环介导等温扩增技术快速检测植物蛋白饮料中大豆成分

目的 建立植物蛋白饮料中大豆成分环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplificantion,LAMP）快速检测技术方法。方法 根据大豆Lectin基因保守序列,设计大豆成分环介导等温扩增检测特异性引物和反应体系,对方法特异性、灵敏度和稳定性进行测试,并以实时荧光PCR方法为参比方法,对32种植物蛋白饮料进行检测应用验证。结果 本研究建立的LAMP方法特异性强,稳定性好,最低检出限为0.1%（以质量分数计）;通过参比方法验证,方法特异性和灵敏度为100%,不存在假阳性和假阴性。结论 本研究建立的LAMP技术快速检测植物蛋白饮料大豆成分的方法具有操作简单、快速准确、检测成本低等优点,可为植物蛋白饮料大豆成分掺杂掺假提供一种快速检测方法。     

植物蛋白饮料中榛子成分环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法的建立

该研究基于植物蛋白饮料掺杂使假现象普遍,建立一种针对榛子成分为检测目标的环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）快速检测技术方法。根据欧洲榛子染色体Ca8（登录号：LR899430.1）基因保守序列（第19517533 ~19519500 bp）,设计榛子成分环介导等温扩增检测特异性引物,构建反应体系,并验证方法的特异性、灵敏度和稳定性;以Real-Time PCR（Polymerase Chain Reaction）为对照方法,采用显著性差异检验（McNemar’s检验）方法,通过32种植物蛋白饮料检测结果验证LAMP方法的性能指标和准确性。该研究建立的LAMP方法特异性强,33种植物成分中除了榛子DNA外,其它植物成分DNA均未获得阳性扩增结果;重复性实验稳定性好（扩增Ct值,RSD=5.41%）,最低检出限为0.1%（以质量分数计）;通过植物蛋白饮料产品应用性验证,得出方法特异性和灵敏度均为100%,不存在假阳性和假阴性。综上,该研究建立的植物蛋白饮料榛子成分LAMP检测技术,具有操作简单、快速高效（从样品处理到最终结果可在2 h内完成）、准确度高等优点,可应用于植物蛋白饮料榛子成分快速检测。     

基于烟草属特异性基因Ntsp151的环介导等温扩增检测

针对烟草属特异性基因Ntsp151序列保守区设计环介导等温扩增(LAMP)引物,基于SYBR Green I荧光染料对烟草材料进行可视化LAMP检测,对检测过程中的DNA提取方法和反应条件进行优化,并对LAMP反应体系的特异性和灵敏度进行评价。结果表明：使用Chelex-100提取的DNA可以直接进行LAMP扩增反应,显色效果较好;LAMP最适反应条件为扩增温度63℃、反应时间60 min、Mg²⁺浓度6 mmol/L;LAMP对17份非烟草材料和1份烟草材料基因组DNA的扩增显色结果与荧光值的检测结果一致,具有较好的特异性,其最低检测限为10² copies/μL。基于烟草属特异性基因Ntsp151的LAMP检测结果可视化强,且灵敏度高、特异性强,适用于现场抽检。     

烟草拟茎点霉快速检测方法的建立

为实现烟草拟茎点霉的快速准确检测,利用真菌rDNA-ITS通用引物对拟茎点霉和其他10种烟草病原菌基因组DNA进行了PCR扩增、片段回收及DNA测序,在序列比对基础上设计了两对特异性检测引物,并鉴定了引物的检测灵敏度和特异性,同时优化建立了PCR反应体系。结果表明,在退火温度为60 ℃时,两对特异性引物P2F/P3R和P3F/P3R从烟草拟茎点霉DNA样本中分别扩增出来420 bp和381 bp的特异性条带,而在其他10种烟草病原菌DNA以及阴性对照中均不能扩增到任何条带。两对特异性引物的检测灵敏度均达到10 pg/μL。建立的基于两对特异性引物P2F/P3R和P3F/P3R的分子检测方法可实现对病原菌烟草拟茎点霉的快速准确检测。      

可视化环介导恒温扩增法检测蔬菜产地环境灌溉水源中沙门氏菌

目的建立可视化环介导恒温扩增体系(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测灌溉水源中沙门氏菌的分析方法。方法以沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因序列设计特异性LAMP检测引物,优化LAMP反应体系和反应条件后,通过特异性实验、灵敏度实验对LAMP检测方法进行测试,并与国标检测方法对比检测人工污染的灌溉水源样品,验证该方法的准确性。结果灵敏度实验结果显示本LAMP检测方法最低检出限为7 CFU/25μL,特异性实验结果显示本LAMP检测方法具有良好的特异性,干扰菌株对本LAMP检测方法无影响。该方法在与国家标准检测方法对比,检测人工污染的灌溉水源样品时具有相同的准确性,检测灵敏度为1×10^2 CFU/mL。结论本研究建立了快速、准确、灵敏的恒温扩增体系,可以应用于灌溉水源中沙门氏菌的快速检测。     

环介导等温扩增法检测棘颚口线虫方法的建立

棘颚口线虫是引起人体颚口线虫病最主要的病原,其引起的病例呈世界性分布。由于其复杂的生活史,以及不同生长阶段形态的变化差异,传统的形态学鉴定方法很难鉴别。为了快速、灵敏和可靠的鉴定棘颚口线虫,本研究建立了一套检测棘颚口线虫的DNA环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法。根据LAMP方法原理,针对棘颚口线虫的ITS2 rDNA设计了三套特异性引物特异性识别靶基因。进行了特异性、灵敏度、稳定性和实际样品的测试。结果表明,该方法对棘颚口线虫DNA能够特异性扩增,而比对虫体DNA均无扩增;对含有棘颚口线虫ITS2目的基因片段的质粒DNA的检测限为1 fg/μL,比传统的PCR方法灵敏度高100倍;对51批次实际样品的进行检测,LAMP方法与传统的PCR测序方法结果相符。本研究设计的LAMP检测方法适用于特异性检测棘颚口线虫。     

基于可视化环介导等温扩增技术快速检测金黄色葡萄球菌

应用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）建立基于颜色判定的快速、灵敏的金黄色葡萄球菌检测方法。根据金黄色葡萄球菌特异性靶基因SAR0395设计LAMP引物,建立可视化LAMP检测方法。优化的反应体系为：1.6 μmol/L内引物（FIP和BIP）,0.2 μmol/L外引物（F3和B3）,4.0 mmol/L MgSO4,1.0 mmol/L dNTPs,0.4 U/μL Bst 2.0 WarmStart? DNA聚合酶,120 μmol/L羟基萘酚蓝,扩增温度60 ℃,扩增时间60 min。在可视化LAMP体系中添加两条环引物（LF和LB）反应时间可缩短至20 min。该可视化LAMP反应60 min,其基因组灵敏度可以达到0.010 3 fg/μL,菌落灵敏度可以达到1.9 CFU/mL;利用46 株金黄色葡萄球菌和24 株非金黄色葡萄球菌证实该可视化LAMP具有良好的特异性和可靠性。本研究中建立的可视化LAMP可为金黄色葡萄球菌的快速检测提供一种新的技术。     

食品中单核细胞增生李斯特菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立

基于单核细胞增生李斯特菌胞壁质水解酶iap基因,设计两对特异性引物,利用DNA环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以扩增副产物焦磷酸镁实时浊度为判定标准,建立食品中单核细胞增生李斯特菌LAMP快速检测方法。结果显示,本LAMP方法特异性强,经过对29株细菌进行检测,所试单核细胞增生李斯特菌均为LAMP阳性,其他菌株为阴性;本LAMP方法对单核细胞增生李斯特菌纯培养菌的检测灵敏度为8CFU/管,对污染食品中单核细胞增生李斯特菌的检测灵敏度为12CFU/管。本研究建立的LAMP检测方法简便快速、结果判断直观。     

水产品中副溶血性弧菌LAMP检测方法的优化

本文用副溶血性弧菌不耐热溶血素（tlh）基因作靶标,优化环介导等温扩增技术检测水产品副溶血性弧菌的方法。体系用Bst DNA聚合酶催化,恒温反应60 min,产物分别用2%琼脂糖凝胶电泳和SYBR Green I染色鉴定,对各项反应参数进行优化;将新鲜菌液作10倍梯度稀释后进行LAMP和PCR反应,比较二者的敏感度;对32株食源性病原菌（包括分离于水产品的25株副溶血弧菌,1株副溶血性弧菌ATCC17802标准株,大肠杆菌D5、金黄色葡萄球菌CMCC26003、志贺氏菌B4、蜡样芽胞杆菌63302、单核细胞增生李斯特菌54001和沙门氏菌50041各1株）进行LAMP扩增,验证其特异性;虾样品用菌液进行模拟污染,分析LAMP的可靠性。各参数最佳条件为：Mg2+浓度为3.6 mmol/L,dNTPs浓度为0.96 mmol/L,Bst DNA聚合酶用量为4.8 U,内外引物浓度比为8:1,最佳反应温度为63 ℃,时间为60 min;LAMP的检测限为1 CFU/mL,低于PCR方法的最低检测限;特异性试验检测26株副溶血性弧菌均为阳性,6株非副溶血性弧菌为阴性;人工污染试验中检测限达1 CFU/mL,无假阳性。建立的LAMP方法操作简单且灵敏度高,适用于水产食品中副溶血弧菌的现场快速检测。     

双重LAMP技术快速检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法学研究

建立环介导等温扩增技术(LAMP)同时快速检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的方法。针对副溶血性弧菌tox R和霍乱弧菌omp W基因设计特异性引物,优化反应条件,建立水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的检测方法,并同时应用双重LAMP技术和PCR技术对实验菌株进行副溶血性弧菌和霍乱弧菌检测,比较两种方法的特异性和灵敏度。LAMP的最佳反应温度为61℃,在此条件下,双重LAMP检测技术检测副溶血性弧菌和霍乱弧菌DNA的敏感度可达3.12 fg,且与其他常见的细菌株无交叉反应,特异性为100%;对模拟食品样品进行直接检测时检测限为50 cfu/m L;对60份水产样品进行检测时,6份样品出现LAMP及PCR阳性,而传统培养方法检测出4份阳性。实验结果表明所建立的双重LAMP技术在检测水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌时灵敏度、特异性高,时间成本低,适合于水产品中副溶血性弧菌和霍乱弧菌的快速检测。     

基于锁核苷酸(LNA)增敏的植烟土壤中烟草黑胫病菌定量PCR检测方法

为了快速有效地检测植烟土壤中的烟草黑胫病菌的定殖数量,以一种锁核苷酸(LNA)引物为基础,进行了植烟土壤中烟草黑胫病菌数量的定量PCR 检测方法研究。结果表明:①与普通DNA引物相比,LNA 引物提高了PCR 反应的退火温度,减少了引物二聚体和非特异性产物的形成,提高了烟草黑胫病菌分子检测的灵敏度与特异性;②定量分析检测出14 个烟草-大蒜轮作土样中烟草黑胫病菌的定殖数量为2.76×103～5.20×104个/g,且在4～5 h 内完成检测,具有较高的灵敏度和检测效率。      

环介导等温扩增方法在食品中沙门菌检测的应用和评价

将环介导等温扩增检测方法应用于食品中沙门菌的检验,并在检测方法特异性、灵敏度等方面与实时荧光PCR和传统检测方法进行比较。方法 针对沙门菌属高度保守的fimY基因设计环介导等温扩增检测引物并优化反应体系,在特异性、灵敏度和实际样品检测等方面与实时荧光PCR及传统检测方法比对。结果 本研究建立的LAMP方法检测沙门菌93株和非目标菌31株,具有良好的特异性。在纯培养、无需增菌情况下,其检测灵敏度为6.4×10²cfu/ml,与实时荧光PCR方法相当。食品基质添加试验中,环介导等温扩增方法检测低限为2cfu/25g样品;对45份实际食品样品检测结果表明,该方法实际样品检出率为11.1%,与实时荧光PCR及传统方法检测结果一致。结论 本研究建立的沙门菌环介导等温扩增检测方法具有良好的特异性,检测灵敏度与实时荧光PCR相当,适用于沙门菌的快速筛选。     

食品中牛奶过敏原成分LAMP检测方法的建立

目的 建立食品过敏原牛奶成分LAMP检测方法,并与实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法比对。方法 针对牛线粒体细胞色素b(cyt-b)基因设计LAMP引物并建立反应体系,在特异性和灵敏度方面与real-time PCR检测方法比对。结果 本研究建立的LAMP方法检测9份不同品牌的牛奶和羊奶及其加工制品,没有出现交叉反应,具有良好的特异性。通过添加试验方法的检测灵敏度为0.5 %,与real-time PCR方法检测灵敏度相当。检测了69份实际样品,检测结果与real-time PCR检测结果一致。结论 本研究建立的食品过敏原牛奶成分LAMP检测方法简单经济,检测结果可靠,可有效缩短检测时间,适用于过敏原牛奶成分的检测,具有良好的应用前景。     

二重环介导等温扩增法快速检测乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌

为建立能够同时检测乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的二重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。针对沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因保守区域设计LAMP引物,优化引物浓度,并通过熔解曲线分析判断扩增靶标来源,建立同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的二重LAMP检测方法。结果表明,当沙门氏菌与金黄色葡萄球菌引物浓度比为3∶1时,建立的二重检测体系扩增效率最佳;该方法特异性强、灵敏度高,对6株目标菌株和9株非目标菌株进行检测,未产生任何假阳性和假阴性结果,对2种食源性致病菌的检测灵敏度均达到102 fg/μL;根据熔解曲线中的退火温度可准确判断目标菌株,实现不同菌株的有效区分。建立的二重LAMP方法可用于乳制品企业大规模乳粉样品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的现场快速筛查。     

实时荧光环介导等温扩增技术检测猪肉中的假单胞菌

根据假单胞菌16S rDNA基因序列设计引物,并向反应体系中加入饱和型核酸染料Eva Green,利用实时荧光检测仪,建立假单胞菌属实时荧光环介导等温扩增技术(LAMP)。研究中对62株假单胞菌的16S rDNA基因通过DNAMAN软件进行序列比对后,针对共有片段设计扩增引物。对扩增体系进行了优化,优化结果经电泳鉴定。通过12株假单胞菌和23株非假单胞菌进行特异性验证,并比较了实时荧光LAMP与普通LAMP的灵敏度,对人工污染样品的检出限进行了测定。结果表明,特异性验证中12株假单胞菌为阳性,23株非假单胞菌为阴性。实时荧光LAMP检测纯菌的灵敏度为36 CFU/mL,是普通LAMP灵敏度的10倍。人工污染样品的检出限为1.73×10~3 CFU/g。本研究中建立了一种检测冷鲜猪肉中假单胞菌属的方法,实现了多个菌种的同时检测,避免了单一菌种检测的局限性,该方法快速、准确、灵敏度高,可在2 h内完成冷鲜猪肉中假单胞菌的检测。     

Loop-Mediated Isothermal Amplification for the Event-Specific Detection of Wheat B73-6-1

To develop effective alternatives for detecting genetically modified organisms, we constructed one loop-mediated isothermal amplification (LAMP) event-specific detection method for wheat B73-6-1 in this study. This event-specific LAMP assay can be performed within 38 min without any PCR equipment and the LAMP products can be directly observed by the naked eye instead of conventional gel electrophoresis analysis. The limits of detection of these established visual LAMP assays were about six copies of haploid wheat-genomic DNA. Furthermore, the high specificity of LAMP assays was determined. High specificity and sensitivity, cost-effectiveness, and low requirement of equipment of the developed event-specific LAMP assay of B73-6-1 allow this method to be useful in transgenic wheat samples analysis, especially in highly processed products.