多重PCR检测4种常见食源性致病菌

目的 建立一种多重聚合酶链式反应法(multiplex polymerase chain reaction, MPCR)快速检测肉制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特氏菌的分析方法。方法 选取金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门氏菌SipB基因、志贺氏菌ipaH基因、单增李斯特菌inlA基因作为目标基因, 设计4对PCR引物, 建立并优化多重PCR反应体系, 评价该体系的特异性和灵敏度, 并对人工污染的熟肉样品进行检测。结果 构建的多重PCR方法特异性强、灵敏度高, 人工污染熟肉匀浆中4种致病菌的检出限为103 CFU/mL。结论 构建的多重PCR检测方法能够快速、准确、高效地检测肉制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特氏菌, 为食源性疾病菌的快速检测提供参考依据。     

肉中4种致病菌的PCR快速检测方法的建立

目的:建立一种能同时检测肉中金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌和单核增生李斯特菌的多重PCR检测方法。方法:根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)、沙门氏菌的侵袭蛋白基因(invA)、志贺氏菌的侵袭性质粒抗原基因(ipaH)和单核细胞增生性李斯特菌的内化素基因(inlA)设计引物,通过优化好的反应体系进行多重聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因。结果:特异性实验结果表明4种菌均能在相应位置扩增出特异性条带。对污染4种菌的猪肉进行检测,确定出金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的检出限是102CFU/mL,志贺氏菌和单核增生李斯特菌的检出限是101CFU/mL。结论:本实验建立的多重PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏,适用于肉中金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门菌和单核增生李斯特菌的快速检测。     

1种选择性富集沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌共增菌培养基SSSV研究

设计并制备1种同时富集沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌的复合共增菌培养基SSSV,用于水产品中上述常见4种食源性致病菌的快速增菌。以缓冲蛋白胨水为基础培养基,挑选适合的促进剂、抑制剂及营养物质等做单因素试验和正交试验,确定其最佳成分及配比;分析SSSV培养基对目标菌的生长选择性以及混合菌的生长特性;通过人工污染试验,评价SSSV对不同贮藏条件下的水产品中目标致病菌的增菌复原能力。结果表明,共增菌培养基SSSV对非目标菌表现一定的抑制作用,对4种致病菌的增菌效果优于营养肉汤,但略差于国家标准中目标菌各自的选择培养基。SSSV能同时富集不同接种比例组成的混合菌,37℃培养8h后,菌体浓度均在104～104CFU/mL范围。SSSV能有效修复冷藏和冻藏水产品中冷受伤的目标致病菌。人工污染102CFU/mL目标菌的冷藏和冷冻虾仁、目鱼卷及鱼丸样品,经SSSV培养基在37℃分别培养8h和12h,可使菌体浓度在105～106CFU/mL。可见,SSSV培养基可应用于水产品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌检验的前增菌,可望与多重PCR检测方法联用,以加快检测时间,提高检测率和准确性。     

重组酶聚合酶恒温扩增结合乳胶微球试纸条快速检测金黄色葡萄球菌

通过建立一种将重组酶聚合酶恒温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与乳胶微球试纸条(latex microsphere test strips,LMTS)相结合的方法,快速检测金黄色葡萄球菌。根据金黄色葡萄球菌保守区序列(nuc)设计特异性引物,经RPA扩增后用LMTS检测,确定RPA-LMTS检测金黄色葡萄球菌的灵敏度和特异性。灵敏度结果显示RPA-LMTS检测限为500 fg DNA和1.2×101 CFU/mL纯菌液;特异性结果表明与沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7、志贺氏菌、产气肠杆菌和单增李斯特菌无交叉反应,特异性良好;用食物样品评估RPA-LMTS检测效果,结果显示经过增菌3小时后,RPA-LMTS可检测1.2×100 CFU/mL(g)的金黄色葡萄球菌。     

环介导等温扩增法快速检测食源性致病菌

目的考察环介导等温扩增技术在食源性致病菌快速检测中的应用效果。方法待检样品按照GB4789系列标准进行前增菌后,提取核酸进行致病菌检测。结果食品中6种常见的致病菌:金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌和大肠杆菌O157检测阳性符合率100%,阴性符合率100%,检出限介于3.0×10~3～1.1×10~4 CFU/25 g,前增菌时间最快5h,检测时间为2d。结论环介导等温扩增技术具有检出限低、特异性好、检测速度快等优点,能较好地满足进出口食品中致病菌快速检测的要求。     

不同增菌液对单增李斯特菌的增菌效果比较

目的比较不同选择性增菌液对单增李斯特菌增菌效果及对干扰菌的抗干扰性。方法参考国标GB/T 4789.30-2016和国际ISO 11290-1-2017,将2种来源的单增李斯特菌(标准菌株、分离菌株)和2种干扰菌(大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌)分别接种到4种不同增菌液中,观察增菌后菌液的生长情况。结果研究发现低浓度菌液(102数量级), Fraser肉汤对单增李斯特菌的增菌效果及抗干扰性优于LB肉汤。选择性添加剂浓度过高会抑制李斯特菌的生长,通过选择合适的选择性添加剂及改变添加剂的浓度可以提高检出率。结论在实验室日常检验过程中,需考虑样品类别,选择合适的培养基。提高检测的准确率。     

重组酶介导扩增技术快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌

目的建立重组酶介导扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)快速检测单核细胞增生李斯特菌的方法。方法以单核细胞增生李斯特菌的hlyA基因作为靶序列,设计引物和探针,通过构建含目的基因片段的重组质粒,评价RAA方法的灵敏度,通过检测沙门氏菌核酸、金黄色葡萄球菌核酸、副溶血性弧菌核酸、溶血性链球菌核酸、志贺氏菌核酸基因组DNA,评价其特异性。结果建立的RAA方法可在39℃、20 min内,检测重组质粒中hlyA基因片段,最低可检出的质粒拷贝数为10拷贝/反应,且与沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、溶血性链球菌、志贺氏菌基因组DNA无交叉反应。结论建立的RAA方法具有灵敏度高和特异性强的特点,可用于单核细胞增生李斯特菌的快速检测。     

辽宁省生食水产品致病菌污染及安全性评价

目的了解辽宁省生食水产品的安全状况,及早发现食品安全隐患,为食品安全监管提供信息。方法在2013年12月~2014年1月于辽宁省的盘锦市、营口市和大连市三个港口城市,从不同规模的大中小型餐饮企业中共收集到生食水产品样品150批,采用国标方法,对生食水产品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、菌落总数、大肠菌群和寄生虫囊蚴进行检查。结果 150批样品中共检出副溶血性弧菌9批,单增李斯特氏菌1批,金黄色葡萄球菌(定量)10批,菌落总数(限定性包装)1批,总合格率为93.3%,结论辽宁省生食水产品中存在致病菌的污染,相应部门应加强进行食品卫生监管。     

3种食源性致病菌的实时荧光PCR快速检测

DNA提取方法采用先钢珠机械破坏细菌细胞壁,再添加丙酮、蛋白酶K溶解去除杂质,大大提高了食源性致病菌基因组DNA的得率和纯度。继而针对金黄色葡萄球菌egc基因、沙门氏菌NA(not availabale)基因、志贺氏菌ipaH基因为靶基因设计特异性引物对样品建立实时荧光定量PCR检测方法。结果试验设计的引物对3种细菌具有很强特异性,除目标细菌外,对单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌3种对照菌均未检测到荧光信号。对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的检测灵敏度分别达到10~(-6)、10~(-6)、10~(-7) ng/μL。     

MPCR方法检测食品中的伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特氏菌

为建立一种同时检测食品中的伤寒沙门氏菌(ST)、金黄色葡萄球菌(SA)和单增李斯特氏菌(LM)的快速检测方法,分别针对伤寒沙门氏菌的鞭毛抗原基因H1-d、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、单增李斯特氏菌溶血素O上的hlyA基因设计引物,进行特异性和灵敏性实验,结果表明3条特异性扩增片段分别为458bp、279bp和243bp,经DNA测序证明其序列与模板被扩增片段一致。该方法操作简便、快速,具有良好的灵敏性和特异性。     

电子加速器辐照对弱酸性防腐剂抑菌性的影响

研究电子加速器对弱酸性防腐剂抑菌性的影响。选取固态粉末和溶液状态的常用弱酸性防腐剂——丙酸钠、丙酸钙、山梨酸钾和双乙酸钠为研究对象,用剂量为0,5,10,15,30 k Gy的电子加速器辐照处理,酶标比浊法观察辐照前、后防腐剂对试验目标菌株革兰氏阴性(G-)菌肠炎沙门氏菌、福氏志贺氏菌、大肠杆菌、中耶氏菌和革兰氏阳性(G+)菌单增李斯特菌、金黄色葡萄球抑菌性的变化。试验结果表明:电子加速器对固态弱酸性防腐剂抑菌性影响虽较小,但可引起丙酸钙对沙门氏菌、志贺氏菌的抑菌性增强,丙酸钠对金黄色葡萄球菌的抑菌性增强,山梨酸钾对金黄色葡萄球菌、中耶氏菌和志贺氏菌的抑菌性增强;溶液状态的弱酸性防腐剂可引起丙酸钠对金黄色葡萄球菌、李斯特菌和大肠杆菌的抑菌性增强,丙酸钙对沙门氏菌、中耶氏菌、李斯特菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性增强,双乙酸钠对大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用增强,山梨酸钾对试验全部细菌的抑菌性增加,辐照对溶液状态防腐剂抑菌性的影响比对固态防腐剂粉末大。G+菌比G-菌对辐照防腐剂抑菌性的变化更为敏感。与前期报道γ射线辐照防腐剂效应比较,电子加速器辐照对防腐剂抑菌性的影响更大。经剂量5~30 k Gy的电子加速器辐照,对防腐剂的抑菌性没有负面影响。在该辐照剂量范围,可提高防腐剂的抑菌性。本研究结果为添加防腐剂的食品辐照处理提供参考。     

单增李斯特菌国标检验培养基质量的比较

通过考察市售单增李斯特菌国标检验培养基对单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM,以下简称单增李斯特菌)和非单增李斯特菌的增菌检测效果,比较不同品牌培养基的质量。该研究采用螺旋涂布计数法,定量测定30株单增李斯特菌和9株非单增李斯特菌在4个品牌的李氏增菌肉汤(LB₁、LB₂)和6个品牌的PALCAM琼脂培养基、李斯特氏菌显色培养基中的生长情况。实验结果表明:30株单增李斯特菌在4个品牌的LB;增菌肉汤中的浓度均值为2.04×10⁷CFU/m L~4.59×10⁷CFU/m L;在LB;增菌肉汤中的浓度为2.36×10⁷CFU/m L~2.69×10⁷CFU/m L;在D品牌的PALCAM琼脂培养基中的生长率均值为0.55,在其余5个品牌的PALCAM琼脂培养基和6个品牌的李斯特氏菌显色培养基中的生长率均值均超过0.85。30株单增李斯特菌在李氏增菌肉汤(LB₁、LB₂)、PALCAM琼脂培养基、李斯特氏菌显色培养基中的增菌检测效果存在显著性差异(p<0.05)。4个品牌的李氏增菌肉汤的增菌效果和6个品牌PALCAM琼脂培养基、李斯特氏显色培养基的检测效果存在显著性差异(p<0.01)。该研究结果表明市售单增李斯特菌国标检验培养基质量差异大。     

低温肉制品中3种食源性致病菌多重聚合酶链式反应快速检测方法的建立

针对低温肉制品中较易污染的沙门氏菌(Salmonella spp.)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等有害微生物,利用多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,m-PCR)的方法,对3种菌同时快速检测,从而达到节省时间,提高效率的目的。使用沙门氏菌的inv A基因、金黄色葡萄球菌的Prf A基因和单增李斯特菌nuc基因设计3对特异性引物,在确定特异性引物的基础上,将3种菌进行培养增菌后接种于低温肉制品中,过夜富集后收集并进行灵敏度检测,优化多重PCR反应体系并应用于实际样品的检测。结果表明:多重PCR方法在同时检测这3种有害微生物时,m-PCR最佳反应条件如下:25 μL反应体系、10×PCR缓冲液2.5 μL、2.5 mmol/L d NTPs 2.0 μL、2.5 U/μL的DNA聚合酶0.5 μL及上、下游引物各0.5 μL、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的模板1.0 μL、沙门氏菌的模板2.0 μL,加dd H_2O补足至25 μL,最佳退火温度为64℃。多重PCR快速检测方法适用于低温肉制品中沙门氏菌等3种食源性致病菌的检测,具有快速、灵敏、特异、简便等特点。     

Mini-VIDAS法和国标法检测单增李斯特菌的效果比较

目的比较两类方法检测单增李斯特菌的特异性、灵敏度和抗干扰性,并研究添加成分和样品基质对检测效果的影响。方法选取单增李斯特菌(CICC 21633/ATCC 19111)、斯氏李斯特菌(CICC 21671)、伊氏李斯特菌(CICC 21663/ATCC19119)和英诺克李斯特菌(CICC 10417/ATCC 33090)为试验对象,采用国标法和mini-VIDAS法为试验方法。结果两种检测方法的特异性较好,均能区分李斯特菌属和非李斯特菌属。国标法和mini-VIDAS法的灵敏度分别为104~105 cfu/m L和105 cfu/m L;同时,国标法的抗干扰性稍强,1/104混合干扰菌液可检出目标菌。添加次氯酸钠后两种方法对目标菌的检出都受到影响。添加成分对单增李斯特菌生长的抑制作用符合乙醇苯甲酸钠十三香料凉拌菜料次氯酸钠。当基质中单增李斯特菌污染水平较低并且背景微生物数量高时,目标菌的检测结果受基质严重干扰。不同增菌液对单增李斯特菌的增菌效果为Fraser肉汤LB2FB2。结论 mini-VIDAS法和国标法对单增李斯特菌的检测性能基本相当。采用国标法时需考虑微生物污染背景、添加成分等样品基质特性,以提高目标菌的检出率。mini-VIDAS法可作为初筛的良好工具。     

单增李斯特菌单克隆抗体的研制及特性分析

运用辐照法和热灭菌法自制单增李斯特菌的免疫原、检测原,运用尾静脉免疫方法免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术进行细胞融合,制备得到抗单增李斯特菌的单克隆抗体,并对其进行免疫学特性分析。结果表明,成功筛选4株能稳定分泌抗单增李斯特菌的单克隆杂交瘤细胞株,腹水抗体效价为1∶102 400~1∶409 600,免疫球蛋白亚型为Ig G1、Ig2a、Ig2b,亲和力常数在1×107~1×1010L/mol;经测定分析出最佳配对抗体;并与绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌及大肠杆菌、沙门氏菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌等菌属无明显交叉反应;进行双抗体夹心ELISA方法对模拟单增李斯特菌污染肉样检测其灵敏度达1×103 CFU/m L。获得高效价、特异性强、灵敏度高的单克隆抗体,为食品中致病菌单增李斯特菌残留的免疫学检测方法奠定了基础。     

乳制品常见致病菌选择性共增菌技术研究

以乳制品常见致病菌大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌为目标菌,研究6种基础培养基、2种培养模式、20种培养基添加剂对增菌的影响,并以无显著抑制效应的添加剂对背景微生物进行了抑菌效应研究,建立了一种选择性富集目标菌的ESS培养基。使用该培养基37℃静止培养16 h,可实现目标菌的共增菌,对可能影响目标菌检测的乳制品中其他致病菌有一定抑制效果。     

兰州市餐饮食品、餐具食源性致病菌监测结果分析

目的:掌握兰州市主城区餐饮食品卫生状况,为卫生行政部门制定相应监督、监测方案提供科学依据。方法:采集57家餐饮单位餐饮凉拌菜、炝拌菜、熟肉制品、冷加工糕点、鲜榨果汁、沙拉果盘、动物性水产品、餐饮器具、器皿等共计418个样品,进行大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特氏菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌检测,并利用生物梅里埃全自动鉴定系统对菌种进行分析。结果:312份食品样品合格率为90.06%,大肠菌群检出率6.41%、金黄色葡萄球菌检出率0.96%、李斯特氏菌检出率1.60%、沙门氏菌检出率0.64%、副溶血性弧菌检出率0.32%,未检出志贺氏菌。106份餐饮器具总检出率为5.66%,其中,李斯特氏菌、大肠菌群分别占0.94%、4.72%。结论:本检测结果可指导食品监管部门提高应急处置突发事件的能力,切实保障广大人民群众的利益。     

单增李斯特菌与志贺氏菌多重PCR检测技术的建立

目的:为食品、卫生行业提供一种简便、灵敏、快速,并且特异性强的单增李斯特菌(Listeria Monocyto-genes)与志贺氏菌(Shigella)多重PCR检测方法.方法:根据单增李斯特茵转录调节子基因prfA、志贺氏茵侵袭性质粒抗原H基因ipaH筛选出引物;优化多重PCR的引物浓度、退火温度及Mg2+等条件,分析单-PCR及多重PCR的特异性、灵敏度;结合24 h增茵培养.确定多重PCR检测人工污染脱脂灭茵乳的检出限.结果:多重PCR扩增出了预计的PCR产物,即单增李斯特茵(274bp)和志贺氏茵(421bp).该方法的灵敏度:78 pg单增李斯特茵基因组DNA、7.5pg志贺氏茼基因组DNA.多重PCR检测人工污染脱脂灭菌乳,单增李斯特茵与志贺氏茵的灵敏度分别为2cfu/25mL和1.6cfu/25mL.结论:该方法在食品、卫生行业具有很好的应用和开发前景.     

应用基因芯片技术检测肉及肉制品中5种致病菌

建立一种运用多重聚合酶链式反应(PCR)结合基因芯片技术检测大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌5种食源性致病菌的快速、准确、灵敏的方法。分别选取编码大肠埃希氏菌的slt基因、沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、志贺氏菌ipaH基因和单核细胞增生李斯特菌inlA基因,并以细菌16S rDNA基因作为阳性对照,设计引物和探针,进行多重PCR扩增,产物与含特异性探针的芯片杂交。结果表明：该基因芯片可同时特异性地检测5种致病菌,多重PCR检测灵敏度为20pg,而DNA芯片检测灵敏度可达2pg;用所制备的基因芯片检测实际肉及肉制品样品,准确率高于传统培养法。所建立的基因芯片检测方法特异性好、灵敏度高,可为食源性致病菌的检测提供理想手段。     

单增李斯特菌RT-LAMP快速检测方法的建立

建立一种可快速检测单增李斯特菌的反转录-环介导等温扩增方法。针对单增李斯特菌的李氏溶血素基因(hly)设计多组引物,经引物筛选和配比优化,建立检测单增李斯特菌的实时荧光RT-LAMP方法,并通过菌株特异性、灵敏度和人工污染脱脂乳样品中的检出限对该方法进行评价。该方法特异性良好, 26株菌株中仅三株单增李斯特菌检出阳性;检测灵敏度高,对单增李斯特菌的菌悬液灵敏度为10~1 CFU/mL,是RT-qPCR方法检测灵敏度的10倍。人工污染样品直接检测的检出限为10~3 CFU/mL,而对样品增菌16 h后,单增李斯特菌的检出限提高到10~0 CFU/25 mL。所建立的RT-LAMP方法可以快速、准确地检测单增李斯特菌,操作简便,适合应急和现场监测使用。