口服CD226 DNA疫苗对小鼠免疫功能的影响

目的制备口服CD226 DNA疫苗,观察该疫苗对小鼠免疫功能的影响。方法以质粒CD226-PCR2.1-ToPo为模板,PCR扩增CD226基因,克隆至pcDNA3.1载体,构建真核表达质粒pcDNA3.1-CD226,利用脂质体LipofectamineTM2000瞬时转染CT-26细胞株,采用RT-PCR法、Western blot法、流式细胞术检测CD226基因在CT-26细胞中的表达。将质粒pcDNA3.1-CD226用脂质体Lipofectamine TM2000包裹制成CD226 DNA疫苗(100μg质粒/100μl脂质体),经灌胃免疫C57BL/6小鼠,实验分CD226疫苗组、pcDNA3.1组和生理盐水组,流式细胞术检测CD226在小鼠脾细胞中的表达;还原酶法检测NO分泌水平;乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞杀伤活性;ELISA法检测脾细胞培养上清中细胞因子(IL-2、IL-4、IFNγ和TNF-α)分泌水平;Real-time PCR法检测肠黏膜组织内细胞因子表达水平。结果质粒pcDNA3.1-CD226经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;质粒pcDNA3.1-CD226转染CT-26细胞的转染率为32.14%,转染的CT-26细胞检测到CD226蛋白表达。CD226疫苗组CD226 CD4+T细胞的绝对数、NK细胞杀伤活性、NO分泌水平、脾细胞培养上清中TNF-α、IFNγ和IL-2分泌水平、肠黏膜组织内TNF-α和IFNγ基因mRNA水平均明显高于pcDNA3.1组和生理盐水组(P0.05);而CD226疫苗组脾细胞培养上清中IL-4分泌水平及肠黏膜组织内IL-2和IL-4基因mRNA水平,与pcDNA3.1组和生理盐水组相比,差异无统计学意义(P0.05)。结论 CD226DNA疫苗经灌胃免疫,可诱导小鼠全身Th1型免疫应答增强和肠道局部部分Th1型免疫应答增强。     

HRE/Egr-1调控的shTRAIL基因对A549细胞的辐射增敏效应

目的观察HRE/Egr-1调控的shTRAIL基因对肺腺癌A549细胞的辐射增敏效应。方法将前期构建的含有HRE/Egr-1双敏感启动子介导的shTRAIL基因的质粒pcDNA3.1-HRE/Egr1-shTRAIL经脂质体介导,转染肺腺癌A549细胞,将转染细胞分为3组:乏氧组、照射组和乏氧+照射组,分别进行相应处理,并设正常细胞作为对照。RT-PCR检测各组细胞shTRAIL基因mRNA的转录水平;双抗体夹心ABC-ELISA检测各组细胞上清中shTRAIL的含量;平板克隆实验检测各组细胞的放射敏感性。结果乏氧组、照射组和乏氧+照射组A549细胞shTRAIL基因mRNA的转录水平及细胞上清中shTRAIL蛋白的含量均较正常对照组明显增加,其中,乏氧+照射组最高。常氧条件下,转染质粒pcDNA3.1-HRE/Egr1-shTRAIL的A549细胞和正常对照组细胞的D0值分别为1.89和3.26;而在乏氧条件下,两组的D0值分别为1.13和5.81,表明乏氧条件下质粒转染组A549细胞的放射敏感性最高。结论HRE/Egr-1调控的shTRAIL基因在乏氧和辐射条件下,能够诱导A549细胞中shTRAIL基因mRNA转录和蛋白表达水平增加,并增加细胞的放射敏感性。     

信号调节蛋白-α基因真核表达质粒的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建信号调节蛋白-α(signal regulatory protein-α,SIRP-α)基因真核表达质粒,并于A549细胞中进行表达。方法提取Hep G2细胞总RNA,RT-PCR扩增SIRP-α基因片段,克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)-EGFP中,构建真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP。将重组表达质粒转染A549细胞,转染24 h后,荧光显微镜下观察转染情况;转染48 h后,RT-PCR检测SIRP-α基因的转录水平;转染72 h后,Western blot法检测SIRP-α蛋白的表达。结果经双酶切和测序鉴定真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP构建正确;转染pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP的A549细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光;RT-PCR检测结果可见243 bp目的条带,Western blot检测显示SIRP-α存在。结论成功构建了真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP,并于A549细胞中有效表达,为进一步研究SIRP-α与肺癌的相关性奠定了基础。     

P4HB基因真核表达质粒的构建及在人肺腺癌A549细胞中的表达

目的构建人P4HB基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的表达。方法采用RT-PCR法从正常人肝细胞HL7702中扩增P4HB基因片段,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB,在脂质体LipofectamineTM 2000介导下转染A549细胞,通过G418加压筛选,建立稳定转染细胞系,通过qPCR和Western blot法检测转染细胞中P4HB基因mRNA的水平及蛋白的表达水平。结果重组真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB经双酶切(BamHⅠ/EcoRⅠ)和测序证实构建正确;质粒pcDNA3.1-P4HB转染的A549细胞中P4HB基因mRNA的水平为空载体转染的细胞和未转染细胞的102倍;质粒pcDNA3.1-P4HB转染的A549细胞中P4HB蛋白的表达量(1.71)较未转染的A549细胞(1.11)明显升高。结论成功构建了P4HB基因真核表达质粒pcDNA3.1-P4HB,转染A549细胞后,P4HB基因在mRNA水平和蛋白水平均出现了较强的表达,表明P4HB基因已稳定转染入A549细胞中。本实验为进一步研究P4HB对人肺癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响奠定了基础。     

miRNA-21对肺癌A549细胞抑癌基因PTEN表达的调控

目的探讨miRNA-21对肺癌A549细胞抑癌基因PTEN表达的调控作用。方法人工合成miRNA-21序列,插入到质粒pGenesil-1中,构建重组真核表达质粒,并转染至肺癌A549细胞,采用RT-PCR和Western blot分别检测细胞PTEN基因mRNA转录水平和蛋白的表达水平。结果经酶切和测序鉴定,表明重组真核表达质粒构建正确。转染重组真核表达质粒的A549细胞PTEN基因mRNA转录水平与未转染组相比,差异无统计学意义,蛋白表达水平较未转染组明显降低。结论miRNA-21可能主要在翻译水平调控PTEN基因的表达。     

小脑症1基因过表达对人肺癌细胞A549凋亡的影响

目的探讨小脑症1(microcephalin 1,MCPH1)基因过表达对人肺癌细胞A549凋亡的影响。方法将质粒pcDNA3.1(-)/MCPH1转染肺癌细胞株A549,并设阴性对照组[pcDNA3.1(-)质粒转染]和未转染组。转染48 h后,采用qRT-PCR法检测各组细胞中MCPH1基因mRNA的转录水平;转染72 h后,Western blot法检测各组细胞中MCPH1蛋白的表达水平,流式细胞术分析细胞的凋亡情况。结果质粒pcDNA3.1(-)/MCPH1转染A549细胞后,均可明显上调细胞中MCPH1基因mRNA和蛋白的表达,与阴性对照组和未转染组相比,差异均有统计学意义(P0.05);质粒pcDNA3.1(-)/MCPH1转染组细胞凋亡率[(16.82±1.29)%]较阴性对照组[(6.27±0.88)%]和未转染组[(5.36±0.43)%]明显升高,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 MCPH1过表达后可明显促进A549细胞的凋亡,为进一步研究MCPH1基因在肺癌细胞凋亡中的作用及其机制奠定了基础。     

人CD147基因siRNA真核表达质粒的构建及其对HeLa细胞中CD147基因表达的影响

目的构建针对人CD147基因的siRNA真核表达质粒,并观察其对HeLa细胞中CD147基因表达的影响。方法根据GenBank中登录的人CD147基因序列,设计并合成针对CD147基因的特异性小干扰片段,并将其定向克隆至带有卡那霉素抗性和增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。用脂质体将重组质粒转染至HeLa细胞中,观察其对HeLa细胞CD147基因mRNA及蛋白表达水平的影响。结果酶切鉴定和测序结果表明,3个表达短发夹RNA的质粒及其阴性对照质粒构建正确。3个siRNA真核表达质粒对HeLa细胞CD147基因mRNA转录水平的抑制率分别为32.5%、66.8%和59.1%;对CD147蛋白表达水平的抑制率分别为28.3%、63.5%和56.2%。结论已成功构建针对人CD147基因的siRNA真核表达质粒,其对HeLa细胞CD147基因的表达具有明显的抑制作用,为进一步研究CD147基因的功能奠定了基础。     

Survivin启动子调控的EGFP基因真核表达质粒的构建及其在肺癌细胞中的特异性表达

目的构建由Survivin启动子调控的EGFP基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达。方法以A549细胞基因组DNA为模板,PCR扩增Survivin启动子,替换pEGFP-C1载体中的CMV启动子,构建携带Survivin启动子的pEGFP-C1真核表达质粒pEGFP-C1/Surp,转染A549细胞及人胚肺成纤维细胞MRC-5,在荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果重组表达质粒pEGFP-C1/Surp经双酶切和测序鉴定,证明构建正确。转染A549细胞和MRC-5细胞后,在荧光显微镜下可见A549细胞有较强的绿色荧光,而MRC-5细胞则未见绿色荧光。结论已成功构建以Survivin启动子为调控序列、EGFP为标示蛋白的真核表达质粒,且具有较强的肿瘤特异性启动活性,为进一步开发肿瘤靶向性基因治疗载体奠定了基础。     

CD1d融合蛋白的表达及其在自然杀伤T细胞原代培养中的作用

目的 构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(-)-CD1d-hIgG1-BriAtag,建立稳定表达CD1d融合蛋白的细胞系,并检测该蛋白对体外培养人原代自然杀伤T(natural killing T,NKT)细胞的活化刺激功能,为肿瘤过继性免疫治疗提供新方法.方法 从健康人外周血提取CD1d全长基因作为目的DNA片段...     

人葡萄糖调节蛋白78shRNA真核表达质粒的构建及其稳定转染A549细胞系的建立

目的构建人葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 k D,GRP78)shRNA真核表达质粒,并建立其稳定转染A549细胞系。方法根据Gen Bank中登录的人GRP78基因序列(3309)设计3对互补寡聚单链DNA干扰序列(GRP78-mi R-1、GRP78-mi R-2、GRP78-mi R-3)及1对阴性对照,分别插入至载体pc DNA6.2TM-GW/Em GFP,构建shRNA真核表达质粒。在Lipofectamine 3000介导下将各shRNA真核表达质粒分别转染A549细胞,并经Blasticidin S HCl加压筛选稳定的转染细胞系。实时荧光定量PCR和Western blot法检测A549细胞中GRP78基因m RNA转录和蛋白表达水平。结果各shRNA真核表达质粒经测序鉴定证明均构建正确。稳定转染shRNA真核表达质粒的A549细胞,在荧光显微镜下可见均一表达绿色荧光。与空白对照组比较,A549细胞中GRP78基因m RNA转录和蛋白表达水平明显降低(P0.05),阴性对照组无统计学意义(P0.05)。结论成功构建了人GRP78的shRNA真核表达质粒,并建立了其稳定转染的A549细胞模型,为进一步研究GRP78在肺癌细胞的侵袭和转移中的作用机制奠定了基础。     

人乳腺癌抗雌激素药物耐药蛋白1基因siRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人乳腺癌抗雌激素药物耐药蛋白1(Breast cancer anti-estrogen resistance 1,BCAR1)基因siRNA慢病毒载体,并进行鉴定。方法针对人BCAR1基因靶序列设计并合成4条siRNA序列(PLVT350、PLVT351、PLVT352、PLVT353)及1条阴性对照序列(PLVT4),分别退火后,插入经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切的慢病毒载体pMagic 4.1中,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,经PCR和DNA测序筛选阳性克隆,提取重组干扰质粒,与辅助质粒共同感染293T细胞,进行慢病毒包装,浓缩后,采用梯度稀释法测定病毒滴度。将重组慢病毒感染A549细胞,荧光显微镜下观察感染效率,实时荧光定量PCR检测干扰效率,筛选干扰效果最好的重组慢病毒感染肺癌A549细胞,Western blot检测BCAR1蛋白的表达水平。结果成功构建了4种人BCAR1基因慢病毒干扰质粒,PLVT350、PLVT351、PLVT352和PLVT353的病毒滴度分别为3.45×108、2.13×108、3.01×108和2.47×108TU/ml;慢病毒感染3 d后,A549细胞的感染效率均达90%以上;除PLVT350外,其他3个均为有效靶点,PLVT351、PLVT352和PLVT353的沉默率分别为82%、73%和82%,BCAR1基因的表达量显著低于未转染和PLVT4组A549细胞(P<0.001);PLVT351感染的A549细胞中BCAR1蛋白的表达水平明显低于未感染和PLVT4组A549细胞(P<0.01)。结论成功构建了人BCAR1基因siRNA慢病毒载体,并建立了稳定表达的A549细胞株,为进一步探索BCAR1基因在肺癌中的相关功能及其分子机制奠定了基础。     

Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒的构建及其在人肺癌细胞中的表达

目的构建胞内病原体抗性基因1(Ipr1)和绿色荧光蛋白(GFP)基因真核共表达穿梭质粒,并在人肺腺癌细胞A549中表达。方法采用PCR方法,分别从质粒pEGFP-C1-Ipr1和pEGFP-C1中扩增Ipr1和GFP基因,将GFP基因、分枝杆菌复制子OriM和Ipr1基因同时克隆入多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,构建pBud-GFP-OriM-Ipr1穿梭质粒,脂质体法转染A549细胞,荧光显微镜观察GFP的表达,免疫组化方法检测Ipr1蛋白的表达。结果酶切和测序分析表明,pBud-GFP-OriM-Ipr1真核共表达穿梭质粒构建正确。转染A549细胞后,荧光显微镜下可观察到转染细胞中有GFP表达,免疫组化法可检测到Ipr1蛋白的表达,且定位于细胞核内。结论已成功构建Ipr1和GFP基因真核共表达穿梭质粒,为进一步研究Ipr1抗结核的功能奠定了基础。     

猪卵透明带3α重组腺病毒的构建及纯化

目的构建猪卵透明带3α(pZP3α)重组腺病毒,并包装与纯化病毒,为研究猪ZP3α重组腺病毒避孕疫苗奠定基础。方法将pZP3α基因克隆至穿梭质粒pShuttle,重组穿梭质粒pSshuttle-pZP3α再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-5共转化大肠杆菌BJ5183,筛选重组腺病毒质粒pAd-pZP3α,脂质体法转染HEK293A细胞,包装并扩增病毒至第4代。收集重组病毒颗粒,经两轮氯化铯密度梯度离心纯化,紫外吸收法测定总病毒颗粒数(VP),并计算病毒的颗粒性滴度,空斑形成试验测定病毒的感染性滴度。以MOI为10的病毒剂量感染HeLa细胞,PCR鉴定插入病毒的目的基因,斑点免疫印迹法鉴定目的蛋白的表达。结果pZP3α基因成功插入病毒基因组,pZP3α蛋白能在病毒感染的HeLa细胞中正常表达。病毒的颗粒性滴度约为1.3×1011VP/ml,感染性滴度约为3×109PFU/ml。结论已成功构建猪ZP3α重组腺病毒质粒pAd-pZP3α,包装并纯化了重组pZP3α腺病毒颗粒。     

Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白的表达及纯化

目的获得高纯度的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白。方法以Vif/VR1012质粒为模板,PCR扩增出Vif-ΔN28基因并插入pRSETB质粒。将构建的原核表达载体Vif-ΔN28/pRSETB以及已有的Cullin5-N138/pRSETB质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,产物经Ni-NTA离子纯化柱纯化、复性。结果所表达的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白约占各自菌体总蛋白的20%,纯化后蛋白纯度均可达90%以上。结论已成功构建了Vif-ΔN28原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达,获得了可溶性的纯化的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白。     

hTERT核心启动子调控HSV-TK自杀基因系统诱导肿瘤细胞的凋亡

目的观察人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子调控逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统诱导肿瘤细胞凋亡的效果。方法采用PCR方法扩增胸苷激酶(TK)基因,并构建由hTERT核心启动子调控的胸苷激酶重组逆转录病毒载体pLNC-hTERTp-TK,转染包装细胞PT67,G418筛选阳性细胞克隆,检测病毒滴度,PCR法检测转染细胞中的TK基因。将获得的重组逆转录病毒感染人肺癌细胞株A549、肝癌细胞株SMMC-7721、宫颈癌细胞株HeLa和正常人成纤维细胞系WI-38,G418筛选阳性克隆,MTT法检测重组逆转录病毒对肿瘤细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡。结果重组逆转录病毒载体pLNC-hTERTp-TK经双酶切,可见1402bp的目的基因片段,表明质粒构建正确。从转染的PT67细胞中扩增出1131bp的基因片段,与TK基因大小一致。在成功转染重组逆转录病毒的PT67细胞中,病毒滴度最高者可达7.8×105CFU/ml。重组逆转录病毒感染的3种肿瘤细胞的增殖均受到抑制,且生长抑制率随着GCV浓度的增加而升高,经较低浓度GCV(10μg/ml)处理的3种肿瘤细胞,凋亡率分别可达37.06%、34.88%和33.59%。结论由hTERT启动子调控的逆转录病毒介导的HSV-TK/GCV自杀基因系统可诱导肿瘤细胞凋亡,且具有较强的特异性和高效性。     

HIV-1 DNA疫苗的构建及免疫原性

目的构建稳定表达HIV-1Gag-Pol蛋白的DNA疫苗,提高目的基因的表达效率。方法对HIV-1野生型Gag-Pol基因序列进行优化,使用本室构建的表达载体VR,构建重组质粒VR-GPCINS。将构建的重组质粒VR-GPCINS转染HEK293细胞,Western blot鉴定表达产物。用构建的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,Western blot检测体液免疫反应。结果成功构建能稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的VR-GPCINS质粒,Western blot在免疫小鼠的血清中检测到抗p24的特异性抗体。结论含优化Gag-Pol基因序列的质粒DNA疫苗VR-GPCINS在细胞表达和体液免疫方面均明显优于含野生型Gag-Pol基因序列的质粒DNA疫苗VR-GP。     

颗粒溶素活性肽与增强型绿色荧光蛋白融合基因真核表达质粒的构建及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的构建人颗粒溶素(GLS)活性肽(9ku-GLS)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因的真核表达载体,并检测其在小鼠黑色素瘤细胞B16中的表达。方法经PCR扩增9ku-GLS基因,插入质粒pBudCE4.1中,经酶切及测序鉴定正确后,亚克隆至质粒pEGFP-C1中,将融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K转染B16细胞,采用荧光显微镜及RT-PCR法检测融合蛋白的表达。结果融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K经双酶切鉴定证明构建正确,转染B16细胞24h后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,且经RT-PCR可扩增出267bp的目的基因片段。结论已成功构建9ku-GLS与EGFP融合基因的真核表达质粒,且在B16细胞中表达了融合蛋白。