。通过Discovery Studio 2.5软件对C-末端盐桥耦合定点突变改造的耐热型基因重组腈水合酶NHase^M-TH-SB^M（S344K-S346K-L347E-N362S-435DT436（+））进行盐桥网络分析,发现其全局盐桥总数有所下降,但双亚基界面间盐桥数量提高到7个。在重组大肠杆菌中表达了原腈水合酶NHase^M-TH（TH）、盐桥突变酶NHase^M-TH-SB（SB）和盐桥耦合定点突变的重组酶NHase^M-TH-SB^M（SB^M）,研究了3种酶的催化反应动力学和失活动力学。结果表明,SB^M的腈水合酶活性为543.9 U·mg^-1,比TH提高了31.0%;其米氏方程催化速率常数K_cat比TH提高了20%。SB^M的表观失活常数K_D在25～42℃范围内均明显低于对照TH,在42℃时为TH的68.0%,显示了良好的热稳定性。SB^M是活性和稳定性同时提高的重组腈水合酶。     

法氏囊病毒B87株A节段cDNA定点突变及真核表达载体的构建

<正>分子病毒学研究领域中的反向遗传操作技术(reverse genetics),或被称为病毒拯救(the rescue of virus)技术,解决了RNA病毒基因组难以操作这一困扰研究者多年的难题。通过对病毒在cDNA分子水平上的改造,如基因突变、缺失、插入等,可对RNA病毒的基因复制与表达调控机理、病毒与宿主间的相互作用关系以及新型疫苗开发等深入研究。本文     

添加剂对PVC热稳定性和阻燃抑烟性能影响的机理分析

分析了常见添加剂对PVC在高温条件下的热稳定性、HCl的释放、阻燃性、抑烟性和燃烧毒性等的作用机理,并指出:应加强添加剂存在条件下PVC在高温和火灾条件下氯代二恶英和多氯代二苯并呋喃的形成与释放以及金属化合物存在形式等方面的研究。     

锌皂及其对PVC热稳定性的研究

通过制备马来酸锌、乙二胺四乙酸锌、乳酸锌、甘氨酸锌、邻氨基苯甲酸锌等一系列锌盐与硬酯酸镧复配,采用刚果红试纸法与热老化箱法进行检测。研究了不同锌皂与硬脂酸镧复配后的热稳定性优劣。结果发现所采用的热稳定剂体系中,以邻氨基苯甲酸锌的热稳定性效果最好。