基于iTRAQ-PRM技术筛选不同类型土壤烤烟根系差异表达蛋白

  目的  从蛋白质水平揭示烤烟根系对不同类型土壤的响应差异。  方法  以烤烟品种K326为材料,选取石灰岩土（沙壤土）、水稻土和红壤土,测定3种类型土壤烤烟根系活力、硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）和天冬氨酸合成酶（AS）活性;利用iTRAQ技术鉴定3种类型土壤烤烟根系差异表达蛋白,对所获得的差异蛋白进行生物信息学分析,从中选择16个蛋白进行平行反应监测（PRM）验证。  结果  （1）红壤土的烤烟根系活力、NR、GS和AS活性均高于沙壤土和水稻土;（2）从水稻土vs沙壤土、沙壤土vs红壤土、水稻土vs红壤土3组对比中分别鉴定出699、650、569个烤烟根系差异表达蛋白,其中上调/下调蛋白分别为412/287、291/359和323/246个;（3）差异蛋白质主要有催化、结合、转运活性等功能;（4）差异蛋白功能富集于次生代谢产物的生物合成、代谢途径和苯丙烷类生物合成等代谢途径;（5）红壤土烤烟根系与抗逆性、碳水化合物和能量代谢、蛋白质合成等相关的差异蛋白表达均高于沙壤土和水稻土。  结论  利用iTRAQ标记技术,结合PRM验证技术筛选出不同类型土壤烤烟根系差异表达蛋白,为获取响应关键蛋白奠定基础。      

烟叶烘烤过程中蛋白质的降解及相关酶活性的变化

  目的  明确不同成熟度烤烟烘烤过程中蛋白质降解规律。  方法  以K326为材料,分析烟叶蛋白质、游离氨基酸含量,内肽酶、氨肽酶和羧肽酶活性变化情况。  结果  1）烘烤过程中,烟叶蛋白质含量持续下降;2）蛋白质的降解幅度与内肽酶活性密切相关。与尚熟烟叶相比,适熟和过熟烟叶在变黄前期内肽酶活性最高,蛋白质含量降解幅度大。3）游离氨基酸含量升高幅度与氨肽酶和羧肽酶活性有关。与适熟和过熟烟叶相比,尚熟烟叶在变黄后期,氨肽酶和羧肽酶活性较高。  结论  适当延长变黄期（36~38℃）烘烤时间,有利于保持烟叶内肽酶的活性,减少不同成熟度烘烤烟叶中蛋白质的含量。      

烤烟不同成熟度上部叶中抗性淀粉与淀粉组分的变化及其与基因表达的关系

  目的  为研究烤烟上部叶在成熟后期及烘烤过程中淀粉组分和抗性淀粉含量的变化。  方法  以烤烟品种云烟87上部叶为试验材料,分析不同成熟度鲜烟叶及其在烘烤过程中淀粉组分和抗性淀粉含量的变化,阐明抗性淀粉和淀粉组分的相关性,通过实时定量PCR探究不同成熟度烟叶中淀粉合成相关基因的表达模式。  结果  （1）随烟叶不断成熟,淀粉粒数量迅速变多、体积增大,烟叶变黄时,叶绿体开始解体,淀粉粒逐渐降解。（2）不同成熟度鲜烟叶中直链淀粉含量与支链淀粉含量:欠熟 > 适熟 > 过熟,而抗性淀粉含量差异不大;在烟叶衰老过程中,支链淀粉迅速降解,而直链淀粉和抗性淀粉缓慢降解。（3）在烘烤过程中,淀粉降解主要集中在变黄期。烘烤结束后,烤烟中未降解的淀粉约50%为抗性淀粉。（4）淀粉合成基因葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶小亚基3（AGPS3）、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶大亚基（AGPL）、颗粒结合型淀粉合酶（GBSS）、可溶性淀粉合酶2（SS2）、1, 4-a-葡聚糖分支酶（SBE1）、2, 3淀粉分支酶2（SBE2）和异淀粉酶2（ISA2）在欠熟烟叶中的基因表达水平较高,随烟叶衰老表达水平下调,而异淀粉酶3（ISA3）的基因表达水平在烟叶衰老过程中持续上调。  结论  烤烟不同成熟度上部叶中存在抗性淀粉,烘烤过程的变黄期是烟叶内淀粉降解的主要时期,但大田期形成的抗性淀粉很难在烘烤过程中充分降解。因此,可以通过适当推迟烟叶采收,降低烤烟淀粉含量,从而提高上部叶可用性。      

品种、部位和成熟度对烟叶淀粉含量及评吸质量的影响

用红大和K326烤烟品种的上、中、下3个部位的未熟烟叶、初熟烟叶、适熟烟叶和过熟烟叶进行烘烤对比试验,测定烤前、烤后烟叶淀粉含量,并对初烤烟叶进行评吸鉴定。结果表明,2个品种烟叶的淀粉含量差异达到显著或极显著水平,烟叶在烘烤过程中淀粉含量显著降低,不同部位鲜烟叶淀粉含量存在着极显著差异;烘烤后,中、上部烟叶与下部烟叶之间的淀粉含量差异达到极显著水平,中部与上部烟叶之间淀粉含量差异不显著;不同成熟度档次之间的烟叶淀粉含量的差异在烘烤前后均达到极显著水平。评吸结果表明,适熟和初熟烟叶香吃味较优,过熟烟叶香吃味次之,未熟烟叶的香吃味较差。讨论提出,适熟采收是降低烟叶淀粉含量,改善烟叶香吃味的一项重要技术措施。     

低钾胁迫下烤烟苗期叶片的差异蛋白及其生物信息学分析

  目的  探究低钾胁迫下烤烟苗期叶片的差异表达蛋白, 并对其进行生物信息学分析, 为烟草品种选育与栽培调控奠定基础。  方法  分别在低钾和正常钾环境下培育烤烟高钾品系HKDN-5, 提取苗期烟叶总蛋白, 进行酶解, 液相色谱串联质谱和label-free蛋白定量分析。  结果  (1) 与正常钾相比, 低钾胁迫中发现101个差异表达蛋白(差异倍数大于1.5倍), 其中表达下调的有52个, 上调的有49个。(2)差异表达蛋白主要参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢和脂质代谢等途径。其中, 上调蛋白具有碳水化合物运输和代谢相关功能的数量最多, 下调蛋白具有翻译后修饰、蛋白质转换和伴侣蛋白等相关功能的数量最多。  结论  物质代谢和应激反应相关蛋白在低钾胁迫下发生差异表达。      

商业烟叶收购等级质量与工业认可度比较研究

  目的  从卷烟工业企业的角度对收购烟叶的等级质量进行分析和评价,引导烟叶基地单元生产和收购的烟叶更加符合工业企业的需求。  方法  以某乡镇79户烟农2020年交售的7个主要商业收购等级（B1F、B2F、B3F、C2F、C3F、C4F、X2F）共4150包烟叶为研究对象,依据烟叶质量及工业可用性的高低将7个商业收购等级分成22个工业等级,从“试验区”和“烟农”两个维度分析了商业收购等级质量和工业认可度之间的差异,探讨了影响烟农高可用性烟叶比例的原因。  结果  （1）从工业企业角度看,在7个商业收购等级中,B1F和C2F的收购比例偏高,等级合格率相对较低,是等级质量监控的重点对象。相邻商业收购等级之间相互混级较严重。（2）超过一半烟农的商业收购上等烟比例排名与工业认可的上等烟比例排名存在明显差异;（3）不同烟农高可用性烟叶比例变幅16.13%~56.72%,高可用性烟叶比例较高的烟农的共同特征是能够及时落实各项生产技术措施。户均种植规模对高可用性烟叶比例无显著影响。  结论  目前烟叶商业收购等级质量与工业认可度之间存在较明显的差距;提高烟叶生产技术落实到位率,加强收购过程中对重点等级的质量监控,是提高工业认可度的重要措施。      

烤烟叶片成熟过程中膜脂过氧化及脂肪酸含量变化的研究

烤烟叶片在不同发育阶段，其内源ＳＯＤ及ＣＡＴ，活性和膜脂过氧化作用和细胞膜透性表现出不同的变化速度，从未熟经欠熟到适熟阶段，ＳＯＤ和ＣＡＴ活性下降缓慢，膜脂过氧化作用及细胞膜透性提高幅度较小；在适熟期之后，ＳＯＤ和ＣＡＴ活性急剧下降，膜脂过氧化水平和细胞膜透性急剧提高。表明烟叶的成熟衰老与体内活性氧代谢密切相关，适熟期是叶片由功能期转向衰老的关键时期。在烟叶成熟过程中，脂肪酸含量发生明显变化。随着成熟度的提高，月桂酸含量增加，棕榈油酸、油酸和二十碳烯酸含量下降，而十三烷酸、十四烷酸、棕榈酸、硬脂酸和亚油酸的含量在适熟期最高。     

香料烟叶片成熟过程中生理变化初步研究

对不同衰老程度叶片的研究结果表明，香料烟叶片的叶绿素、类胡萝卜素含量、光合速率及过氧化氢酶（ＣＡＴ）活性随衰老程度加深而降低，过氧化物酶（ＰＯＤ）活性及丙二醛（ＭＤＡ）含量随叶片衰老而提高。对不同部位（上部、中部和下部）和不同成熟度（欠熟、适熟和过熟）叶片的研究结果表明，同一部位的叶片随着成熟度的提高，其ＣＡＴ活性、叶绿素含量及光合速率明显降低，ＰＯＤ活性明显提高。同一成熟度的叶片，其ＣＡＴ和ＰＯＤ活性在下、中、上三个部位间呈“Ｖ”型变化。同一成熟度叶片的还原糖含量随叶片着生部位升高而增加，而蛋白质含量在下、中、上三个部位间表现为“Ｖ”型变化。同一部位不同成熟度叶片的还原糖含量变化趋势是适熟叶＞过熟叶＞欠熟叶；蛋白质含量变化则为过熟叶＞适熟叶＞欠熟叶。适熟期及时采收有利于获得高质量的香料烟叶。     

生物炭类型对植烟土壤碳库及烤后烟叶质量的影响

  目的  为研究不同材料来源生物炭对植烟土壤碳库及烤后烟叶品质的影响。  方法  以云烟97为研究对象,于2013年在陕西汉中进行大田试验,试验设置四个处理:T1常规施肥;T2（T1+花生壳生物炭600 kg/hm2）;T3（T1+稻壳生物炭600 kg/hm2）;T4（T1+麦秸生物炭600 kg/hm2）。  结果  （1）施加生物炭后,土壤有机碳矿化速率、土壤水溶性碳、土壤易氧化有机碳、土壤碳库指数显著增加,但土壤微生物生物量碳含量下降。（2）施加生物炭能降低烟叶总糖、还原糖含量,降低烟叶钾氯比、糖碱比,但可以增加烟碱含量,提升烟叶两糖比。（3）花生壳生物炭对土壤易氧化活性有机碳含量和土壤碳库管理指数的提升效果最好,对土壤改良效果明显。同时,也提高了烟叶钾含量。（4）麦秸生物炭显著地增加了土壤全碳含量,但也增加了烟叶烟碱含量,对烟叶品质造成了一定的负面影响。  结论  施用生物炭有利于活化土壤碳库,但不同材料来源的生物炭对烟叶品质影响不同。      

基于烟茄嫁接的超低烟碱烟叶的感官质量和烟气特性

  背景和目的  本研究在烟茄嫁接（烤烟品种云烟87为接穗,茄子为砧木）的基础上,检测分析了所获得的超低烟碱含量烟叶TSNAs含量、中性香气物质含量,并对卷制的试验卷烟烟气参数和感官质量进行对比分析。  方法  试验共设烟/烟、烟/茄不培土、烟/茄培土等3个处理。  结果  （1）烟茄嫁接的超低烟碱含量烟叶,中性香气物质含量变化较小,但NNN、NNK、NAT和TSNAs含量显著降低,上部叶烟/茄不培土处理的NNN、NNK及TSNAs含量比烟/烟低82.71%、79.46%和68.78%,中部叶烟/茄不培土处理的NNN、NNK及TSNAs含量比烟/烟低79.68%、79.80%和68.63%。（2）卷烟烟气中烟碱含量大幅度降低,其中烟/茄不培土烟叶比常规烟叶低94.12%,焦油、CO、总粒相物、水分和抽吸口数无显著差异。（3）超低烟碱含量烟叶的香气质、浓度、刺激性和燃烧性无显著差异,香气量、杂气和余味与常规烟叶相比有不同程度的降低,劲头下降明显,消费者满足感、愉悦感、接受度显著降低。  结论  通过嫁接技术选择性降低烟碱含量对烟叶化学组成和感官质量产生不同程度的影响。      

基于非靶向代谢组学的红花大金不同生育期烟叶代谢图谱差异分析

  目的  为分析不同生育期烟草烟叶代谢图谱差异。  方法  以烟草品种红花大金元为研究对象,采集团棵期、现蕾期和成熟期烟叶样品,利用LC-QTOF/MS进行代谢指纹图谱检测,利用统计分析方法对差异代谢物进行筛选,基于Spearman相关分析计算代谢物之间的相关性系数,利用MetaboAnalyst软件进行代谢通路富集分析。  结果  （1）不同生育期烟草样品代谢图谱存在明显差异,共鉴定出245个差异代谢物,其中类黄酮、有机酸、氨基酸、核苷、生物碱、脂类等物质种类最多。（2）烟碱及其衍生物,如烟碱-1-氧代、麦斯明、假木贼碱、马钱子碱、新烟碱、2, 3'-二联吡啶,均随烟草生育期而逐渐累积,而与烟碱合成相关的前体物质,如精氨酸、亚精胺、腐胺、羟基丁酸等,均随着生育进程逐渐减少,且与烟碱含量显著负相关。（3）与次级代谢物合成相关氨基酸和有机酸等物质在团棵期或现蕾期含量较多,而在成熟期含量较低,与成熟期次级代谢物合成有关。（4）大部分类黄酮和酚酸组分在成熟期时含量较高,可以提高烟草抗病和抗逆能力。（5）相关性分析发现,烟碱含量与谷氨酸、泛酸、吡哆醛、蜜二糖、3-羟基邻氨基苯甲酸和顺式玉米素-o-葡萄糖苷等物质显著正相关,可能是调控烟叶中烟碱含量的重要标志物。  结论  基于代谢组学揭示了不同生育期烟草代谢物变化规律,为优质烟草育种及品质分析提供技术支撑。      

玫瑰香韵烟草突变体代谢轮廓分析

  背景和目的  利用甲基磺酸乙酯（EMS）对中烟100（ZY100）进行化学诱变,获得一个具有特征香韵的香气突变体（玫瑰香）,为明确玫瑰香烟草突变体与ZY100在代谢产物和代谢途径方面的差异。  方法  采用GC-MS对玫瑰香突变体和ZY100烟芽的挥发性次生代谢产物和内在代谢产物进行分析。结合主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判别分析法（PLS-DA）筛选差异代谢物,并对差异代谢通路进行富集。  结果  （1）共检出挥发性代谢产物27种,包括醇类、醛类、酮类和烯烃类,突变体中挥发性物质种类多于对照,主要成分为反式-β-罗勒烯。（2）共鉴定内在代谢产物60种,包括氨基酸类、糖和醇类、有机酸类和其他次生代谢产物,筛选到差异代谢物27种。（3）玫瑰香突变体中与氨基酸合成、糖酵解、三羧酸循环、有机酸代谢、生物碱和萜类合成等相关的19条代谢通路发生极显著变化。  结论  差异代谢物和代谢通路的改变赋予了玫瑰香突变体特殊的花香香韵。      

烟草硝酸盐转运蛋白NtNRT1.5基因的克隆及功能分析

【背景和目的】低亲和硝酸盐转运蛋白NRT1家族基因在植物吸收和转运硝态氮过程中发挥重要作用,为研究烟草NRT1家族基因在烟草氮素利用中的作用。【方法】从栽培烟草品种K326中克隆获得NtNRT1.5的全长cDNA序列,利用生物信息分析、qRT-PCR技术和转基因技术系统分析NtNRT1.5基因的序列特征、表达模式及在提高烟草氮素利用效率方面的功能。【结果】NtNRT1.5全长序列包含1800bp开放阅读框、编码599个氨基酸,编码的蛋白质具有NRT基因家族的共有结构特征,与拟南芥AtNRT1.5相似性达到59.28%。亚细胞定位结果表明NtNRT1.5蛋白定位在细胞膜上,其启动子中包含多个与硝酸盐（A(C/G)TCA）、胁迫（MYB）、根系特异表达（ROOT MOTIF BOX）相关的响应元件。表达模式分析结果表明NtNRT1.5主要在根部表达,其次是衰老叶片和茎,新叶基本不表达;低氮抑制其在根系中的表达,说明NtNRT1.5主要负责正常条件下的硝酸盐的吸收;低氮条件下,NtNRT1.5过表达显著提高了转基因烟株的氮素利用率。【结论】NtNRT1.5基因在烟草氮素的吸收和转运上行使重要...     

基于代谢组学分析青枯病烟田土壤代谢标志物

【目的】分析青枯病烟田和健康烟田土壤代谢物组成的差异,筛选青枯病烟田土壤代谢标志物。【方法】以青枯病烟田和健康烟田的烟株根围土壤为研究对象,采用非靶向代谢组学LC-MS/MS分析技术,对3个时期（未发病、发病中期、发病后期）土壤代谢物组成进行研究。【结果】（1）在未发病时、发病中期和发病后期,青枯病烟田和健康烟田土壤代谢物有显著差异的代谢物分别为115种、159种和105种。（2）3个时期共同差异代谢物有63种,其中正离子模式代谢物有49种,负离子模式代谢物有14种。49种正离子模式代谢物可以聚为2个大类和7个小类。（3）筛选出8种代谢标志物,分别为环巴胺（Cyclopamine）、麦芽四糖（Maltotetraose）、麦黄酮（Tricine）、凯林（Khellin）、6-(alpha-D-glucosaminyl)-1D-myo-inositol、茄啶（Solanidine）、贝磷地尔（belfosdil）、硅雄酮（Silandrone）。【结论】青枯病烟田和健康烟田土壤代谢物组成上存在较大差异,筛选出8种代谢标志物可为判别土壤感烟草青枯病状况提供一定参考。     

不同品种烤烟衰老期碳氮代谢及相关基因表达的差异分析

  目的  研究不同品种烤烟叶片衰老期碳氮代谢及相关基因表达的差异及关系。  方法  以田间成熟落黄表现不同的4个烤烟品种中部叶为材料,分析叶片成熟衰老过程中质体色素、碳氮代谢中间产物含量的变化,检测了相关基因的表达量。  结果  ① 豫烟10号叶片叶绿素和类胡萝卜素的含量较低,并随着叶龄的增加降低的幅度最大,CCD表达量较高,NC89的降低的幅度较小,含量较高,CCD表达量较低。②叶片淀粉含量在叶龄50~60 d时达到峰值后开始下降,从峰值到叶龄70 d,降幅较大的豫烟10号（38.65%）,淀粉合成相关基因GBSS1和SBE的表达量相应较低,总糖和还原糖含量从峰值至叶龄70 d也表现较大的降幅。③ NC89的淀粉、总糖、还原糖和总碳含量均相对较高,云烟87和K326的碳代谢指标则居豫烟10号和NC89之间。④豫烟10号叶片成熟衰老过程中总氮、碳氮比、烟碱含量显著低于NC89,这与豫烟10号氮素转移相关的GS1-3基因表达量在叶龄40 d之后显著高于NC89,参与氮同化相关的GS2、GDH1和NR基因表达量相对较低的特征一致。  结论  叶片衰老速度快的品种具有淀粉合成代谢弱,淀粉含量较低,氮素同化代谢较弱而再利用和再转移代谢能力较强,总氮、碳氮比较低的碳氮代谢特征。      

大豆与海藻有机肥对烤烟生长和土壤细菌群落的影响

  目的  探究不同有机肥施用对烤烟生长和土壤细菌群落的影响。  方法  用烤烟品种中烟100进行田间试验, 比较分析了大豆和海藻有机肥不同施用量对烤烟生长发育以及烟叶中氮、磷、钾含量的影响, 并且从土壤理化性质以及土壤微生物群落结构的角度, 分析了施用两种有机肥对烟叶生长、土壤理化性质和土壤微生物群落结构的影响。  结果  (1) 与对照相比, 大豆和海藻有机肥的施用, 促进了团棵期和旺长期烟株的生长发育(450 kg/hm2处理最佳), 提高了土壤有机质和氮磷钾含量。(2)由16 S V3-V4区域扩增子测序可知, 有机肥的施入改变了土壤细菌群落的丰富度和多样性, Sphingomonas、Actinospica、Pseudonocardia等有益细菌丰度增加。(3)土壤细菌群落与土壤理化性质存在一定相关性, 其中土壤pH值、速效钾(AK)、硝态氮(NO₃--N)和铵态氮(NH₄+-N)是主要环境影响因子。  结论  大豆和海藻有机肥的施用改善了土壤理化性质, 并影响了土壤细菌群落丰富度和多样性, 促进了烟株生长发育。      

上部叶脂质代谢与烟叶褐变的关系研究

  目的  为明确烤烟上部叶脂质代谢对烟叶褐变的影响。  方法  以云烟87和中川208两个品种的上部叶为试验材料,利用转录组学、透射电镜、扫描电镜和荧光实时定量PCR（qRT-PCR）技术从细胞生物学和分子层面对脂质氧化与上部烟叶的褐变关系进行系统的研究。  结果  （1）相比云烟87,易褐变的中川208上部叶褐变速度更快,且叶片达五成的褐变时间更短,褐变反应更剧烈;进一步的转录组GO分析和KEGG富集分析结果显示中川208上部叶差异基因在脂类代谢（亚麻酸和亚油酸代谢）富集较多,表明脂质代谢与上部叶烟叶褐变密切相关。（2）对比云烟87,中川208上部叶成熟期角质层厚度明显增加,蜡质层破碎薄片明显增多,总脂肪酸含量、亚麻酸含量及脂氧合酶（LOX）酶活显著高于云烟87,表明中川208上部叶脂类代谢较旺盛,易发生脂质氧化。（3）qRT-PCR结果表明中川208上部叶中脂类代谢途径关键基因CYP76A2、LOX5、LTP4、MYB108、ALDH2B7等的表达量显著高于云烟87,其中脂质氧化关键基因LOX5表达量上调2.27倍。  结论  相比云烟87上部烟叶,中川208上部叶褐变反应更剧烈,烟叶中的脂肪酸代谢更旺盛,脂类物质更易发生氧化反应,表明脂肪酸代谢引起的脂质氧化是中川208上部烟叶易褐变的一个重要因素。      

陈化烤烟叶片不同发酵时间微生物多样性及代谢组分析

【目的】了解不同陈化发酵时间烟叶中微生物菌群与代谢产物的关系,探究多年陈化发酵过程中微生物对烟叶发酵品质的影响。【方法】选取4个陈化发酵时间（陈化0年,1年,4年,7年）的上部烟叶（B2F）,采用Illumina高通量测序技术和UPLC-ATOF MS液质联用技术,对不同发酵时间的烟叶表面微生物多样性以及差异代谢物进行分析。【结果】相比其他陈化发酵时间,发酵4年的烟叶中微生物种类最多、多样性最高。在细菌属分类水平上,泛菌属（Pantoea）和假单胞菌属（Pseudomonas）为发酵4年烟叶的优势细菌。结合OPLS-DA模型以及数据库检索,4个发酵时期两两比较共筛选到173个显著差异代谢物,KEGG富集分析发现差异代谢物参与氨基酸代谢、脂肪酸代谢、类固醇生物合成等多条代谢途径。其中,发酵4年样本中高丰度的差异代谢物主要富集在脂肪酸降解途径。【结论】复烤烟叶在陈化发酵不同时间微生物多样性及代谢物质具有显著差异,上部叶片陈化发酵4年烟叶的内在品质最佳。