二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体的构建及原核表达

目的构建二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,构建含二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体突变基因质粒pUC57-d41,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,定向插入pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物。对目的蛋白进行纯化和复性,并进行抗原结合活性及相对稳定性检测。结果重组载体pET-d41经酶切鉴定,证实构建正确。表达产物相对分子质量约为28000,与理论预期值完全相符。目的蛋白最高表达量可占菌体总蛋白的45.48%。经Ni-NTA亲和层析法纯化并复性后,蛋白纯度达95%以上,抗HIV-1 gp41 dsFv具有抗原结合活性,稳定性优于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并获得表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

P53蛋白的原核表达及纯化

目的构建P53基因重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化。方法以pBabe-P53R质粒为模板,PCR扩增P53基因全序列,克隆至pGEX-4T-1载体中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-P53,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经不同配比的去垢剂复性后,用GlutathioneSepharose4Bgel亲和层析纯化。结果重组原核表达质粒pGEX-4T-1-P53经双酶切鉴定,表明构建正确。表达的GST-P53融合蛋白相对分子质量约80000,IPTG诱导时间以1h为宜。1%TritonX-100和1mmol/LEDTA为蛋白复性的最佳去垢剂。纯化的GST-P53融合蛋白可与羊抗人GST抗体和鼠抗人P53抗体发生特异性反应。500ml菌液可获得1mg纯化蛋白。结论已成功构建了P53基因重组原核表达质粒,表达并纯化了GST-P53融合蛋白,为研究NIRF与P53基因之间的相互关系奠定了基础。     

人心肌肌酸激酶MB同工酶的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化人心肌肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase MB,CK-MB)。方法分别从含CK-M、CK-B基因片段的质粒SC319293和SC119007中扩增CK-M、CK-B基因,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-CK-MB,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,经GST亲和层析柱纯化后,ELISA法检测其抗原性。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-CK-MB经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组CK-MB蛋白相对分子质量约110 000,表达量占菌体总蛋白的57%,主要以包涵体形式存在;纯化的CK-MB蛋白纯度大于90%,可与兔抗CK-B、CK-M多克隆抗体特异性结合。结论成功原核表达并纯化了重组CK-MB蛋白,为其大量生产奠定了基础。     

天蚕素A-蛙皮素杂合肽突变体的构建、表达及其抗菌活性

目的构建天蚕素A(1～8)-蛙皮素(1～12)杂合基因抗菌肽(CA-MA杂合肽)突变体,在大肠杆菌中融合表达,并进行抗菌活性检测。方法采用PCR体外定点突变技术,设计1对方向相反的引物,其中1个引物引入突变点,应用高保真的PolybestDNA多聚酶进行重组表达质粒pGEX-4T-1-CA-MA的PCR扩增,使CA-MA杂合肽第16位密码子由AGT突变为TGG。将扩增片段自身连接,构建CA-MA杂合肽突变重组表达质粒pGEX-4T-1-W16-CA-MA,转化E.coliBL21,IPTG诱导表达突变体蛋白W16-CA-MA,并对表达产物进行纯化。分离GST融合蛋白后,进行抗菌活性检测。结果重组突变表达质粒DNA测序结果表明,在预期位点发生了突变;突变蛋白在大肠杆菌中的表达量约占菌体总蛋白的18%;纯化后蛋白纯度可达75%以上,并具有一定的抗菌活性。结论已成功获得了具有抗菌活性的杂合肽突变体W16-CA-MA。     

抗黄曲霉毒素M1单链抗体基因克隆与蛋白结构模拟

为构建抗黄曲霉毒素M1单链抗体(scFv)基因,并进行蛋白质结构模拟及理化特性分析.采用重叠延伸PCR方法,以能特异性分泌抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1B12为原料,构建其单链抗体基因,进行测序,采用生物信息软件进行氨基酸序列推导、结构预测以及理化性质分析.抗黄曲霉毒素M1 scFv基因全长737 bp,对应245个氨基酸,单链抗体分子量约为25 897.4,等电点预测值6.90;二级结构显示抗黄曲霉毒素M1单链抗体含α螺旋38处,β折叠24处,延伸链74处,随机卷曲109处.三级结构建模显示重链(VH)和轻链(VL)的6个环区(CDR区),共同组成抗体的抗原结合区,符合scFv的结构特点,具有抗原结合位点的空间构象.构建了一个抗黄曲霉毒素M1 scFv基因,应用生物信息学技术所获得的预测和分析结果为该单链抗体的进一步表达、纯化和活性研究提供信息.     

抗HIV-1gp120单链抗体的原核表达与初步纯化

目的 在原核细胞表达抗HIV-1gp120单链抗体基因,纯化后检测其活性。方法 将单链抗体基因插入pET28原核表达载体进行诱导表达,对包涵体进行变性复性处理后,利用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达的蛋白进行初步纯化,纯化后的单链抗体与gp120标准抗原膜条反应。结果 表达产物主要以包涵体形式存在,最高表达量占菌体总蛋白量的51％,金属螯合层析一步纯化后纯度超过85％。纯化后的单链抗体可以特异地识别gp120标准抗原。结论 在原核细胞表达的单链抗体,复性纯化后具有生物学活性。     

抗HIV—lgp120单链抗体的原核表达与初步纯化

目的在原核细胞表达抗HIV－1gp120单链抗体基因，纯化后检测其活性。方法 将单链抗体基因插入pET28原核表达载体进行诱导表达，对包涵体进行变异性复性处理后，利用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达的蛋白进行初步纯化，纯化后的单链抗体与gp120标准抗原膜条反应。结果 表达产物主要以包涵体形式存在，最高表达量占菌体总蛋白量的51％，金属螯合层析一步纯化后纯度超过85％。纯化后的单链抗体可以特异地识别gp120标准抗原。结论 在原核细胞表达的单链抗体，复性纯化后具有生物学活性。     

NIRF蛋白的原核表达及纯化

目的 原核表达NIRF基因,并纯化NIRF蛋白。方法 PCR扩增全长NIRF基因,克隆入原核表达质粒pGEX-4T-1中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用GST 4B球珠亲和纯化目的蛋白。结果重组表达质粒pGST-NIRF经酶切鉴定证明构建正确。22℃条件下培养,菌体A600值达1.8时,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导7 h,能使GST-NIRF在上清中大量表达;纯化的重组GST-NIRF蛋白纯度达85%以上,可与GST抗体和NIRF抗体发生特异性结合。结论已成功在大肠杆菌中表达了GST-NIRF蛋白,纯化的蛋白可用于NIRF的生物功能活性研究。     

重组金黄色葡萄球菌肠毒素B的原核表达、纯化及其免疫原性

目的 对金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)基因定点突变体进行克隆、表达及纯化,并检测其免疫原性,为研制马抗SEB免疫球蛋白F(ab′)2制品奠定基础。方法 对SEB基因序列进行定点突变和修饰以及偏性密码子优化后,构建重组表达质粒pET-22b-SEB,转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组SEB蛋白,经离子交换层析纯化后,HPLC法检测重组SEB蛋白抗原纯度。Western blot法检测重组SEB蛋白抗原免疫活性;将不同浓度重组SEB蛋白抗原腹腔注射BALB/c小鼠,进行致病力、抗体效价、中和抗体活性检测。结果 质粒pET-22b-SEB经双酶切及测序鉴定证明构建正确。纯化的重组SEB蛋白相对分子质量约28 300,纯度大于90%,与天然SEB具有一致的免疫活性,且具有良好的安全性;免疫小鼠抗体效价达1∶81 920,可有效诱导小鼠产生中和抗体。结论 成功对SEB进行了定点突变减毒,经克隆、表达及纯化获得高纯度的重组SEB蛋白抗原,具有良好的免疫原性。     

人T淋巴细胞CD3ε链的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化人T淋巴细胞CD3ε(hCD3ε)链。方法以健康成人外周血单个核细胞总RNA为模板,采用RT-PCR法扩增人CD3ε链基因,并克隆入pCR-II载体,酶切鉴定及测序分析后,再定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达质粒pGEX-4T-3-hCD3ε,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果酶切分析及DNA测序证实,hCD3ε链基因被正确克隆入pGEX-4T-3载体,并能在原核系统中稳定表达。表达产物的相对分子质量为49 500,0.2 mmol/L IPTG 25℃诱导表达4.5 h,目的蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的29.3%,其中可溶性表达占12.8%。纯化的融合蛋白纯度可达86.1%,可分别被兔抗人CD3ε多抗和羊抗GST多抗识别。结论已成功地原核表达并纯化了GST-hCD3ε融合蛋白。     

蜱传脑炎病毒非结构蛋白1的原核表达、纯化及应用

目的 原核表达、纯化蜱传脑炎病毒（tick-borne encephalitis virus,TBEV）非结构蛋白1(non-structural protein 1,NS1),并评价其在蜱传脑炎（tick-borne encephalitis,TBE）临床诊断中的应用价值。方法 根据GenBank登录的TBEV“森张”株NS1基因序列设计引物,PCR扩增TBEV NS1基因,克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-NS1,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经GST bestarose 4FF亲和层析纯化后,Western blot检测其反应原性;以重组NS1蛋白为固相抗原,采用间接ELISA法检测临床血清。结果 重组表达质粒pGEX-4T-1-NS1经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约65 000,表达量为22.1%,主要以包涵体形式存在;纯化蛋白纯度达93%以上,与TBEV全病毒感染小鼠血清具有良好的反应原性。采用NS1作为包被抗原的间接ELISA法检测临床血清,特异性为95%,敏感度为10...     

抗肿瘤坏死因子-α单链抗体在大肠杆菌中的表达及表达条件的优化

目的构建抗肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)单链抗体(Single chain fragment variable,scFv)的原核高效表达体系,并优化表达条件。方法在引物中添加编码6×His的核苷酸片段,使目的蛋白C-末端带有6×His标签。从质粒pCANTAB 5E-scFv中PCR扩增scFv基因,连接至pBV220载体,连接产物分别转化至E.coli BL21(DE3)和DH5α中,42℃诱导表达,并对诱导时间、培养基pH值和类型进行优化,Western blot分析表达产物的反应原性。结果 PCR扩增出的scFv基因片段长度约770 bp,且序列正确;重组表达质粒pBV220-scFv经酶切鉴定证明构建正确;在E.coli BL21(DE3)中可获得表达,在E.coli DH5α中不表达;表达的重组scFv相对分子质量约为28 000,以包涵体形式存在于胞浆中,表达量约占菌体总蛋白的15%,且可与抗His-Tag抗体发生特异性反应;工程菌的最佳诱导表达条件为:以E.coli BL21(DE3)为宿主菌,在pH 7.4的LB培养基中,42℃诱导5 h。结论将scFv的表达载体更换为pBV220,可提高scFv的表达量,在优化表达条件下,scFv的表达水平进一步提高。     

抗人肿瘤坏死因子-α人源单克隆抗体在CHO细胞中的表达及鉴定

目的在CHO细胞中表达抗人肿瘤坏死因子(human tumor necrosis factor-alpha,h TNF-α)人源单克隆抗体,并对抗体纯化后进行鉴定。方法将含有编码抗h TNF-α人源单克隆抗体轻、重链可变区及恒定区基因的真核表达质粒p HL,利用脂质体Lipofectamine TM 2000转染CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选和单克隆筛选,获得分泌表达抗h TNF-α人源单克隆抗体的CHO细胞株。应用Mab Select Su Re和Capto adhere两步层析纯化抗体后,分析抗体的纯度、N-末端序列、结合动力学平衡常数及中和活性。结果经两步层析后,抗h TNF-α人源单抗经SDS-PAGE分析,可见纯度较好的抗体重链、轻链和完整抗体条带,SEC-HPLC纯度为98.79%;抗体的轻、重链N-末端氨基酸序列与预期一致,其结合动力学平衡常数(KD)为1.34×10-10 M,能拮抗TNF-α对L929细胞的杀伤作用,对TNF-α细胞毒的中和率达90%左右。结论在CHO细胞中成功表达了具有较好中和活性的抗h TNF-α人源单克隆抗体。     

小鼠脱氧核糖核酸酶Ⅱα融合基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的原核表达LHRH-TAT-DNaseⅡα融合基因(LTD),并制备多克隆抗体。方法采用PCR法克隆LTD基因片段,插入p ET-28a载体,构建重组原核表达质粒p ET-28a-LTD,转化大肠埃希菌BL21(Rossetta),经IPTG诱导表达。融合蛋白经电洗脱分离纯化后,免疫獭兔,制备LTD蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗血清效价。结果构建的重组原核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;纯化得到的融合蛋白相对分子质量为39 270,浓度为0.5 mg/ml,可被兔抗LTD抗体识别。血清抗体效价可达1∶6 400。结论成功原核表达了DNaseⅡ融合蛋白LTD,并制备了多克隆抗体,为进一步研究DNaseⅡ蛋白体内外抗肿瘤活性及作用机制奠定了基础。     

与A549细胞相关的旋毛虫抗原蛋白7TR单链抗体的筛选

目的筛选可与A549细胞相互作用的抗旋毛虫7TR单链抗体。方法 PCR法克隆旋毛虫7TR基因,连接至表达载体p ET-32a,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导后,将表达的7TR蛋白进行复性及亲合层析纯化;以纯化后的旋毛虫7TR蛋白为抗原,筛选Tomlinson(I+J)人源噬菌体单链抗体库,筛选并纯化阳性抗体,免疫荧光试验检测抗体与A549细胞的结合活性。结果重组表达质粒p ET-32a-7TR经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的旋毛虫7TR蛋白相对分子质量约50 000。共获得2株稳定分泌抗旋毛虫7TR蛋白单链抗体的E.coli HB2151菌株,命名为4C7和8G5;8G5可与重组7TR蛋白发生特异性结合,具有良好的反应原性,也可与A549细胞发生特异性结合。结论筛选出了与A549细胞具有结合活性的抗7TR单链抗体,为后续的临床应用奠定了基础。     

人溶菌酶-抗菌肽tachyplesins融合蛋白的原核表达及其抗菌活性

目的原核表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLYZ)和抗菌肽tachyplesins融合蛋白,并检测其抗菌活性。方法人工合成抗菌肽tachyplesins基因和linker,与pMD18-T-hLYZ上切下的hLYZ基因融合,将融合基因克隆至带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-1上,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达条件进行优化。表达的融合蛋白经亲和层析纯化后,进行抗菌活性检测。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-hLYZ-tachyplesins经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约44000处可见目的蛋白条带,诱导温度在25℃,IPTG终浓度为0.8mmol/L,诱导时间为6h,融合蛋白表达效果较好,主要以可溶性形式存在;纯化的融合蛋白纯度可达90%以上,对金黄葡萄球菌和大肠杆菌具有一定的抑制作用。结论已成功在原核细胞中表达了人溶菌酶-抗菌肽tachyplesins融合蛋白,纯化的融合蛋白具有一定的抗菌活性。     

钝顶螺旋藻超氧化物歧化酶的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化钝顶螺旋藻超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)。方法利用PCR技术扩增钝顶螺旋藻sod基因,克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-sod,转化大肠埃希菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。表达的重组融合蛋白SOD-GST利用蛋白纯化树脂Glutathione SepharoseTM4 Fast Flow纯化后,采用改进的邻苯三酚自氧化法测定重组SOD的活性。结果重组表达质粒pGEX-4T-sod经双酶切和测序证实构建正确;表达的融合蛋白SOD-GST的相对分子质量约为49 000,表达量占菌体总蛋白的30.2%,在重组菌裂解上清和沉淀中均有融合蛋白的表达;纯化的融合蛋白纯度为82.4%,浓度为2.8 mg/ml,从可溶性表达产物中纯化的酶的比活性为1 440 U/mg。结论在大肠埃希菌中成功表达并纯化了具有生物学活性的钝顶螺旋藻SOD,为其产业化生产奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌α-溶血素及其突变体的原核表达和免疫学活性

目的原核表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)α-溶血素(α-hemolysin,Hla)及其突变体,并检测其免疫学活性。方法采用PCR法从S.aureus中扩增hla基因,将该基因克隆至原核表达载体p ET28a中,构建重组表达质粒p ET28a-hla,并利用点突变试剂盒进行突变,获得重组质粒p ET28a-hlaH35L。将两种重组表达质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;表达的重组蛋白经Ni-NTA亲和层析和CM离子交换层析纯化后,检测其溶血活性、免疫血清的抑制溶血活性及HlaH35L蛋白的免疫保护作用。结果重组表达质粒p ET28a-hla经双酶切和测序证明构建正确;重组质粒p ET28a-hlaH35L的测序结果显示,第35位氨基酸突变位点与设计相符。表达的Hla和HlaH35L蛋白相对分子质量约为36 000,均为可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的50%,纯化后纯度均在90%以上。Hla具有溶血活性,溶血比活为152 HU/mg;HlaH35L无溶血活性;抗Hla和抗HlaH35L血清均具有抑制Hla溶血的活性;在小鼠滴鼻攻击模型中,HlaH35L具有一定的保护作用。结论成功在大肠埃希菌中表达了具有良好免疫学活性的Hla及其突变体HlaH35L,为筛选S.aureus候选疫苗组分奠定了实验基础。     

重组小鼠IL-33蛋白的原核克隆表达、纯化及生物学活性检测

目的:克隆鼠源白细胞介素33(murine interleukin-33)基因,构建大肠杆菌表达菌株,并对纯化后的蛋白进行生物活性的初步测定。方法:采用质粒抽提技术从大肠杆菌中提取质粒,构建p ET-32a-IL-33重组质粒;通过发酵罐培养技术获得蛋白,亲和层析方法纯化目的蛋白;ELISA检测纯化蛋白IL-33诱导产生TNF-α。结论:成功构建出鼠源IL-33的原核表达载体,成功表达出IL-33,IL-13能诱导TNF-α细胞因子的产生。     

呼吸道合胞病毒表位重组蛋白F1-F/M2的原核表达、纯化及其免疫原性

目的原核表达、纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)表位重组蛋白F1-F/M2,并检测其在小鼠体内的免疫原性,为RSV亚单位疫苗的研制、疫苗所致免疫病理反应机理的研究提供参考。方法利用定点突变技术对原核表达载体pGEX-6p-1进行改造,在其GST标签前制造一个HindⅢ酶切位点;从RSV long株中扩增F1片段,从质粒pET28a-G1-F/M2中扩增F/M2基因片段,并在克隆载体pUC19的辅助下,将F1-F/M2基因连接至改造后的pGEX-6p-1载体中,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-F1-F/M2,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6×His-tag标签蛋白纯化试剂盒纯化后,经尿素浓度梯度透析复性,SDS-PAGE分析其纯度,BCA法检测其浓度,Western blot法分析其反应原性。将纯化的重组蛋白F1-F/M2经铝佐剂乳化后,经腹腔免疫BALB/c小鼠,共3次,间隔10 d,末次免疫后10 d,采用空斑减少试验检测小鼠血清、肺组织匀浆和鼻腔冲洗液中抗RSV中和抗体水平;取小鼠脾脏,分离脾单个淋巴细胞,采用ELISAPOT技术检测重组蛋白诱导产生IFNγ的细胞免疫水平。结果重组表达质粒pGEX-6p-1-F1-F/M2经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白F1-F/M2相对分子质量约为20 800,表达量约占菌体总蛋白的20%,几乎全部以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白的纯度约为90%,浓度为0.42 mg/ml,可与小鼠抗RSV血清发生特异性反应;重组蛋白F1-F/M2能诱导小鼠血清中产生较高滴度的中和抗体(1∶289),肺部组织匀浆中略弱(1∶242),鼻腔冲洗液中未检测到中和抗体;重组蛋白F1-F/M2免疫小鼠的脾淋巴细胞经体外抗原刺激能产生特异性IFNγ斑点。结论成功原核表达了表位重组蛋白F1-F/M2,纯化后的重组蛋白能诱导产生较高滴度的中和抗体及CTL应答,有望开发成RSV亚单位疫苗。