甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞系W2上的适应性

目的研究甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞Walvax-2(W2)上的传代适应性,并确定其在W2细胞上培养的最适条件。方法将甲肝病毒YN5株P23代采用混合吸附的方式接种于T225细胞培养瓶,连续传至30代,检测各代次YN5D株病毒的抗原滴度及感染性滴度;将甲肝病毒YN5D株P29代以不同的MOI接种W2细胞,以最佳MOI接种细胞,确定最佳收毒时间;建立甲肝病毒YN5D株三级种子库,并进行检定。结果甲肝病毒YN5株连续传至30代,抗原滴度及感染性滴度均保持在10 240 EU/mL和7.00 lgCCID_(50)/mL以上;当接毒比例为0.5 MOI时,抗原滴度及感染性滴度均达到最高;当培养至24~28 d时,抗原滴度及感染性滴度均达到最高,分别为2 560 EU/mL和7.24 lgCCID_(50)/mL。三级毒种库各项检定结果均符合《中国药典》三部(2015版)要求。结论确定了甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞系W2上的传代适应性,并优化了细胞工厂的培养条件,为人二倍体甲肝疫苗临床申报样品的制备工艺奠定了基础。     

甲型肝炎病毒Js-4株经人二倍体细胞传代后的核苷酸序列分析

目的分析甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)Js-4株经人二倍体细胞MRC-5传代后的核苷酸序列变异情况。方法将HAV Js-4株经Vero细胞适应14代获得的原始株Js-4-V14经人二倍体细胞MRC-5于35℃连续适应培养15代,取其中8个适应株(Js-4-M2、Js-4-M3、Js-4-M4、Js-4-M5、Js-4-M10、Js-4-M12、Js-4-M14、Js-4-M15)及原始株,提取病毒基因组RNA,通过RT-PCR扩增病毒全基因组,采用生物信息学软件DNAstar Lasergene 7进行序列分析。结果 8个适应株全基因组与Js-4-V14株的核苷酸序列同源性在99.8%～100.0%之间;第5代适应株在5′-NCR(101～200 bp)发生较大变异,表现为105～157 bp缺失,之后该突变稳定遗传;第10、12、14、15代适应株在2A(3 012～3 210 bp)区段3 122位点发生点突变;8个适应株和Js-4-V14毒株与野毒株HM175为同一基因亚型,均为IB型;9个毒株的主要抗原位点与野生株HM175完全一致。结论 HAV Js-4-V14株在MRC-5细胞传代适应过程中,主要抗原位点未发生突变,其与细胞适应性和病毒增殖有关的基因在传代早期已经变异,传代后期这些变异保持相对稳定。     

甲型肝炎病毒吕8株的快速适应性培养

用12天35℃初步适应培育出一株在KMB17细胞稳定传代、感染性滴度高、增殖周期短的HAV适应株LU8株，其感染性滴度为108．33TCID50／ml，抗原滴度为1：1024，一步生长曲线试验和免疫电镜观察结果表明12天为该株病毒增殖高峰。LUB株和H2减毒株HAV经纯化和灭活后接种豚鼠，第一次接种后4周血清HAV抗体均阳转，第二次接种后滴度为1：13．5和1：4．8（GMT），第三次接种后滴度增至1：16和1：8。提示LUB株抗原性较H2株强。     

SARS-CoV-2收获液滴度稳定性及灭活动力学分析

目的 对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)收获液在2～8℃环境下的滴度稳定性及β-丙内酯灭活剂对病毒的灭活效果进行研究。方法 将3批(批号：202111001、202111002和202111003)SARS-CoV-2收获液于2～8℃放置12 d，每隔3 d(0、3、6、9、12 d)取样，采用Karber法检测病毒滴度；2～8℃过夜平衡的3批病毒收获液按1∶4 000的体积分数加入β-丙内酯进行灭活，在不同的灭活时间点(0、0.5、1、1.5、2、3、4、8、16、24 h)取样检测病毒滴度，取灭活8.0、16、24 h的病毒液进行灭活验证，取灭活24 h的病毒灭活液进行透射电镜观察。结果 2～8℃环境下，SARS-CoV-2的滴度随放置时间的延长不断降低，0～3 d滴度下降不明显，第12天滴度由最初的7.75、6和7.5 lgCCID₅₀/mL降至5.75、4.625和6.25 lgCCID₅₀/mL，表明2～8℃环境下病毒...     

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗毒种的遗传稳定性

目的分析Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivated poliomyelitis vaccine,sabin strain,s IPV)毒种(亚主种子、工作种子)及疫苗代次病毒(SO+4)的遗传稳定性。方法比较疫苗株SabinⅠ、Ⅱ型及PfizerⅢ型亚主种子、工作种子及疫苗代次病毒的感染性滴度及D抗原含量的变化情况,并对上述病毒进行全基因组测序。结果各代次Sabin株病毒滴度均维持在7.62~8.62 lg CCID50/ml,D抗原含量均维持在30~128 DU/ml。与Gen Bank上登录的SabinⅠ(AY184219.1)、Ⅱ(AY184220.1)、Ⅲ型(AY184221.1)减毒株原始种子(SO)基因序列相比,Sabin株亚主种子(SO+2)、工作种子(SO+3)及疫苗代次病毒(SO+4)均未出现碱基突变。结论 s IPV毒种及疫苗代次病毒的全基因序列与原始种子相比,均未发生变化,毒力均一,遗传性状方面保持了较好的稳定性。     

水痘-带状疱疹病毒Oka株在人二倍体细胞株SV-1上的遗传稳定性及基因序列差异位点分析

目的研究水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)Oka株在人二倍体细胞株SV-1上的遗传稳定性,并对不同代次毒株进行全基因测序及差异位点分析。方法将VZV Oka株在SV-1细胞株上连续传至48代,检测病毒滴度。对VZV Oka株33、35、38、39及48代病毒进行全基因测序,应用DNASTAR.Lasergene.v 7.1软件进行数据的拼接及序列分析。结果 VZV Oka株在SV-1细胞上连续传代获得的33~48代病毒滴度在4.000~4.625 lg CCID50/ml之间,病毒滴度的算数平均值为4.292 lg CCID50/ml;VZV Oka株基因组全长125 114 bp,GC含量46%;33、35、38、39、48代病毒的核苷酸序列同源性为99.99%,这5代病毒与标准疫苗株V-Oka的核苷酸序列同源性为99.96%;VZV Oka株在MRC-5、SV-1细胞上制备的38代病毒全基因序列有1个差异位点;本研究中的各代次病毒基因序列高度同源,与Varivax和Varilrix疫苗株、野毒株Dumas及亲本株p-Oka相比,与疫苗株V-Oka的同源性最高。结论 VZV Oka株在SV-1细胞上的适应性及遗传稳定性均良好。     

麻疹病毒长-47纯化株(2BS细胞)毒种库的建立

目的建立以人胚肺二倍体细胞(2BS)为基质的麻疹病毒长-47纯化株毒种库。方法将麻疹病毒长-47纯化株毒种(CEC)主代主种子批适应于2BS细胞,传至第4代和第8代,分别作为主种子批及工作种子批,对毒种进行鉴别试验、无菌试验、支原体检查、外源因子检查和病毒滴度检测,并对主种子批毒种进行猴体神经毒力试验和猴体免疫原性检测。将毒种连续传代,观察各代次病毒的收获时间,并测定病毒滴度,分析毒种的传代稳定性;将主种子批和工作种子批分别置于-20和-70℃保存,不同时间取样,检测病毒滴度,分析毒种保存温度稳定性;选取4个代次毒种(D4、D8、D15、D19)提取病毒核酸,扩增H基因序列,分析H基因在传代过程中的遗传稳定性。结果主种子批和工作种子批毒种鉴别试验、无菌试验、支原体及外源因子检查均符合《中国药典》三部(2010版)要求,病毒滴度分别为5.88和6.00 log CCID50/ml,主种子批毒种具有良好的安全性及免疫原性。麻疹病毒长-47纯化株毒种适应于2BS细胞后,收获病毒时间一般在6~7 d,病毒滴度稳定在5.5~6.5 log CCID50/ml之间。主种子批和工作种子批病毒于-20和-70℃保存10个月,病毒滴度无明显变化。D4~D19代病毒无核苷酸发生改变,与麻疹病毒Chang-47(Gen Bank登录号:EF033071)比对结果显示,D4~D19代病毒核苷酸序列21 nt由G→C,属于同义突变,同源性达99.9%。结论建立了麻疹病毒长-47纯化株(2BS)毒种库,并按照《中国药典》三部(2010版)要求进行了全面检定,为制备以人胚肺二倍体细胞为基质的麻疹减毒活疫苗奠定了基础。     

风疹单次病毒收获液生产工艺的改进

<正>风疹单次病毒收获液的生产采用人二倍体细胞MRC-5株进行病毒培养,但经MRC-5细胞培养及扩增较困难,使用10 L转瓶培养不易培养致密的单层细胞,生产的单次病毒收获液病毒滴度较低。改用5 L转瓶培养,既可培养致密的单层细胞,又可提高单次病毒收获液病毒滴度和单位产量。现将结果报道如下。取26代MRC-5细胞,复苏后接种至500 ml培养瓶培养,     

轮状病毒基因重配株LD_9(G_2型)Vero细胞适应株的选育及其生物学特性

目的探讨轮状病毒基因重配株LD(9G2型)在Vero细胞上的传代适应性,选育高滴度的适应株。方法将3个轮状病毒基因重配株LD9克隆株(G2型)(LD9-1、LD9-2、LD9-3)在Vero细胞上分别以0.05、0.10、0.15和0.20MOI传代,选育出1株Vero细胞适应株,并确定其最适MOI,然后在Vero细胞上连续传代15代,检测病毒滴度及基因组核酸带型,采用nestRT-PCR法扩增其VP7基因。取第8、10、13代适应株病毒,以0.10MOI接种于Vero细胞,观察病毒的增殖动态。结果选育出的LD9-2株以0.10MOI接种Vero细胞可产生明显的细胞病变(CPE),病毒滴度随传代次数的增加先下降后升高,至4代时最低,9代后稳定于6.75lgCCID50/ml左右;连续传代15次,病毒基因组核酸带型均与原始毒株一致,且均能扩增出502bp的VP7基因。LD9-2株病毒增殖高峰期均出现在第7～8天,病毒滴度为6.00～7.00lgCCID50/ml。结论轮状病毒基因重配株LD9株(G2型)经Vero细胞适应性培养,获得了病毒表达量高且能稳定传代的疫苗候选株。     

牛副流感病毒3型在不同细胞中的复制动力学分析

目的对牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)在Vero-E6、MRC-5和MDBK 3种细胞中的复制动力学进行分析。方法将BPIV3分别接种至Vero-E6、MRC-5和MDBK 3种细胞,盲传3代,逐日观察细胞病变(CPE)情况;采用直接免疫荧光抗体法检测3种细胞盲传3代后BPIV3的增殖情况;将病毒滴度为1.0×104TCID50/ml的BPIV3分别接种至MDBK和Vero-E6单层细胞中,培养7 d,逐日测定各细胞中的病毒滴度。结果BPIV3在MDBK细胞中盲传1代即可观察到明显的CPE;在Vero-E6细胞中盲传2、3代可见CPE;在MRC-5细胞中盲传3代未见CPE。在MDBK细胞中盲传3代可检测到较强荧光信号;在Vero-E6细胞中盲传3代荧光强度较弱;在MRC-5细胞中盲传3代未检测到荧光信号。BPIV3在MDBK和Vero-E6细胞中分别于培养第5和6天时病毒滴度达峰值,分别为1.2×1010和1.0×105 TCID50/ml。结论 BPIV3在MDBK细胞中的复制动力强于Vero-E6细胞,最适用于培养该病毒,MRC-5细胞不适用于培养BPIV3。     

EV71灭活疫苗(人二倍体细胞)灭活工艺验证

目的对肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗(人二倍体细胞)的灭活工艺进行验证。方法取3批次经甲醛灭活的EV71灭活病毒收获液样品,分别连续盲传4代,并设病毒对照盲传4代。观察每代次样品的细胞病变情况,采用微量滴定法检测病毒感染性滴度,ELISA法检测EV71特异抗原含量,实时定量PCR法检测病毒核酸水平及病毒负链产生情况。结果 3批灭活的疫苗病毒收获液样品经4次盲传后,各代次均未出现明显的细胞病变,经微量滴定法均未检测到EV71感染性滴度。灭活的病毒收获液盲传至第2代时,病毒负链检测已为阴性;至第3代时,EV71抗原检测为阴性;至第4代时,病毒核酸检测为阴性。病毒对照经盲传4代后,各代次均出现明显细胞病变;自第2代开始,感染性滴度维持在106~107 CCID50/ml,抗原含量为200~370 U/ml,且均可检测出明显的病毒核酸及病毒负链增殖。结论通过经典的"细胞上盲传3代"的检测方法,并结合实时定量RT-PCR对病毒核酸和负链进行检测,证实经甲醛灭活的EV71灭活疫苗样品已完全灭活。     

BRD-Ⅱ风疹病毒疫苗株的连续传代及其基因稳定性

目的观察上海生物制品研究所有限责任公司BRD-Ⅱ风疹病毒株(S-BRD-Ⅱ株)在MRC-5细胞中连续传代的基因稳定性,并比较该毒株与其他上市风疹毒株E1基因的差异。方法将S-BRD-Ⅱ株病毒在MRC-5细胞中连续传10代,检测每代病毒的培养特性和E1基因序列,第28、29、33和38代病毒的ORF序列及第28、38代病毒的5′-和3′-末端序列,同时测定B-BRD-Ⅱ株(北京天坛)及进口疫苗风疹病毒株(RA 27/3)E1基因,并对各基因的核苷酸及其相应的氨基酸序列进行分析。结果 S-BRD-Ⅱ株病毒在MRC-5细胞上连续传10代,其培养特性、细胞病变(CPE)程度及病毒滴度基本稳定,S-BRD-Ⅱ株病毒E1基因未发生变异,与Gen Bank中登录的BRD-Ⅱ株比较,有一个特异性的沉默突变,与RA 27/3疫苗株病毒比较,有122个核苷酸位点及其相应6个氨基酸发生突变。第28、29、33、38代S-BRD-Ⅱ株病毒的ORFⅠ和ORFⅡ基因区域与Gen Bank登录的BRD-Ⅱ株病毒比较,有5个位点发生变异,且P150非结构蛋白编码区域基因出现大片缺失。第28和38代S-BRD-Ⅱ株病毒的5′-末端与Gen Bank中登录的BRD-Ⅱ株序列的5′-末端一致,而3′-末端有一个氨基酸发生突变。结论 BRD-Ⅱ风疹病毒疫苗株在MRC-5细胞中具有良好的传代稳定性,所有上市风疹病毒株的E1基因氨基酸序列差异不大。     

甲型肝炎病毒抗原定量参比品的研制

目的制备甲型肝炎病毒抗原定量参比品。方法依据《甲型肝炎灭活疫苗制造及检定规程》制备了1批甲肝病毒抗原参比品,并进行蛋白质含量测定、HAV蛋白纯度分析和酶标抗原含量标化。结果经纯化,杂蛋白去除率达99.9%,参比品的纯度大于95%;抗原含量在20~80 EU/ml范围内,抗原含量的对数与其A值呈剂量-效应关系。结论该参比品可用于甲肝病毒ELISA定性及定量标定。     

狂犬病病毒PM株在人二倍体MRC-5细胞中的感染特性

目的观察狂犬病病毒PM株在人二倍体MRC-5细胞中的感染特性。方法分别将0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 MOI的PM株狂犬病病毒接种至MRC-5细胞中,显微镜观察感染细胞的状态;间接免疫荧光法检测病毒收获液的滴度;小鼠NIH法测定病毒灭活液的效价。结果 MOI为0.06⁰.07时,病毒收获前细胞出现聚集现象,液体中基本无死细胞;病毒收获液的滴度和病毒灭活液的效价较高。结论观察了狂犬病病毒PM株在人二倍体MRC-5细胞中的感染特性,为疫苗生产工艺的优化提供了实验依据。     

麻疹病毒沪-191株在鸡胚成纤维细胞中连续传代的遗传稳定性

目的研究麻疹病毒沪-191株在鸡胚成纤维细胞中连续传代的遗传稳定性。方法将麻疹病毒沪-191株原始种子批(P25)在鸡胚成纤维细胞上传代2次(P27)作为主种子批,继续传代3次(P30)作为工作种子批,继续传代至33(P33)和35(P35)代。对P25、P27、P30、P33和P35病毒基因组进行基因序列分析,并对所有代次病毒进行滴度测定。结果麻疹病毒沪-191株在鸡胚成纤维细胞中从25代传至35代,其滴度维持在5.0～5.875 lgCCID50/ml之间;P25、P27、P30、P33、P35 5个代次病毒的全基因组序列未发生任何核苷酸和氨基酸改变。结论麻疹病毒沪-191株在鸡胚成纤维细胞连续传代,病毒滴度均一,基因组序列未发生改变,遗传稳定性良好。     

甲磺酸去铁胺佐剂对甲型肝炎病毒抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响

目的探讨甲磺酸去铁胺(deferoxamine,DFO)佐剂对甲型肝炎病毒(hepatitis A virus antigen,HAV)抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法将不同剂量的DFO(0.6、1、4、8 mg)佐剂分别与HAV抗原18 EU混合,免疫ICR小鼠,并设生理盐水对照组(生理盐水200μl)、HAV抗原对照组(HAV 18 EU)、铝佐剂对照组(铝佐剂300μg+HAV抗原18 EU)和复合佐剂组(HAV抗原18 EU+DFO 1 mg+铝佐剂150μg),均经腹部皮下多点注射,0.2 ml/只,共免疫1次。分别于免疫后第4、8、12、16周,采用间接ELISA法检测小鼠血清中抗-HAV IgG水平,并进行安全性试验。结果除生理盐水对照组外,其他各组小鼠血清在各时间点均能检测到抗-HAV IgG;除DFO 0.6 mg组外,抗体滴度均在第8周达峰值;不同剂量DFO组的抗体水平均明显高于HAV抗原对照组,其中DFO 4 mg和8 mg组在8~16周时抗体水平显著高于HAV抗原对照组,且差异有统计学意义(P0.05),但与铝佐剂对照组比较,差异无统计学意义(P0.05);在8~16周时,同一时间DFO 4 mg、DFO 8 mg和复合佐剂组的抗体水平较高,并能维持较长时间,至第16周时仍能达到与铝佐剂对照组相当的水平。结论 DFO佐剂能显著增强HAV抗原诱导小鼠的体液免疫应答,有望开发为一种可替代铝佐剂的新型佐剂。     

水痘减毒活疫苗Oka株的传代稳定性

目的观察水痘减毒活疫苗Oka株(V-Oka)的传代稳定性。方法将V-Oka病毒在人二倍体细胞MRC-5上连续传代至50代,观察病毒的培养特性。选择32、34、38、42、46、50代病毒进行病毒滴度测定和鉴别试验,提取病毒DNA,对V-Oka的主要基因(ORF31、ORF62、ORF68、R区)进行PCR扩增和测序,并对序列进行分析。结果 V-Oka连续传代至50代,其培养特性、细胞病变一致,病毒滴度为5.0～5.6LgPFU/ml。与GenBank中登录的V-Oka序列比较,32～50代的V-OkaORF31、ORF62、ORF68、R区序列稳定,并趋于减毒型。结论 V-Oka传代至50代,生物学和分子遗传学特性稳定。     

生产场地变更后甲型肝炎灭活疫苗(人二倍体细胞)的抗原特性

目的研究生产场地变更后,原生产工艺制备的甲型肝炎灭活疫苗(人二倍体细胞)的抗原特性。方法采用双抗体夹心ELISA法检测在新场地制备的甲肝灭活疫苗病毒浓缩液和疫苗原液的甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)抗原含量。SDS-PAGE和Western blot分析二者的蛋白组分和特异性;疫苗成品(成人剂量)稀释为不同剂量(640、320、160、80和40 EU),免疫ICR小鼠(并设铝佐剂对照组),采用竞争ELISA法检测小鼠血清中HAV抗体效价;同时称量免疫后不同时间小鼠体重。结果病毒浓缩液和疫苗原液的HAV抗原含量分别为12 800和3 200 EU/ml。疫苗原液中仅含HAV结构蛋白组分,且可与HAV抗体特异性结合。初免后28 d,640、320和160 EU剂量疫苗组小鼠血清抗体阳转率为100%,80和40 EU剂量疫苗组二免后血清抗体阳转率达100%和90%,所有免疫组小鼠血清抗体效价二免后14 d较初免28 d上升约2倍;疫苗免疫组小鼠体重及体重增幅与佐剂对照组相比,均无药物作用引起的异常变化(P0.05)。结论在新场地采用原生产工艺制备的甲型肝炎灭活疫苗原液有单纯的抗原蛋白组分和免疫学特异性,且与前期研究结果相比,其免疫原性及安全性具有一致性。     

甲型肝炎病毒血凝及血凝抑制试验的进一步研究

<正> 龙甲_(25)株甲肝病毒(HAV)适应生长于2BS株人二倍体细胞,培养5周后收获病毒,经冻融一超声处理3次后,以等量氯仿抽提,在PH5.4～6.4的酸性条件下,于4℃～10℃时可使鹅红血球凝集,其血凝素滴度可达1:128。逐周观察组织培养中HAV的增殖动态,发现以ELISA法和血凝法检测HAV,增殖高峰均在培养第3周,以后开始下降,二法检测结果平行,提示HAV血凝试验有望用于HAV的检测。采集甲肝急性期血清30份,恢复期血清32份,非甲肝病人血清18份,以25％白陶土处理1次,再以鹅红血球吸附,选用8个单位HAV血凝素,按常