马铃薯α-淀粉酶基因的克隆及生物信息学分析

利用RT-PCR 方法从马铃薯(Solanum tuberosum)茎段总RNA 中扩增、克隆amyA1 基因(NCBI 登录号GQ406048.1)。采用半定量RT-PCR 方法检测amyA1 基因在马铃薯茎、叶等不同组织中的表达强度,表明在茎组织中的表达丰度略高。利用生物信息学软件分析amyA1 密码子的偏好性;同时对AmyA1 氨基酸的理化性质、细胞内定位、保守结构及高级结构进行预测。基于NCBI 数据库中有物种代表性的29 种α - 淀粉酶基因序列构建了基因进化树。amyA1 基因全长1224bp,可编码一条理论分子质量为46.40kD、407 个氨基酸残基组成的、可能为亲水性的胞外酶。与NCBI已登记的马铃薯α - 淀粉酶基因(登录号M79328.1)核苷酸及氨基酸序列同源性达98%。第20～348 位点范围内的氨基酸残基含有与淀粉酶13 家族及亚家族相似的催化活性域(PF00128、SM00624),第349～407位点范围内的氨基酸残基含有α - 淀粉酶C- 末端β折叠区域(PF07821)。蛋白质结构预测表明氨基酸残基序列有维持淀粉酶活性的(β /α) 8 桶状结构以及其他几个功能域结构。所构建的基因进化树表明,两个马铃薯α - 淀粉酶基因与木薯、苹果的序列同源性较高,与菜豆的次之,与水稻、大麦、玉米等单子叶植物的序列同源性较低。     

中度嗜盐菌产α-淀粉酶发酵条件优化和酶活性质研究

实验室从新疆盐湖分离得到1株产α-淀粉酶中度嗜盐菌Bacillus sp.XJ1-05,对该菌株进行发酵条件优化和酶活性质研究,发现该菌株适宜的液态发酵工艺条件为:培养摹碳源为酵母浸粉,氮源为大豆分离蛋白,两者比例1:1,培养温度33~C,发酵时间72h,初始pH值7.0.最大酶活为98U,最佳反应温度为75℃,pH值为6.0～9.0.     

双水相萃取法分离低温α- 淀粉酶的研究

对利用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)- 磷酸盐双水相体系从Pseudoalteromonas arctic GS230 发酵液中直接萃取分离低温α- 淀粉酶进行研究。探讨PEG 分子量、相浓度、pH 值对低温α- 淀粉酶在PEG- 磷酸盐双水相中分配系数、纯化系数及回收率的影响,并进行直线放大实验。结果表明：在pH5.0,PEG-1000 15%- 磷酸盐15% 的双水相体系中,低温α- 淀粉酶的纯化系数及回收率分别为4.8 和87%。     

蟹酱中度嗜盐菌的分离、鉴定及特性研究

从蟹酱中分离纯化鉴定嗜盐菌,对其进行形态学和生理生化特性研究.采用Gibbons培养基分离纯化,通过形态学、生理生化实验进行特性研究,16S rDNA序列比对分析进行鉴定,吸光度法测定生长特性.结果分离得到3株中度嗜盐菌PKY101,PKY102和PKY103,试验结果表明,3种嗜盐菌均为革兰氏阳性菌,不产芽孢,菌体呈球状,直径分别为0.6μm～1.9μm,0.8μm～1.0μm,0.7μm～1.5μm;系统发育分析将3株嗜盐菌鉴定为葡萄球菌属(Staphylococcus)中的3个不同的种,分别为:琥珀葡萄球菌(Staphylococcus succinus)、科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)和马胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum).本研究将为进一步研究蟹酱中的嗜盐菌的类型及在发酵盐渍类食品中的作用开展了前期的基础工作,为防止嗜盐菌污染食品提供了理论参考.     

氨基化硅胶作载体固定化α-淀粉酶的研究

采用5 种硅胶作为载体,戊二醛作偶联剂,制备了固定化α- 淀粉酶。对制备固定化α- 淀粉酶的硅胶目数、偶联剂浓度、温度、pH 值的影响因素进行了研究和优化。并对固定化酶和游离酶的酶学性质进行了比较。结果表明：固定化酶的最适温度为75℃,比游离酶提高了10℃,固定化酶的热稳定性优于游离酶。与游离酶相比,其对酸碱的适应性、贮存稳定性、操作稳定性也都有较明显改善。固定化酶的Km 值略低于游离酶,前者为2.13mg/ml,后者为1.02mg/ml。     

嗜热菌Geobacillus sp.HB1的分离鉴定及其α-淀粉酶基因克隆表达

淀粉加工和利用是广西的支柱产业,各种优良淀粉酶的开发一直是研究热点。本文从云南腾冲热海温泉分离到一株产嗜热Ⅶ-淀粉酶的菌株Geobacillus sp.HB1,经扩增其16Sr DNA测序比对,表明其与已公布基因组序列的嗜热芽孢菌Geobacillus sp.C56-T3具有99%的相似性。根据Geobacillus sp.C56-T3的AMY2基因设计引物,从Geobacillus sp.HB1中扩增出Ⅶ-淀粉酶基因HBCANH1,其与AMY2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的一致性分别为96.7%和98.0%,以p ET-22b(+)为载体构建重组质粒p HBCANH1并在大肠杆菌中获得了外源基因的表达,经破胞后测得表达活力为172.38U/m L。重组酶HBCANH1最适反应温度为70℃,最适反应p H为6.4,具有较好的应用研究前景。     

海洋低温α-淀粉酶菌株Bacillus thuringiensis dsh 19-1发酵条件研究

α-淀粉酶是催化淀粉水解的酶类,其广泛应用于食品、医学等领域。该研究利用响应面法设计试验,优化了海洋低温α-淀粉酶菌株Bacillus thuringiensis dsh 19-1的发酵条件。其最佳发酵条件为发酵时间42.4 h,发酵温度20.6 ℃,接种量4.1%。在上述优化条件下α-淀粉酶酶活可达3.06 U/mL,较优化前提高17.69%。     

芽胞杆菌XM-1酸性α-淀粉酶基因的克隆及原核表达

为使枯草芽胞杆菌XM-1菌株酸性α-淀粉酶基因高通量表达,提高酶产量,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出该酶基因As-Amy,并构建pET30a(+)/As-Amy原核表达载体,在大肠杆菌BL21中成功表达。测序结果表明As-Amy基因编码框全长为1434bp(Genbank登录号GQ153530),编码477个氨基酸,预测蛋白质分子质量为61ku。序列比对分析表明,As-Amy与多个枯草芽胞杆菌α-淀粉酶基因相似性在98%以上,所编码氨基酸与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis natto)IAM1212同源性最高。SDS-PAGE分析显示,As-Amy基因在大肠杆菌BL21中获得表达,酶活力较原菌株XM-1提高了2.7倍,表达蛋白分子质量大小与预测值相符。     

重组大肠杆菌耐热α - 淀粉酶的分离纯化及其酶学性质研究

对重组大肠杆菌耐热α- 淀粉酶分离纯化及其酶学性质进行研究,结果表明：该酶分子量约为90kD,最适温度为60～70℃,最适pH 值为6.6,酶学动力学常数Km 值为143.52mmol/L;酶活力在pH5.4～7.8 较为稳定;4℃保存2 周酶活力仅下降一半,35℃保温3d 有50% 以上的酶活力,70℃以上酶失活很快;Mn2+ 对酶催化作用有较大的促进,K+、Ca2+ 有微弱的促进作用,Mg2+ 对催化反应无影响,Cu2+ 的抑制作用最强,其他金属离子Co2+、Zn2+、Fe2+ 对酶催化作用有不同程度的抑制作用;有机离子对酶催化作用均是抑制作用,其中抑制作用最强的是SDS。     

响应面法优化一株中度嗜盐菌的培养条件

利用响应面法优化一株筛选自腌肉制品表面中度嗜盐菌的培养条件.在单因素实验基础上,采用Plackett-Burman设计对影响嗜盐菌生长的重要培养基成分和工艺条件进行筛选,确定主要影响因子为盐度、初始pH和培养温度;再用最陡爬坡实验逼近最大响应区域;最后用中心组合设计和响应面分析法,确定了主要影响因子的取值.优化后的培养基组成为胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 54.8g/L;培养工艺条件为初始pH7.9、培养温度32.8℃、装液量70mL/250mL摇瓶、摇床转速120r/min.在此培养条件下培养2d后,菌体密度(OD600nm净增值)达3.349±0.021,较优化前提高了13％.     

裂殖壶菌鲨烯合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

为探讨裂殖壶菌烯合酶基因的克隆,以及在大肠杆菌中的表达。采用简并引物与RACE 相结合的方法从裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)中克隆出鲨烯合酶基因。分析表明该基因的cDNA 全长包括1672 个核苷酸,编码一个含446 个氨基酸的开放阅读框;在裂殖壶菌中以单拷贝的形式存在。同源分析显示裂殖壶菌鲨烯合酶的氨基酸序列中含有5 个保守基序。将裂殖壶菌鲨烯合酶的cDNA 序列连接到原核表达载体pGEX-4T-3 上构建融合表达载体,并在大肠杆菌BL21 中进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE 及Western blotting 分析结果显示,诱导表达出的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,其相对分子质量与预期相符;且融合蛋白具有一定的免疫原性。     

淀粉酶基因的克隆及其在工业啤酒酵母中的表达

以扣囊复膜孢酵母菌总DNA为模板，通过PCR扩增克隆到约1．5kb的α-淀粉酶基因(AMY)。用酵母菌穿梭载体YEp352为出发质粒，磷酸甘油酸激酶基因1(PGK1)启动子和乙醇脱氢酶基因1(ADH1)终止子为调控元件构建了含α-淀粉酶基因编码序列的酵母菌重组表达质粒pLA8。pLA8导入工业啤酒酵母菌，在以淀粉为唯一碳源的YNBS培养基上筛选阳性转化子，转化子培养液中α-淀粉酶活性为1．1U／ml，细胞破碎液的酶活性为0．3U／ml，而受体菌培养液及细胞破碎液中末检测到α-淀粉酶活性。     

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其产物的分泌

以耐高温α 淀粉酶生产菌地衣芽孢杆菌染色体DNA为模板 ,通过PCR扩增耐高温α 淀粉酶基因 ,将扩增产物 1 9kb的DNA片段插入到pUC1 9质粒中 ,再转化大肠杆菌JM1 0 9,通过在淀粉平板上形成透明圈等方法筛选到一株阳性克隆菌株JM1 0 9(pUAM) ,其表达产物可分泌到培养基中 ,除去菌体的发酵液中每 1 0 0mL酶活可达到 2 7个单位。将发酵上清液浓缩后用冷无水乙醇分级沉淀 ,所得样品进行SDS PAGE分析 ,得到分子质量为 60ku的目的蛋白带。     

根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因克隆、 结构预测及原核表达

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶能够催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖。为实现D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的异源表达,设计引物,克隆并分离其序列,通过生物信息学软件分析D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DNA和蛋白质的结构特点。结果表明,该基因开放阅读框870bp,编码289个氨基酸;蛋白质二级结构中α-螺旋占38.41%,β-折叠占47.06%,无规则卷曲占14.53%;该蛋白为亲水性蛋白,不含信号肽,无跨膜区,定位于细胞膜;构建原核表达载体并导入E.coliBL21宿主中,表达的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶分子质量约为33kDa,1mmol/LIPTG诱导E.coliBL21重组菌28h后,目的蛋白表达量和酶活分别为0.32g/L和3.8U/mL。根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因能够在大肠杆菌中实现表达。     

碱性芽孢杆菌木聚糖酶基因的克隆及表达

本实验从广西红树林土壤中筛选出一株产木聚糖酶的耐碱菌HSL38,经过16S rDNA鉴定,其与碱性芽孢杆菌Bacillus halodurans C-125(GenBank：NC_002570.2)的同源性达到99%。参考Bacillus halodurans C-125的β-1,4-木聚糖酶基因xynA设计引物,扩增出HSL38中的β-1,4-木聚糖酶基因xyl-BH-G10,其与xynA的同源性达到99%,编码396个氨基酸残基(45.27kD),属于糖基水解酶GH10家族。将xyl-BH-G10基因与表达载体pET-30a-c(+)连接,构建重组载体,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白。结果表明,在最佳诱导条件下,木聚糖酶基因xyl-BH-G10在大肠杆菌细胞内高效表达,酶活力达到55.28U/mL,是原菌株HSL38发酵液酶活力的4倍。     

克氏原螯虾虾青蛋白A2基因克隆、组织分布及原核表达

虾青蛋白对甲壳类水产品色泽的形成和调控具有重要作用。为探究克氏原螯虾虾青蛋白A2(PcCRA2)的基因结构及原核表达,作者通过基因克隆获得PcCRA2基因编码序列（cra2）,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测cra2基因在克氏原螯虾9种组织中的表达模式,并以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,进行PcCRA2异源重组表达。结果表明,克氏原螯虾cra2基因cDNA全长573 bp,编码190个氨基酸。生物信息学分析显示,虾青蛋白A2相对分子质量为21 158.9,理论等电点为5.59。氨基酸序列比对发现,克氏原螯虾cra2编码蛋白质序列与红螯螯虾相似度最高,为91.58%。RT-qPCR结果显示,cra2在所检组织中均有表达,在表皮的表达量最高（P<0.05）。构建了pET28a-cra2原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达。其最佳诱导表达条件为：接种4 h后加入0.5 mmol/L IPTG于30℃诱导6 h;UV-vis结果表明重组蛋白质能与虾青素特异性结合,最大吸收峰为505 nm。该研究结果为进一步研究虾青蛋白质的生物功能奠定基础。