巴氏杜氏藻番茄红素β-环化酶基因的克隆及其启动子的活性分析

杜氏盐藻是迄今为止工业化生产β-胡萝卜素最成功的经济微藻之一,番茄红素β-环化酶(LycB)是催化番茄红素合成β-胡萝卜素的关键酶。本研究根据实验室克隆得到的LycB的cDNA序列,通过分析其保守序列设计引物,通过分段克隆PCR及基因组步移的方法,克隆获得几乎完整的LycB基因组序列。测序结果表明,克隆到的该部分LycB基因组序列含有5863 bp,由11个外显子和10个内含子组成。再通过基因组步移的方法,获得LycB基因启动子和终止子序列。其中,5’端上游序列长度为2566 bp,3’端下游序列长度为818 bp。采用PlantPAN在线启动子预测工具进行分析,结果表明,该基因启动子含有一些顺式作用元件如光响应元件、盐响应元件等,表明巴氏杜氏藻LycB基因的表达可能受到光照及盐浓度等因素的调控。     

盐藻八氢番茄红素脱氢酶cDNA的分离及序列分析

采用5’和3’RACE技术和梯度PCR方法从盐藻中克隆了八氢番茄红素脱氢酶(Pds)全长cDNA,序列分析表明,该cDNA长2198bp,包含1个1752bp的开放阅读框(ORF),编码一段583氨基酸残基的多肽链。氨基酸序列的同源性分析表明,它与高等植物和蓝藻的八氢番茄红素脱氢酶序列一致性高达67%,而与细菌和酵母的序列同源性较差;在N端具有一段转运序列和辅助因子结合结构域,C端则有一胡萝卜素结合域。这些序列特征预示,盐藻Pds与其他绿藻、高等植物和蓝藻中的同源基因一样催化八氢番茄红素发生前2步脱氢反应,并且需要与另一个脱氢酶联合作用合成番茄红素。     

盐藻八氢番茄红素合成酶基因组DNA的克隆及序列分析

八氢番茄红素合成酶(PSY)为盐藻β-胡萝卜素代谢途径中的一个关键酶。通过染色体步移技术,采用抑制性PCR,从盐藻基因组DNA中克隆到完整的PSY基因,并对其序列进行了分析。该PSY基因序列全长3315bp,由5个外显子和4个内含子组成。其编码区的氨基酸序列与巴氏杜氏藻相应序列的一致性最高为74%,不一致区主要集中在5'端。同源性分析表明盐藻与巴氏杜氏藻的亲缘关系最近。     

盐藻八氢番茄红素合成酶基因组DNA的克隆及序列分析

八氢番茄红素合成酶(PSY)为盐藻β-胡萝卜素代谢途径中的一个关键酶。通过染色体步移技术，采用抑制性PCR，从盐藻基因组DNA中克隆到完整的PSY基因，并对其序列进行了分析。该PSY基因序列全长3315bp，由5个外显子和4个内含子组成。其编码区的氨基酸序列与巴氏杜氏藻相应序列的一致性最高为74％，不一致区主要集中在5’端。同源性分析表明盐藻与巴氏杜氏藻的亲缘关系最近。     

噬夏孢欧文氏菌crtY基因在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化

噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)可以累积类胡萝卜素,合成过程涉及的一系列反应都是在相关酶的催化下完成的,其中番茄红素环化酶由基因crtY编码,催化由番茄红素转化为β-胡萝卜素的酶促反应。本研究以噬夏孢欧文氏菌基因组DNA为模板,通过聚合酶链式反应扩增获得crtY基因,测序正确后克隆进表达载体pET-15b,构建表达质粒pET-15b-crtY,重组质粒转化E．coli BL21(DE3),构建工程菌,经IPTG诱导后,重组番茄红素环化酶在大肠杆菌中实现了高效表达,通过镍离子树脂亲和层析和Superdex 75凝胶过滤层析,得到了电泳纯的重组噬夏孢欧文氏菌番茄红素环化酶,该蛋白体外具有催化番茄红素转化为β-胡萝卜素的活性。     

巴氏杜氏藻ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与分析

ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因是胡萝卜素生物合成途径中的一个关键酶之一。根据实验室已获得的巴氏杜氏藻ZDS基因的cDNA序列,设计引物,通过分段PCR的方法,获得ZDS基因的编码区序列。然后根据获得编码区序列,利用染色体步移的方法获得其两端侧翼序列:启动子和终止子,并利用生物信息学工具对获得序列进行分析。实验获得的完整ZDS基因全长11896 bp,其中编码区序列(从"ATG"到"TAA")长度为6435,编码区上游序列4091 bp(包括33 bp的5’UTR序列),编码区下游序列1370 bp(包括411 bp的3’UTR序列)。将编码序列与cDNA(开放阅读框)进行比对,发现整个编码区序列含有12个外显子和11个内含子,其中内含子长度达4686 bp,约为外显子长度的2.68倍,内含子均以GT开始,AG收尾,属于最常见的内含子类型。通过生物信息学分,发现ZDS启动子中具有多种转录因子结合位点,包括与光调控有关的GAGAbox,ASF1;与植物黄化反应有光的ACGTbox等。     

巴氏杜氏藻八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆与分析

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)类胡萝卜素生物合成途径中的上游关键酶。本研究根据NCBI上已发布的巴氏杜氏藻mRNA序列(GenBank:Y14807),设计特异性引物,通过基因组步移法及半巢式PCR的方法,获得PDS编码区序列。在编码区序列获取过程中,发现5’端编码区有325 bp序列与NCBI上公布的cDNA序列有所不同,故采用了5’RACE技术进行验证,经过比对发现结果与本实验基因组步移所获得序列相匹配,推测NCBI公布mRNA序列的PDS与本实验获取的PDS可能为同工酶。然后根据获得的序列,再利用基因组步移PCR的方法获得其两端侧翼序列:启动子和终止子,并利用生物信息学工具对其进行分析。实验获得的完整PDS基因全长12678 bp,其中编码区序列长度为8113 bp,编码区上游序列3010 bp,编码区下游序列1555 bp,编码区序列含有12个外显子和11个内含子。通过生物信息学分,发现PDS启动子中具有多种转录因子结合位点。     

β-胡萝卜素的生物合成研究取得新进展

<正>β-胡萝卜素是一种天然色素,属于四萜类化合物,有很高的药理学及营养学价值,现在已广泛应用于医药、保健品、食品添加剂及化妆品等行业。构建高效合成β-胡萝卜素的微生物菌株具有良好的应用前景。中国科学院武汉植物园天然产物合成生物学学科组于酿酒酵母中重构了β-胡萝卜素的生物合成途径,将来源于红发夫酵母中与β-胡萝卜素合成相关的基因crtYB（八氢番茄红素合成酶及番茄红素环化酶基因）和crtI（八氢番茄红素脱氢酶基因）转      

烟草类胡萝卜素异构酶基因的克隆及功能研究

为了进一步研究烟草类胡萝卜素异构酶（Carotenoid isomerase,CRTISO）基因的功能,从普通烟草（Nicotiana tabacum）的cDNA中成功克隆出CRTISO基因编码区（CDS）全长,长度为1716 bp,Blast结果显示与马铃薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersicum）的前番茄红素异构酶（Prolycopene isomerase）基因的相似度达93%。将CRTISO基因的部分序列插入烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）载体中,构建重组载体pTRV2-CRTISO。通过TRV病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）系统抑制本氏烟草（Nicotiana benthamiana）CRTISO基因的表达,同时利用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测CRTISO下游基因的表达量变化。结果表明,与对照组相比,TRV-CRTISO载体侵染的烟草叶片出现黄色斑点;CRTISO基因的沉默导致下游番茄红素ε环化酶（ε-LCY）、番茄红素β环化酶（β-LCY）和胡萝卜素β-环羟化酶（β-OHase）基因表达量降低。对烟草CRTISO基因功能的研究有助于揭示烟草中类胡萝卜素合成代谢途径的调节机制,为选育优质烟草品种奠定理论基础。      

硝酸盐对盐藻生长与物质积累的调控作用

文章报道不同浓度的硝酸盐对盐藻细胞生长与物质积累的调控作用.实验表明,增加氮的供给可促进盐藻的物质合成与生长发育.培养液中不供给氮时,虽然单个盐藻细胞内的蛋白质与β-胡萝卜素含量较高,但盐藻细胞生长受到抑制,使藻液中细胞密度降低,蛋白质与β-胡萝卜素的合成减少,不利于盐藻蛋白质和β-胡萝卜素的积累与利用.极度缺氮时,单个盐藻细胞内的蛋白质与β-胡萝卜素含量较高,可能是盐藻对逆境的一种适应.     

杜氏盐藻β-胡萝卜素提取皂化工艺参数优化

以甲醇-丙酮(20∶80,V/V)为流动相,建立杜氏盐藻β-胡萝卜素HPLC-DAD检测方法。采用外标法定量,对杜氏盐藻β-胡萝卜素的提取皂化工艺参数进行优化。研究结果表明,所选6种溶剂中,95%乙醇的提取效果最好。对选取的杜氏盐藻粉皂化,使胡萝卜素的得率从0.350%提高到0.425%,提高了21.43%。优化提取的最佳工艺参数是:提取温度25℃、时间0.7 h、液固比200 m L/g。此条件下杜氏盐藻β-胡萝卜素得率为0.395%。皂化的最佳工艺参数是:皂化温度25℃、皂化时间2 h、KOH甲醇溶液质量浓度0.1 g/m L。采用此提取皂化工艺,杜氏盐藻β-胡萝卜素的最终得率为0.428%。     

室内养殖盐藻生产β-胡萝卜素的探讨

文章介绍了在室外养殖盐藻生产β-胡萝卡素.由于很大程度上受到季节的限制,从而进行了室内养殖盐藻生产β-胡萝卜素的探索.并提出因叶绿素的降解而不能再合成或合成缓慢,对β-胡萝卜素的积累是否有因果关系的问题.     

硼对盐藻生长与物质积累的调控作用

实验研究了不同浓度的硼对盐藻细胞生长与物质积累的调控作用.结果表明,培养液中供给硼过多或过少都不利于盐藻细胞的生长与物质积累.以培养基中4 mg/L的硼浓度对盐藻细胞生长、蛋白质合成与β-胡萝卜素积累的促进作用最大.这一硼浓度可用于盐藻的生产性培养.当培养液中硼浓度较高(8 mg/L)或较低(2 mg/L)时,单个盐藻细胞中的蛋白质与β-胡萝卜素含量较高.但此时,因培养液中细胞密度较低,盐藻细胞积累的物质总量仍然较少.在硼浓度较高或较低的逆境条件下,盐藻可能通过适应性反应形成了逆境蛋白质与胡萝卜素等.     

钼对盐藻生长与物质积累的调控作用

实验研究了不同浓度的钼对盐藻细胞生长物质积累的调控作用.结果表明,培养液中供给钼过多或过少都不利于盐藻细胞的生长与物质积累.以培养基中60μg/L的钼浓度对盐藻细胞生长、蛋白质合成与β-胡萝卜素积累的促进作用最大.这一钼浓度可用于盐藻的生产性培养.当培养液中钼浓度较高(80μg/L)或较低(20μg/L)时,单个盐藻细胞中的蛋白质与β-胡萝卜素含量较高.但此时,因培养液中细胞密度较低,盐藻细胞积累的物质总量仍然较少.在钼浓度较高或较低的逆境条件下,盐藻可能通过适应性反应形成了逆境蛋白质与胡萝卜素等.     

环化酶抑制剂在提高番茄红素产量中的应用

番茄红素是一类重要的天色色素,有很强的抗炎、抗癌、抗氧化能力,目前已经广泛应用于食品、保健品、医疗等行业.在番茄红素生成过程中,环化酶抑制剂可以阻断番茄红素环化为β-胡萝卜素,从而大幅提高番茄红素产量.近年来环化酶抑制剂在细菌、酵母、霉菌、藻类及高等植物中均得到广泛应用.作者综述了环化酶抑制剂的种类及其对不同生物番茄红...     

盐藻β-胡萝卜素微波提取工艺研究

建立了一种从盐藻粉中快速提取β-胡萝卜素的微波辅助提取方法,考察了不同溶剂、液固比、温度、时间和搅拌速率对提取效率的影响,同时比较了最佳提取条件下(微波提取、超声波提取和传统溶剂浸提)盐藻β-胡萝卜素的提取效率。优化后的微波提取工艺条件为:乙酸乙酯为溶剂,微波功率500 W,液固比232 m L/g,提取温度42℃,萃取时间7.0 min,搅拌转速180 r/min,在优化条件下,盐藻β-胡萝卜素的得率为1.03%;与传统的溶剂浸提方法相比,微波提取和超声波提取都有效的提高了盐藻β-胡萝卜素的提取效率,且超声波提取的效率最高。     

过氧化氢酶在Blakeslea trispora抵抗氧胁迫中的保护作用

我们发现过氧化氢酶在三孢布拉氏霉菌抵抗氧胁迫(H2O2)中具有一定的保护作用,从而引发菌体合成大量β-胡萝卜素和番茄红素.当发酵培养24h时加入20μmol/L的H2O2,产生的β-胡萝卜素比对照提高了59.4%;当培养36h时加入75μmol/L的H2O2,产生的番茄红素比对照提高了77.7%;在菌体积累这两种类胡萝卜素的同时,过氧化氢酶的活性显著降低,说明过氧化氢酶因猝灭H2O2而大量消耗,同时引发菌体合成较多的β-胡萝卜素和番茄红素,以猝灭氧自由基对机体造成的损伤.这一现象说明在氧胁迫条件下,过氧化氢酶作为信号因子激发菌体合成类胡萝卜素,从而保护菌体正常生长和代谢.     

西兰花(Brassica oleracea var.italica)硫代葡萄糖苷酶基因 cDNA分子克隆及其特征分析

目的:研究西兰花硫代葡萄糖苷酶(简称硫苷酶)cDNA的结构特征,为硫苷酶异源表达打下基础.方法:以西兰花幼苗为试材.根据同源序列法PCR扩增硫苷酶特异cDNA片段,再用3＇RACE和5＇RACE分别扩增cDNA 3＇端序列和5＇端序列,经序列拼接获得西兰花硫苷酶全长cDNA序列.利用在线蛋白质分析系统对其编码的氨基酸序列进行结构特征分析.在NCBI CDD数据库中查找保守结构域,在SWISS-MODEL上进行在线蛋白同源模建,用MEGA3.1构建NJ系统树.结果:该基因cDNA全长1830bp,含有一个1641bp的ORF及31bp的5＇端非翻译区和158bp的3＇端非翻译区,命名为BoMyr2(GenBank登录号为EU004075);编码氨基酸序列含有20个氨基酸长度的信号肽及9个天冬酰胺N末端糖基化位点,编码的蛋白分子质量(Mw)约为62.2 kD,等电点(pI)为8.71;BoMyT2推测氨基酸序列舍有糖基水解酶家族1特有的糖基水解酶结构域,其编码蛋白与PDB库中白芥硫苷酶有类似的三维结构,具有明显的β/α(TIM)桶结构;BoMyr2应归为硫苷酶基因家族的MB亚族.     

过表达Lcy-b基因对烟草类胡萝卜素代谢及香气物质的影响

为揭示类胡萝卜素代谢关键基因番茄红素β-环化酶基因(Lycopene beta-cyclase,Lcy-b)对类胡萝卜素及香气物质代谢的影响,通过同源克隆法获得烟草品种K326 Lcy-b基因c DNA全长序列。采用农杆菌介导法导入烟草,测定Lcy-b过表达对类胡萝卜素各组分及烤后样香气物质含量的影响。序列分析表明:K326 Lcy-b基因包含一个1503bp的开放读码框(ORF),编码500个氨基酸。预测蛋白二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主,蛋白质分子量为56.06KDa,理论等电点(p I)为6.98。部分过表达阳性植株Lcy-b基因的表达量显著高于对照,类胡萝卜素组分中的β-胡萝卜素、新黄质、紫黄质比例增加,叶黄素所占比例降低。过表达植株烤后样β-胡萝卜素降解产物显著高于对照,而叶黄素降解产物则低于K326对照或与对照相当。研究结果说明Lcy-b过表达可以改变烟草类胡萝卜素组分比例,影响烤后烟叶香气物质含量。     

杜氏盐藻β-胡萝卜素超高压提取工艺优化

对杜氏盐藻β-胡萝卜素超高压辅助提取工艺参数进行优化研究,结果表明,6种溶剂中,无水乙醇的提取效果最好。在超高压辅助提取条件下,各溶剂的β-胡萝卜素得率排序为无水乙醇石油醚95%乙醇三氯甲烷乙腈乙酸乙酯;建立了超高压辅助提取杜氏盐藻β-胡萝卜素的数学模型,确定最佳工艺参数:液固比483m L/g,超高压压力346 MPa,保压时间13.7 min,结果β-胡萝卜素得率的预测值为1.07%。在优化条件下,β-胡萝卜素得率测定值为1.02%,说明提取模型的适应性良好。与常规的回流提取方法相比,超高压技术显著提高了杜氏盐藻β-胡萝卜素提取效率。