兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒弱毒疫苗的创制

黄瓜花叶病毒（CMV）和马铃薯X病毒（PVX）在烟草中普遍存在、危害严重,对烟草产业健康发展有重大影响。为预防田间烟草上黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒,需要构建能够同时预防CMV和PVX的弱毒疫苗。本研究首先构建了CMV RNA2的2b蛋白提前终止突变体pCB301-CMVFny-R2-2bPT,在此突变体中插入200 bp的PVX保守序列（5890-6089）获得突变体质粒pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089。该突变体质粒与含野生型CMVFny RNA1和CMVFny RNA3的质粒等量混合后通过农杆菌浸润方法分别接种中烟100、红花大金元和林烟草,接种后烟草症状与野生型CMVFny-RNA1+RNA2+RNA3混合接种烟草症状相比显示弱侵染性。疫苗遗传稳定性检测证实疫苗载体中插入的PVX 200 bp保守片段稳定存在,CMV和PVX强毒株系攻毒试验表明该弱毒疫苗在中烟100上对CMV和PVX同时具备交叉保护作用。     

黔南烟草马铃薯Y病毒(PVY)株系的分子鉴定

为了揭示贵州省黔南烟区马铃薯Y病毒(PVY)株系分布及分子变异规律,先利用血清学方法初步鉴定PVY株系,再选择19个PVY分离物进行分子鉴定.结果表明,克隆的19个PVY cDNA片段全长均为1074 nts,包含1个801 nts的完整cp基因,编码266个氨基酸.序列比对发现,19个黔南PVY分离物cp基因核苷酸序列相似性为87.0％ ～ 99.9％,与GenBank登录的其他17个PVY株系cp基因序列相似性为86.6％ ～ 99.9％.系统进化树分析表明,黔南烟区19个PVY分离物中,有3个PVY分离物与PVYN株系和PVYNTN亲缘关系较近,而其他16个PVY分离物与PVYNN:O株系的亲缘关系最近.     

贵州黔南烟草马铃薯Y病毒(PVY)株系的血清学鉴定

2010年从贵州省黔南州烟草产区共采集201个表现明显马铃薯Y病毒病症状的烟草样本。采用Tas-ELISA检测PVY的3个株系PVYN、PVYO和PVYC。结果显示,201个样本中共检测出171个样本受到PVY侵染,其中PVYN37个,占21.6%;PVYO133个,占77.8%;PVYC0个,PVYN和PVYO复合侵染1个,占0.6%。PVY株系分布具有一定规律,侵染黔南州烟草的PVY以PVYO为主要株系,PVYN侵染相对较少,为次要株系,所有样本均没有检测到PVYC侵染,复合侵染零星发生。     

某些因素对烤烟病毒病(PVY、CMV、TMV)发病程度的影响调查

１９９６年在河南省宝丰县、襄城县和叶县，花叶病普遍较常年严重，故此对２０种类型烤烟大田的病毒病（ＰＶＹ、ＣＭＶ、ＴＭＶ）发病率和病情指数进行了调查。每种因素两种类型烟田的病毒病发病率差异和病情指数差异用新复全距法（ＳＳＲ）进行检验。结果表明，麦烟套种、地膜覆盖、距公路较远种烟和轮作显著减轻病毒病；ＮＣ８９烟田和砂质土烟田分别比Ｇ８０、Ｋ３２６烟田和粘质土烟田病毒病显著减轻；幼苗剪叶、土施微肥（Ｚｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｂ）、移栽相对早晚和浇水相对早晚对烤烟病毒病发病程度无显著影响。     

病毒诱导的基因沉默防控烟草马铃薯Y病毒病研究

  背景  病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）是植物抗病毒侵染的一种自然机制。  方法  以马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）脉坏死株系（PVYN）的外壳蛋白（coat protein, CP）基因为靶向序列,构建烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默表达载体pTRV2-CP,转化农杆菌GV3101后,与pTRV1-GV3101混合成TRV: : CP（OD₆₀₀ 0.4~0.6）喷施处理剪叶后的烟苗,测定其侵染效率。人工接种PVY于对照及TRV: : CP处理的烟苗,RT-qPCR检测、表型观察和小区试验评价TRV介导的VIGS体系对PVY侵染的沉默效果。  结果  ① 与TRV: : 00相比,接种PVY 35 d时,TRV: : CP处理的烟株中PVY累积量减少了72.8%;②VIGS表达载体45 d内能有效表达;③温室盆栽和田间小区试验TRV: : CP处理对PVY防治效果分别达到85.12%和73.08%。  结论  研究建立的VIGS体系能够沉默PVY CP基因的表达,有效防治烟草马铃薯Y病毒病,为PVY的防治提供了新的方法。      

烟草马铃薯Y病毒综合防治技术试验报告

试验表明，该病来源于烟田邻近的马铃薯地块的感病马铃薯植株。烟田离马铃薯地近发病率高，反之则低。蚜虫是主要传毒媒介。作业不科学也可传毒。综合预防措施：远离马铃薯地，及时消灭蚜虫，科学进行田间作业等；发病初期喷药物“病毒Ａ”控制该病有较好效果     

TMV、CMV和PVY三重荧光定量PCR同步检测方法的建立

为建立同时检测烟草普通花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯Y病毒(PVY)的多重荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中TMV、CMV及PVY的CP基因保守序列设计引物和探针,并对反应体系进行了优化,建立了可同时检测TMV、CMV和PVY的三重荧光定量PCR方法,并评价了该方法的敏感性、特异性、重复性及准确性。结果显示,建立的方法中TMV、CMV和PVY的检测下限分别为2.60×10¹、1.25×10¹、2.33×10¹ copies/μL,检测灵敏度比普通PCR法提高10倍;该方法可特异性检测出TMV、CMV和PVY,但烟草蚀纹病毒(TEV)、烟草脉带花叶病毒(TVBMV)和番茄斑萎病毒(TSWV)无法检出且无交叉反应,批内与批间重复性试验变异系数均小于1.5%,24份样本检测结果中TMV、CMV和PVY的阳性检出率分别为75%、100%和41.67%,且三重荧光定量PCR方法与普通单重PCR方法得出一致的检测结果。结果表明本研究建立的三重荧光定量PCR检测方法具有特异性强、稳定性好、准确性高等优点...     

卷烟携带烟草普通花叶病毒(TMV)的测定研究

对国内15个省市34个卷烟厂家64个品牌的卷烟样品生物检测结果表明,TMV检出率为67.69%;不论是混合型还是烤烟型以及不同等级的卷烟样品都可以检出。卷烟烟丝研磨液和不同浓度的TMV汁液一样,接种后足以导致烟苗发病。      

烟草种质资源抗马铃薯Y病毒病基因型鉴定

  背景和目的  从作物种质资源中进行等位基因鉴定,特别是优异等位基因的发掘和应用,是使种质资源加速转变为基因资源的关键所在。  方法  采用苗期汁液摩擦接种的方法,对烟草种质资源的马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）抗病性进行鉴定;通过烟草隐性抗PVY基因eIF4E1（又称为感PVY基因eIF4E1）等位性测验、等位基因分子标记检测和RT-PCR扩增测序,对PVY抗病资源进行基因型分析。  结果  （1）从收集到的900多份来自国内外的烟草种质资源中筛选出19份高抗PVY资源。（2）根据等位性测验结果推断19份抗源所具有的PVY抗性均由eIF4E1基因所控制。（3）等位基因分子标记检测和RT-PCR扩增测序结果将19份抗源的eIF4E1基因区分为4种突变类型。  结论  本研究结果丰富了我国对抗PVY烟草种质资源的筛选和利用的内容,为后续烟草PVY抗性优异等位基因的发掘和育种利用提供了基础材料和信息支撑。      

烟草马铃薯Y病毒病流行规律的初步研究

根据1996~2002年有关气象因素的数据,建立了气温、降水量与PVY病情指数的相关方程。选用几种模型对PVY的流行规律进行拟合检验,确定Gompertz模型为短期流行过程的最优拟合方程,并建立了流行速率与有翅蚜量关系的模型。根据田间病情调查的结果,初步得出模拟病害近距离传播的时空动态模型。     

过氧化物酶活性与烟草对马铃薯Y病毒抗性关系的研究

本文测定了接种马铃薯Y病毒脉坏死株系后烟草抗病转基因品系9608(转PVY-NIb的NC89)和非转基因NC89叶片组织透性和过氧化物酶活性,并对过氧化物酶同工酶带谱进行了分析。结果表明,抗病转基因9608和感病NC89叶片的组织透性与叶片内过氧化物酶活性的变化趋势一致,两者在接种后均呈增高趋势,但感病NC89的增高幅度明显高于抗病转基因9608;接种后,转基因9608和非转基因NC89的过氧化物同工酶均出现了一条新酶带,9608的新酶带在接种后第2d开始出现,而NC89的新酶带则在接种后第6d开始出现,且明显强于9608。      

烟草上马铃薯Y病毒的RT-PCR检测

本文根据已报道的PVY CP基因序列,设计合成了2套扩增PVY CP基因全序列和中间部分序列的寡核苷酸引物,用两套程序分别对马铃薯Y病毒普通株系(PV YO)和马铃薯Y病毒坏死株系PV YN) CP基因进行RT-PCR扩增,结果分别得到了与预期大小一致的804和301bp片段,健康植株对照中未扩增到任何产物,建立了RT-PCR检测烟草上马铃薯Y病毒的程序。      

防治烟草花叶病的药剂试验

室内分别以TMV和CMV的枯斑寄主心叶烟和苋色黎为测试寄主，采用全叶法接种，对接种叶片分接种前和接种后半叶法涂几种病毒抑制剂，结果表明，病毒敌无论在接种前后涂施，对TMV和CMV都有较好的抑制效果，接种前在心叶烟和苋色黎上抑制率分别为69.20%和68.06%，接种后抑制率分别为67.20%和42.86%；植病灵和病毒A在接种前涂施对TMV和CMV均有较好抑制效果。达到62%（在46.74%-62.11%之间）；接种后涂施抑制效果较差，小区和大田试验选用4种病毒抑制剂，对烟草蚜传病毒进行大田防治试验，结果表明，20%病毒敌可湿性粉剂500倍液防治效果最好，能有效地抑制病毒的侵染，推迟病毒的发生时期，减慢病情的发展速度，平均防治效果为58.4%，其次为金叶宝防效为51.4%，2种药剂的防治效果差异达到极显著，介于匀极显著地高于其它几种供试药剂。     

烟草花叶病毒强、弱毒株对烟草植株的影响

分别接种烟草花叶病毒强毒株（TMV-W）、诱变获得的两个弱毒株（TMV-017、TMV-152）于普通烟（品种为K326）。间接ELISA法测定了强，弱毒株在接种叶上的增殖速率，同时考察了叶绿素a、叶绿素b，叶绿素，可溶蛋白含量的变化。实验发现强毒株在接种后第2d就可检测到，而弱毒株在第3d被检测到，弱毒株在烟草植株体内的稳定浓度低于强毒株，分别受强，弱毒株侵染的烟草叶片中的叶绿素a,叶绿素b，叶绿素含量都有所下降，但强毒株引起的下降幅度最大。受强，弱毒株分别侵染的烟叶中可溶性蛋白含量均发生变化，初期都有所升高，之后，弱毒株随着侵染时间的延长而有所下降，而强毒株下降后又有所回升。     

烟草花叶病药剂防治效果及其机理研究

本文研究了复方氨基酸等10种药剂对烟草花叶病的防治效果及其防治机理。结果表明:(1)复方氨基酸、抗毒增产剂、植物生理平衡剂、水杨酸和硫酸锌等5种药剂对烟草花叶病均具有一定的预防效果,其中以前两种药剂预防效果最好,防效达58.3%。此外,复方氨基酸还具有较好的治疗作用,治疗效果亦达52.1%;(2)药剂处理可在一定程度上延缓烟株矮化和减轻个体发病程度,抗毒增产剂、硫酸锌、5%菌毒清和复方氨基酸等4种药剂效果明显,尤以前两种药剂刺激烟株生长效果最为明显,株高反而超过无病的健株;(3)药剂处理可使烟草叶片内SOD和POD活性上升,而CAT活性下降,其中复方氨基酸等5种防病效果较好的药剂对酶的活性影响也最大。药剂防治效果与烟叶内SOD、POD活性呈正相关,而与CAT活性呈负相关。      

马铃薯Y病毒与介体蚜虫传毒的关系研究进展

对蚜虫的传毒特性、影响传毒效率的因素、传毒机制、蚜虫传播与马铃薯Y病毒病发生流行的关系、蚜虫带毒的检测方法、治蚜与防病的关系等方面的研究进展进行了综述。     

TMV、PVY福建分离物分子鉴定及末端区域变异分析

为及时准确地鉴定出病毒病原和追踪了解病毒病流行变异趋势,使用特异性引物对福建烟区病毒烟叶样品进行RT-PCR分析,分别鉴定出病毒病原为TMV和PVY.序列测定结果表明PCR扩增产物为预期的TMV 5'末端和PVY 3'末端序列,大小分别为959和646个核苷酸,均包含末端非编码区和部分病毒功能基因蛋白编码区.将所获得的病毒末端序列与国内外报道的主要病毒分离物的同一区域进行比较,分析结果显示TMV 5'端非编码区保守性极强,不同分离物之间部分126 kDa或183 kDa编码蛋白N端编码区表现出一定程度的变异(突变),PVY外壳蛋白编码区与3'末端非编码区变异数量差异不大,变异(突变)均主要为碱基转换,环境自然选择压力对病毒基因组变异(突变)具有一定的影响.     

烟草与黄瓜花叶病毒互作中过氧化氢酶活性的变化

研究了12个不同抗性水平的烟草品种接种黄瓜花叶病毒前后过氧化氢酶活性的动态变化及其与烟草抗病性的关系。结果表明,接种病毒后抗、感品种的过氧化氢酶活性总体水平比对照降低,但酶活性的动态变化规律与烟草抗病性之间的相关性并不显著。利用DPS数据处理系统分析表明:酶活性变化差值及其平均值与病情指数之间均不存在显著相关性,说明以接种前后植物体内酶活性的变化值作为抗病性鉴定的指标在烟草-黄瓜花叶病毒体系中是不可行的。