兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒弱毒疫苗的创制

黄瓜花叶病毒（CMV）和马铃薯X病毒（PVX）在烟草中普遍存在、危害严重,对烟草产业健康发展有重大影响。为预防田间烟草上黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒,需要构建能够同时预防CMV和PVX的弱毒疫苗。本研究首先构建了CMV RNA2的2b蛋白提前终止突变体pCB301-CMV_Fny-R2-2bPT,在此突变体中插入200 bp的PVX保守序列（5890-6089）获得突变体质粒pCB301-CMV_Fny-R2-2bPT-PVX_5890-6089。该突变体质粒与含野生型CMV_Fny RNA1和CMV_FnyRNA3的质粒等量混合后通过农杆菌浸润方法分别接种中烟100、红花大金元和林烟草,接种后烟草症状与野生型CMV_Fny-RNA1+RNA2+RNA3混合接种烟草症状相比显示弱侵染性。疫苗遗传稳定性检测证实疫苗载体中插入的PVX 200 bp保守片段稳定存在,CMV和PVX强毒株系攻毒试验表明该弱毒疫苗在中烟100上对CMV和PVX同时具备交叉保护作用。     

黔南烟草马铃薯Y病毒(PVY)株系的分子鉴定

为了揭示贵州省黔南烟区马铃薯Y病毒(PVY)株系分布及分子变异规律,先利用血清学方法初步鉴定PVY株系,再选择19个PVY分离物进行分子鉴定.结果表明,克隆的19个PVY cDNA片段全长均为1074 nts,包含1个801 nts的完整cp基因,编码266个氨基酸.序列比对发现,19个黔南PVY分离物cp基因核苷酸序列相似性为87.0％ ～ 99.9％,与GenBank登录的其他17个PVY株系cp基因序列相似性为86.6％ ～ 99.9％.系统进化树分析表明,黔南烟区19个PVY分离物中,有3个PVY分离物与PVYN株系和PVYNTN亲缘关系较近,而其他16个PVY分离物与PVYNN:O株系的亲缘关系最近.     

贵州黔南烟草马铃薯Y病毒(PVY)株系的血清学鉴定

2010年从贵州省黔南州烟草产区共采集201个表现明显马铃薯Y病毒病症状的烟草样本。采用Tas-ELISA检测PVY的3个株系PVYN、PVYO和PVYC。结果显示,201个样本中共检测出171个样本受到PVY侵染,其中PVYN37个,占21.6%;PVYO133个,占77.8%;PVYC0个,PVYN和PVYO复合侵染1个,占0.6%。PVY株系分布具有一定规律,侵染黔南州烟草的PVY以PVYO为主要株系,PVYN侵染相对较少,为次要株系,所有样本均没有检测到PVYC侵染,复合侵染零星发生。     

某些因素对烤烟病毒病(PVY、CMV、TMV)发病程度的影响调查

１９９６年在河南省宝丰县、襄城县和叶县，花叶病普遍较常年严重，故此对２０种类型烤烟大田的病毒病（ＰＶＹ、ＣＭＶ、ＴＭＶ）发病率和病情指数进行了调查。每种因素两种类型烟田的病毒病发病率差异和病情指数差异用新复全距法（ＳＳＲ）进行检验。结果表明，麦烟套种、地膜覆盖、距公路较远种烟和轮作显著减轻病毒病；ＮＣ８９烟田和砂质土烟田分别比Ｇ８０、Ｋ３２６烟田和粘质土烟田病毒病显著减轻；幼苗剪叶、土施微肥（Ｚｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｂ）、移栽相对早晚和浇水相对早晚对烤烟病毒病发病程度无显著影响。     

病毒诱导的基因沉默防控烟草马铃薯Y病毒病研究

  背景  病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）是植物抗病毒侵染的一种自然机制。  方法  以马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）脉坏死株系（PVYN）的外壳蛋白（coat protein, CP）基因为靶向序列,构建烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默表达载体pTRV2-CP,转化农杆菌GV3101后,与pTRV1-GV3101混合成TRV: : CP（OD₆₀₀ 0.4~0.6）喷施处理剪叶后的烟苗,测定其侵染效率。人工接种PVY于对照及TRV: : CP处理的烟苗,RT-qPCR检测、表型观察和小区试验评价TRV介导的VIGS体系对PVY侵染的沉默效果。  结果  ① 与TRV: : 00相比,接种PVY 35 d时,TRV: : CP处理的烟株中PVY累积量减少了72.8%;②VIGS表达载体45 d内能有效表达;③温室盆栽和田间小区试验TRV: : CP处理对PVY防治效果分别达到85.12%和73.08%。  结论  研究建立的VIGS体系能够沉默PVY CP基因的表达,有效防治烟草马铃薯Y病毒病,为PVY的防治提供了新的方法。      

烟草马铃薯Y病毒综合防治技术试验报告

试验表明，该病来源于烟田邻近的马铃薯地块的感病马铃薯植株。烟田离马铃薯地近发病率高，反之则低。蚜虫是主要传毒媒介。作业不科学也可传毒。综合预防措施：远离马铃薯地，及时消灭蚜虫，科学进行田间作业等；发病初期喷药物“病毒Ａ”控制该病有较好效果     

TMV、CMV和PVY三重荧光定量PCR同步检测方法的建立

为建立同时检测烟草普通花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）和马铃薯Y病毒（PVY）的多重荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中TMV、CMV及PVY的CP基因保守序列设计引物和探针,并对反应体系进行了优化,建立了可同时检测TMV、CMV和PVY的三重荧光定量PCR方法,并评价了该方法的敏感性、特异性、重复性及准确性。结果显示,建立的方法中TMV、CMV和PVY的检测下限分别为2.60×10¹、1.25×10¹、2.33×10¹ copies/μL,检测灵敏度比普通PCR法提高10倍;该方法可特异性检测出TMV、CMV和PVY,但烟草蚀纹病毒（TEV）、烟草脉带花叶病毒（TVBMV）和番茄斑萎病毒（TSWV）无法检出且无交叉反应,批内与批间重复性试验变异系数均小于1.5%,24份样本检测结果中TMV、CMV和PVY的阳性检出率分别为75%、100%和41.67%,且三重荧光定量PCR方法与普通单重PCR方法得出一致的检测结果。结果表明本研究建立的三重荧光定量PCR检测方法具有特异性强、稳定性好、准确性高等优点,可为后续TMV、CMV和PVY的病害诊断与流行调查提供技术支持。     

卷烟携带烟草普通花叶病毒(TMV)的测定研究

对国内15个省市34个卷烟厂家64个品牌的卷烟样品生物检测结果表明,TMV检出率为67.69%;不论是混合型还是烤烟型以及不同等级的卷烟样品都可以检出。卷烟烟丝研磨液和不同浓度的TMV汁液一样,接种后足以导致烟苗发病。      

烟草种质资源抗马铃薯Y病毒病基因型鉴定

  背景和目的  从作物种质资源中进行等位基因鉴定,特别是优异等位基因的发掘和应用,是使种质资源加速转变为基因资源的关键所在。  方法  采用苗期汁液摩擦接种的方法,对烟草种质资源的马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）抗病性进行鉴定;通过烟草隐性抗PVY基因eIF4E1（又称为感PVY基因eIF4E1）等位性测验、等位基因分子标记检测和RT-PCR扩增测序,对PVY抗病资源进行基因型分析。  结果  （1）从收集到的900多份来自国内外的烟草种质资源中筛选出19份高抗PVY资源。（2）根据等位性测验结果推断19份抗源所具有的PVY抗性均由eIF4E1基因所控制。（3）等位基因分子标记检测和RT-PCR扩增测序结果将19份抗源的eIF4E1基因区分为4种突变类型。  结论  本研究结果丰富了我国对抗PVY烟草种质资源的筛选和利用的内容,为后续烟草PVY抗性优异等位基因的发掘和育种利用提供了基础材料和信息支撑。      

烟草CN基因的RNA沉默载体构建与功能分析

黄花烟HZNH是我国特有的地方种质资源,接种烟草花叶病毒(TMV)后表现出超敏反应和系统获得性抗性。目前,已从HZNH中克隆到1个同TMV抗病基因N基因同源的基因,命名为CN基因。为方便利用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术研究烟草CN基因的功能,构建了用于RNAi的植物转化载体pPZYICN。通过农杆菌介导的叶盘法转化含N基因的烟草Xanthi-nc,获得了32株转基因植株,TMV接种后,转基因Xanthi-nc没有丧失对TMV的抗性,说明CN基因的RNA干扰载体不能沉默N基因的表达,故CN基因可能是HZNH中特有的抗性基因,从而为获得新的烟草抗病基因及抗病品种奠定基础。     

TMV、PVY福建分离物分子鉴定及末端区域变异分析

为及时准确地鉴定出病毒病原和追踪了解病毒病流行变异趋势,使用特异性引物对福建烟区病毒烟叶样品进行RT-PCR分析,分别鉴定出病毒病原为TMV和PVY.序列测定结果表明PCR扩增产物为预期的TMV 5'末端和PVY 3'末端序列,大小分别为959和646个核苷酸,均包含末端非编码区和部分病毒功能基因蛋白编码区.将所获得的病毒末端序列与国内外报道的主要病毒分离物的同一区域进行比较,分析结果显示TMV 5'端非编码区保守性极强,不同分离物之间部分126 kDa或183 kDa编码蛋白N端编码区表现出一定程度的变异(突变),PVY外壳蛋白编码区与3'末端非编码区变异数量差异不大,变异(突变)均主要为碱基转换,环境自然选择压力对病毒基因组变异(突变)具有一定的影响.     

过氧化物酶活性与烟草对马铃薯Y病毒抗性关系的研究

本文测定了接种马铃薯Y病毒脉坏死株系后烟草抗病转基因品系9608(转PVY-NIb的NC89)和非转基因NC89叶片组织透性和过氧化物酶活性,并对过氧化物酶同工酶带谱进行了分析。结果表明,抗病转基因9608和感病NC89叶片的组织透性与叶片内过氧化物酶活性的变化趋势一致,两者在接种后均呈增高趋势,但感病NC89的增高幅度明显高于抗病转基因9608;接种后,转基因9608和非转基因NC89的过氧化物同工酶均出现了一条新酶带,9608的新酶带在接种后第2d开始出现,而NC89的新酶带则在接种后第6d开始出现,且明显强于9608。      

贵州省安顺烟区烟草主要病毒种类及复合侵染类型分析

为明确贵州省安顺烟区烟草主要病毒毒源种类和侵染类型,2023年从安顺烟区采集表现为花叶、叶脉扭曲坏死、畸形、闪电斑和斑点黄化等症状的烟草样品306份,并利用烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、马铃薯Y病毒（PVY）、烟草脉带花叶病毒（TVBMV）和辣椒脉斑驳病毒（ChiVMV）5种主要病毒病特异性引物进行RT-PCR扩增检测,统计病毒的检出率并分析复合侵染类型。结果显示：总病毒检出率为89.87%。其中,TMV占比最高,为81.70%;ChiVMV次之,为67.97%;CMV占比最低,为16.34%。复合侵染是主要的侵染类型,检出率为68.30%。其中,ChiVMV+TMV类型占比最高,为22.88%,其次是ChiVMV+TMV+TVBMV、ChiVMV+TMV+PVY和ChiVMV+TMV+CMV 3种类型,分别占11.11%、10.46%和9.15%。贵州省安顺烟区烟草病毒病的优势毒源为TMV和ChiVMV,复合侵染普遍发生,以ChiVMV+TMV复合侵染类型为主。     

烟草马铃薯Y病毒病流行规律的初步研究

根据1996~2002年有关气象因素的数据,建立了气温、降水量与PVY病情指数的相关方程。选用几种模型对PVY的流行规律进行拟合检验,确定Gompertz模型为短期流行过程的最优拟合方程,并建立了流行速率与有翅蚜量关系的模型。根据田间病情调查的结果,初步得出模拟病害近距离传播的时空动态模型。     

几种防治烟草普通花叶病药剂的田间药效

为给防治烟草普通花叶病的药剂选择提供依据 ,进行了“毒消”6 0 0倍、“病毒必克”5 0 0倍 (药剂 )和氨基酸 30 0倍、“丰农”5 0 0倍 (叶面肥 )田间防效试验。结果表明 ,烟株发病初期开始施药 ,“毒消”6 0 0倍在首次施药后防效达 73.2 4 % ,第 3次施药后各药剂防效下降并在停止施药后 30d病情发生反弹 ;烟株发病中期开始施药 ,首次施药后“病毒必克”5 0 0倍防效达 75 .90 % ,此后各药剂防效均下降 ;氨基酸30 0倍和“丰农”5 0 0倍防效较差     

烟草与黄瓜花叶病毒互作中过氧化氢酶活性的变化

研究了12个不同抗性水平的烟草品种接种黄瓜花叶病毒前后过氧化氢酶活性的动态变化及其与烟草抗病性的关系。结果表明,接种病毒后抗、感品种的过氧化氢酶活性总体水平比对照降低,但酶活性的动态变化规律与烟草抗病性之间的相关性并不显著。利用DPS数据处理系统分析表明:酶活性变化差值及其平均值与病情指数之间均不存在显著相关性,说明以接种前后植物体内酶活性的变化值作为抗病性鉴定的指标在烟草-黄瓜花叶病毒体系中是不可行的。     

防治烟草花叶病的药剂试验

室内分别以TMV和CMV的枯斑寄主心叶烟和苋色黎为测试寄主，采用全叶法接种，对接种叶片分接种前和接种后半叶法涂几种病毒抑制剂，结果表明，病毒敌无论在接种前后涂施，对TMV和CMV都有较好的抑制效果，接种前在心叶烟和苋色黎上抑制率分别为69.20%和68.06%，接种后抑制率分别为67.20%和42.86%；植病灵和病毒A在接种前涂施对TMV和CMV均有较好抑制效果。达到62%（在46.74%-62.11%之间）；接种后涂施抑制效果较差，小区和大田试验选用4种病毒抑制剂，对烟草蚜传病毒进行大田防治试验，结果表明，20%病毒敌可湿性粉剂500倍液防治效果最好，能有效地抑制病毒的侵染，推迟病毒的发生时期，减慢病情的发展速度，平均防治效果为58.4%，其次为金叶宝防效为51.4%，2种药剂的防治效果差异达到极显著，介于匀极显著地高于其它几种供试药剂。