κ-卡拉胶的高温高压法降解工艺和降解机制研究

目的： 研究了κ-卡拉胶的高温高压降解法制备水溶性卡拉胶的工艺和降解产物的寡糖指纹谱图,探究κ-卡拉胶的高温高压降解机制。方法： 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法、高效凝胶排阻色谱法分析温高压降解的水溶性κ-卡拉胶的分子量和得率。利用亲水液相色谱-高分辨质谱联用技术(HILIC-HRMS),分析比较不同pH值时降解产物的寡糖指纹谱图。结果： 研究发现,采用醋酸溶液调节溶液的pH值在4.0-6.0之间,高分子量κ-卡拉胶在100℃-120℃ 加热30-90 min后迅速降解,可以获得不同分子量的水溶性卡拉胶。我们发现pH和温度对卡拉胶的高温高压降解产物的分子量和得率有很大的影响。HILIC-MS分析降解产物的寡糖指纹谱图发现,高温高压降解获得的卡拉胶寡糖产物主要是聚合度2-8的卡拉胶偶数糖和少量的奇数糖,还有20%左右的聚合度1-8的硫酸半乳寡糖。不同硫酸化的寡糖的存在证明,κ-卡拉胶的糖链中存在不同硫酸化的半乳糖-3,6内醚半乳糖二糖和半乳寡糖片段。结论：通过控制溶液的pH值、降解温度和时间,高温高压法可以快速、高效的制备水溶性卡拉胶和寡糖,产物中的寡糖组成主要是不同硫酸化的卡拉胶偶数寡糖和半乳寡糖。     

低分子量κ-卡拉胶衍生物的制备及其抗氧化性能研究

采用氧化法对κ-卡拉胶进行降解,得到分子量不同的两种卡拉胶低聚糖,并分别制成四丁基铵盐.进而与琥珀酸酐进行酰化,制得两种不同分子量的卡拉胶琥珀酰基化衍生物.对产物进行IR表征,并对产物的抗氧化性能进行测试.结果表明:κ-卡拉胶在琥珀酰基化以后,对超氧阴离子自由基O2-·和羟基自由基·OH的清除能力有所下降.     

产κ-卡拉胶降解酶菌株的筛选鉴定及降解产物初步分析

从海南卡拉胶生产基地的土样中筛选得到一株高产κ-卡拉胶降解酶的菌株,命名为N5-2。该菌为革兰阴性杆菌,经形态学观察、生理生化指标鉴定和16SrRNA序列的分析,确定该菌为Cellulophaga属lytica种。通过系统发育树的建立,可知该菌在进化中的地位。该菌所产的κ-卡拉胶降解酶降解κ-卡拉胶的产物经薄层层析检测主要为3个组分。均一的组分使得寡糖的纯化过程相对简单,方便了后期寡糖活性的研究与应用。     

不同相对分子质量κ-卡拉胶马来酰衍生物的抗氧化活性

对κ-卡拉胶进行酸降解,经过透析得到两种卡拉胶低聚糖。分别与马来酸酐合成得到两种马来酰衍生物(MA和MB),其相对分子质量分别为3 200和4 540,且取代度相近。对产物进行FT-IR表征,并考察了其对羟基自由基.OH、DPPH自由基的清除活性以及还原能力。结果表明:MA清除羟基自由基.OH、DPPH自由基能力以及还原能力均优于MB,即相对分子质量可能是影响卡拉胶衍生物抗氧化活性的因素之一。     

κ-卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细胞增殖和胶原分泌的影响

目的研究κ-卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细胞增殖和胶原分泌的影响。方法原代培养小鼠皮肤成纤维细胞,传代培养后加入不同浓度的κ-卡拉胶寡糖作用,应用细胞计数法,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,检测κ-卡拉胶寡糖对皮肤成纤维细胞增殖的影响,ELISA法检测κ-卡拉胶寡糖对皮肤成纤维细胞分泌Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的影响。结果 12.5μg/mL 100μg/mL范围内,各组κ-卡拉胶寡糖对小鼠皮肤成纤维细胞均有一定促进增殖作用,其中以100μg/mL时最为显著(P<0.01)。用25μg/mL和50μg/mLκ-卡拉胶寡糖处理小鼠皮肤成纤维细胞后,与对照组相比,Ⅰ型胶原蛋白分泌明显增加(P<0.05);12.5μg/mL 100μg/mL范围内,各组κ-卡拉胶寡糖均显著促进Ⅲ型胶原蛋白分泌(P<0.05)。结论κ-卡拉胶寡糖能有效促进小鼠皮肤成纤维细胞增殖和胶原分泌。     

湿热降解对花魔芋魔芋胶/κ-卡拉胶复配凝胶性能的影响

以湿热降解法对花魔芋魔芋胶进行有限降解,获取分子量为137.8～621.5kDa的5种材料,比较其与κ-卡拉胶溶胶—凝胶转变过程中关键性能指标的差异。结果显示,相对于未降解魔芋胶(621.5kDa),有限降解魔芋胶(415.6kDa)显著提升了凝胶转变温度(5.98℃);同时,其储能模量、剪切应力、黏度小幅增加,致使冷却成胶后其凝胶断裂强度、断裂伸长率、凝胶持水性显著增强(P0.05);SEM分析显示,其凝胶结构更加紧密有序;而在其质构特征上,233.3kDa的魔芋胶与κ-卡拉胶形成的复配凝胶表现出较大的硬度和弹性。试验确证利用湿热法对中国花魔芋魔芋胶进行有限降解,是提升魔芋胶/κ-卡拉胶复配凝胶性能的一种有效方法。     

不同聚合度的卡拉胶降解物对人结肠上皮细胞的影响

目的:探讨结构因素时卡拉胶降解物安全性的影响.方法:以结肠上皮细胞(Caco-2)为研究对象,通过MTT法检测3种类型的卡拉胶(κ-ι-和λ-型)在3种聚合度范围内的细胞毒,并通过测定活性氧、NO、TNF、NF-α、IL-8的变化来观察样品对细胞的致炙能力.结果:硫酸基团含量最低的κ-卡拉胶降解物具有最强的细胞毒,而硫酸基团含量最高的λ-卡拉胶细胞毒性最弱.其中κ-卡拉胶低聚物在质量浓度高于200μg/mL时的存活率低于30%.并且这种细胞毒与活性氧的爆发呈明显相关性.同时.κ-卡拉胶低聚物具有最强的促进炎症因子分泌的能力,NO、TNF-α、IL-8都出现了明显的增高.另外,聚合度也是影响卡拉胶细胞毒性和促炎性因子分泌的关键.聚合度越低,毒性越高,炎症因子的分泌量越大.结论:低聚卡拉胶,特别是κ-型卡拉胶能够通过活性氧的爆发造成结肠上皮细胞损伤.并引起大量炎症因子产生.该机制可能会导致卡拉胶低聚物损伤结肠组织,引发结肠溃疡.     

κ-卡拉胶寡糖抗凝血作用的研究

目的:研究κ-卡拉胶寡糖的抗凝血作用。方法:通过体外实验的方法,考察κ-卡拉胶寡糖对家兔的凝血时间(CT)、凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)以及活化部分凝血酶时间(APTT)的作用。结果:质量浓度为0.25%、0.5%、1%、2%、4%、8%的κ-卡拉胶寡糖显著延长家兔的凝血时间(CT),对凝血酶时间(TT)和活化部分凝血酶时间(APTT)均有明显的抑制作用,而对凝血酶原时间(PT)的抑制作用相对较小。结论:κ-卡拉胶寡糖具有抗凝血的作用。     

降解魔芋胶与κ-卡拉胶复配胶在凝胶软糖中的应用

为了改善单独以卡拉胶为凝胶剂的软糖弹性、咀嚼性不足等缺陷,并降低凝胶剂的用量,本文探讨了降解魔芋胶(KGM-2)与κ-卡拉胶复合胶体在凝胶软糖中应用.将KGM-2和κ-卡拉胶的复合胶体运用于凝胶软糖的制作,在优化的配方和干燥条件下,从感官评定和质构测定两方面与单独以κ-卡拉胶为凝胶剂的软糖进行对比.结果表明,kC-KGM-2软糖在很大程度上减少了凝胶剂(尤其是κ-卡拉胶)的用量,也减少了氯化钾的用量,而且弹性、咀嚼性等显著优于kC软糖.     

壳聚糖氧化降解制备聚合度6以下的壳寡糖

壳寡糖是壳聚糖经降解后的低聚物,其相对分子质量较小,水溶性好,易于吸收,生物活性高。本实验采用过氧化氢氧化降解脱乙酰度高于95%的壳聚糖,利用离子色谱-脉冲安培法对低聚合度的壳寡糖进行定性和定量分析,以制备聚合度在6以下的壳寡糖。以降解产物的离子色谱中聚合度6以下的峰面积和与产物得率之积作为响应指标,并结合凝胶渗透色谱来考察过氧化氢浓度、反应时间、反应温度对壳聚糖降解的影响及降解特性,并利用响应面分析法对氧化条件进行优化。研究结果表明,采用离子色谱测定聚合度6以下的壳寡糖在方法学上是可行的,具有良好的精密度、稳定性和重现性。得到的最佳降解工艺条件为:过氧化氢浓度4.50%、反应时间6 h、反应温度56℃。由最优条件下的降解产物离子色谱图可知,聚合度越低的壳寡糖越容易得到;可利用离子色谱法对壳聚糖的降解过程进行调控。     

过氧化氢制备壳寡糖的工艺

为了简便高效的制备出壳寡糖,采用过氧化氢(质量分数1.0%)来降解稀醋酸溶液(质量分数1.0%)中含量为3.5%的壳聚糖,60℃下摇床反应4.5h后得到壳寡糖水溶液,检测溶液中还原性端基数并估算降解物平均聚合度来表征降解程度。降解液浓缩到25%,调pH7.0,用体积分数95%乙醇分级沉淀分离壳寡糖可以除掉部分单糖,总的回收率达93.0%。通过电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析,3倍醇沉出的产物为2-4糖为主的壳寡糖产品。实验说明过氧化氢氧化降解壳聚糖可制取聚合度为2-4的壳寡糖。     

基于双氧水降解卡拉胶的优化工艺研究

目的:优选氧化降解卡拉胶的工艺。方法:以降解卡拉胶得率、降解卡拉胶DPPH·清除率为指标,采用正交实验对双氧水降解卡拉胶的工艺进行优选。结果:优化工艺为待温度升至90℃,卡拉胶溶解后,立即加入20%的双氧水,然后调溶液pH至8,保持90℃降解2h,降解卡拉胶得率、降解卡拉胶DPPH·清除率分别为75.94%和95.78%。结论:该工艺合理,降解卡拉胶得率较高且DPPH·清除率高,具有较好的经济效益。     

5种酶制剂对κ—卡拉胶降解作用的研究

研究5种酶制剂对κ－卡拉胶的降解作用,并用粘度法测定降解程度。结果表明：果胶酶和半纤维素酶对卡拉胶具有较强的降解作用;木瓜酶,海洋复合酶和纤维素复合酶单独使用降解作用微弱;木瓜酶－海洋复合酶,海洋复合酶－纤维素复合酶,纤维素复合酶－木瓜酶混合作用效果也不明显;而木瓜酶－海洋复合酶－纤维素复合酶,按一定比例混合使用其降解效果显著。     

黄原胶寡糖对野油菜黄单胞菌的抑菌性能研究

碱性条件下对黄原胶进行氧化降解,透析得到三种黄原胶寡糖(XGO-A,XGO-B和XGO-C),对产物进行FT-IR表征,GPC法测定其分子量分别为3600、7500和10100。三种黄原胶寡糖的丙酮酸含量分别为5.7%、5.3%和4.8%;还原糖含量分别为23.7%、22.5%和21.1%。采用琼脂平板打孔法、最低抑菌浓度以及生长曲线方法,考察了三种黄原胶寡糖对野油菜黄单胞菌的抑菌能力;同时检测了三种寡糖对野油菜黄单胞菌细胞膜通透性的影响。结果表明,分子量为7500的XGO-B具有更好的抑菌性能。而当丙酮酸和还原糖含量相近时,对野油菜黄单胞菌的抑菌性能可能与黄原胶寡糖的分子量有关;随着分子量的上升,寡糖对野油菜黄单胞菌细胞膜破坏增强,这表明破坏细胞膜通透性是抑菌机理之一。     

κ-卡拉胶寡糖酶解制备工艺优化

为改进卡拉胶寡糖的制备工艺,本研究以κ-卡拉胶为底物,采用酶法制备κ-卡拉胶寡糖,以还原糖生成量为评价指标,对酶解条件进行优化,并采用薄层色谱法及质谱对酶解产物进行分析。结果显示酶解反应最优工艺条件为:底物浓度12 g/L、p H7.0、反应温度40℃、振荡速率100 r/min,经优化后的酶解反应更完全,还原糖生成量由0.91 mg/m L提高至1.61 mg/m L,提高了77%,酶解卡拉胶反应的Km值为171.96 mg/m L,最大反应速度Vmax为0.925 mg·m L~(-1)·min~(-1)。最优工艺验证实验和20 L放大实验结果一致,经薄层色谱及质谱分析酶解24 h后的反应主产物为二糖和四糖。     

κ-卡拉胶-大豆肽可食膜配方优化与结构表征

通过加入大豆肽改善κ-卡拉胶可食膜的机械强度并对κ-卡拉胶-大豆肽可食膜的配方进行优化。采用质构仪对κ-卡拉胶-大豆肽可食膜的机械强度进行分析,得出κ-卡拉胶、大豆肽、甘油的添加量对可食膜机械强度的影响,进而采用正交实验得出可食膜的最优配方,并通过红外分析光谱对可食膜的结构进行表征。研究得出可食膜最优配方为:κ-卡拉胶添加量为3%、大豆肽添加量2%、甘油添加量1%。该配方条件下κ-卡拉胶-大豆肽可食膜的抗拉强度为29.36 MPa,断裂延伸率为23.59%。红外分析光谱显示,κ-卡拉胶-大豆肽可食膜以κ-卡拉胶的网络结构为主,另外κ-卡拉胶的磺酰基特征吸收峰消失,可推断κ-卡拉胶分子间的相互作用力减弱,加入大豆肽改善了κ-卡拉胶可食膜的机械性能,优化处理得到的可食膜可适用于食品包装领域。     

卡拉胶多糖的分子修饰：卡拉胶酶和硫酸化酶的研究进展

卡拉胶（carrageenan）是一种从海洋红藻细胞壁中提取出来的多糖物质,通过1,3-β-D-吡喃半乳糖和1,4-α-D-吡喃半乳糖交替连接作为基本骨架形成的线性硫酸多糖。研究表明,卡拉胶及其分子修饰后获得的衍生物具有抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、增强人体细胞免疫和体液免疫力等多方面生物活性。卡拉胶酶属于糖苷水解酶,通过使β-1,4糖苷键断裂来降解卡拉胶。卡拉胶硫酸酯酶又被称作卡拉胶硫酸化酶,是一种作用于卡拉胶寡糖的硫酸基使之游离出无机硫酸的酶。经研究证实,这两种酶对于卡拉胶多糖的降解具有协同作用。然而由于卡拉胶多糖结构的复杂性,人们对于卡拉胶的降解及分子修饰大多数尚未探索。现如今,随着技术的进步以及卡拉胶多糖生物活性的多样性,卡拉胶多糖的分子修饰引起了相关研究者的持续关注。作者概括了近年来卡拉胶多糖的分子修饰,重点介绍了卡拉胶酶和硫酸化酶的研究进展,进一步阐述了其修饰后的生理活性变化。     

PMP-HPLC-MSn法分析弱酸降解鲍鱼性腺多糖产生的寡糖

为考察鲍鱼性腺硫酸多糖（abalone gonad sulfated polysaccharide,AGSP）在弱酸降解过程中产生的寡糖,对不同酸浓度的降解产物1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP）衍生化后,进行高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MSn）法检测。在AGSP的弱酸降解产物中发现了2 种二糖（disaccharides,DS1、DS2）和1 种四糖（tetrasaccharide,TS）。2 种二糖均是由己糖醛酸通过糖苷键连于己糖,其中DS2的结构确定为β-GlcA（1→2）-Man,而TS是由2 个DS2连接而成。在100 ℃加热1 h的条件下,在0.1～2.0 mol/L的三氟乙酸浓度范围内,这3 种寡糖的产率都随着酸浓度的增加呈升高趋势。     

λ-卡拉胶降解组分的体外免疫活性

目的：研究微波法降解得到的不同分子量角叉菜λ- 卡拉胶的免疫活性。方法：以离子交换纤维素色谱DE52 柱对微波降解所得λ- 卡拉胶PC2(product of carrageenan 2)进行分级;从实验动物体内获取免疫细胞,采取体外与多糖共同培养的方式,通过淋巴细胞、巨噬细胞增殖实验,中性红吞噬实验以及NO 释放实验评价其免疫活性。结果：纯化得到三个硫酸基含量和分子量依次增大的均一多糖分级组分CF1(carrageenan fraction 1)、CF2(carrageenan fraction 2)、CF3 (carrageenan fraction 3)。实验结果表明,CF1、CF2、CF3 组分均能显著的促进巨噬细胞和ConA 诱导的脾细胞增殖,并能增强巨噬细胞吞噬能力和NO 的释放。结论：在体外培养研究条件下,λ-卡拉胶降解组分对正常小鼠的免疫能力有促进作用。     

普鲁兰多糖对κ-卡拉胶凝胶特性及流变学性质的影响

研究了普鲁兰多糖对κ-卡拉胶凝胶特性和流变学性质的影响。实验表明:κ-卡拉胶的凝胶强度、凝胶温度和熔化温度随着κ-卡拉胶和K+的浓度的增加而增加。随着普鲁兰多糖添加量的增加,κ-卡拉胶的凝胶强度、凝胶温度和熔化温度出现一定程度的升高,胶体的持水能力得到改善,胶液的流动行为指数(n)减小,表观粘度逐渐增大,胶液近似于牛顿型流体。