米根霉乳酸脱氢酶的特性研究

乳酸脱氢酶(LDH)是米根霉发酵生产L-乳酸中催化丙酮酸转化成L-乳酸过程的关键酶。本研究从米根霉As3.819中初步分离出乳酸脱氢酶,并结合发酵条件对其酶学特性进行了研究。结果表明,该乳酸脱氢酶的最适反应pH为7.4,最适催化温度为30～50℃。Mg2+、Ca2+对该酶有激活作用,K+、Zn2+对该酶有抑制作用。以NADH和丙酮酸为底物的米氏常数分别为7.22×10-4mol/L和1.24×10-3mol/L。     

米根霉葡萄糖淀粉酶的分离纯化及特性研究

葡萄糖淀粉酶是米根霉在淀粉质培养基中诱导分泌的一类胞外酶，其表达对米根霉转化淀粉生成L-乳酸的效率，以及L-乳酸分批发酵周期的长短有很大影响。本文对米根霉葡萄糖淀粉酶进行分离纯化，并研究其酶学性质，结论如下：经硫酸铵盐析、透析脱盐、Sephadex G-100柱层析等纯化步骤，葡萄糖淀粉酶比活力提高23倍。SDS-PAGE显示纯化后的酶为一条带，相对分子量约75．5kD。该酶以可溶性淀粉为底物时最适催化反应pH值为4．0～6．0，最适催化反应温度为40-50℃，在50℃下保持稳定。钙离了和锰离子对该酶活力有一定的增强作用，而铅离子和亚铁离子对其活力有明显的抑制作用。     

醋酸杆菌醇脱氢酶粗酶液的特性研究

乙醇脱氢酶(ADH)是醋酸杆菌发酵生产醋酸的关键酶.以硫酸铵为沉淀剂,采用盐析法对醋酸杆菌中乙醇脱氢酶进行初步的分离纯化,并研究其酶学特性.结果表明:ADH比活力从粗酶液的0.201 U/mg提高到0.460 U/mg,纯化倍数为2.289;其最适作用pH值为7.5～8.0,pH值为7.8时酶活力达到最大,pH值为7.0时酶较为稳定;最适作用温度为35℃,温度为30℃～40℃时酶活力较为稳定,温度超过45℃后酶活力急剧下降.通过对乙醇底物浓度对ADH活力影响的研究,ADH对乙醇的米氏常数Km为2.59×10-2mol/L.     

米根霉产L-乳酸耐温菌株的60Co-γ射线诱变选育

目前产L-乳酸的米根霉菌株的最适发酵温度为32℃,该温度较低,不利于产物分离且易染杂菌。以米根霉As3.819为出发菌株,采用60Co-γ射线进行诱变处理,以正突变率为指标,诱变剂量为400Gy,通过筛选得到耐38℃高温的5号突变株mut-5,经连续传代7次,遗传性状稳定。与出发菌株相比,发酵72h后,mut-5突变株发酵液中的乳酸含量提高了24.15%,乙醇含量降低了9.27%。乳酸脱氢酶(LDH)比活力提高了39.41%,乙醇脱氢酶(ADH)比活力有所下降,而对还原糖的利用速率以及生物量的积累均高于出发菌株。     

L-乳酸米根霉发酵体系LDH活力及代谢调控研究

乳酸脱氢酶(LDH)是米根霉代谢生产L-乳酸过程的关键酶，研究其在发酵过程中的活力变化，从酶水平分析发酵条件对L-乳酸发酵的影响，对米根霉发酵生产L-乳酸的人工代谢调节、菌种选育具有重要意义。本文研究了摇瓶条件下的米根霉AS3．1208发酵体系中乳酸脱氢酶的活力调控条件及与L-乳酸即时产率的关系，结果表明，发酵体系中L-乳酸产率与LDH活力在36～40h时最高。葡萄糖作为C源的L-乳酸产率与LDH活力比甘薯淀粉高。与牛肉膏和蛋白胨相比，硫酸铵是米根霉代谢的最佳N源，0．40％的硫酸铵具有较高的乳酸产率与LDH活力。发酵培养基中添加CaCO3与否，对乳酸产率与LDH活力有极大影响。以甘薯淀粉为碳源，在250ml三角瓶中的装液量为100ml，发酵36～40h时的L-乳酸即时产率最大，此时LDH活力也最高。     

根霉3.010产纤维素酶酶学特性研究

对根霉3.010所产纤维素酶酶学特性进行了分析研究.实验结果显示:根霉在培养的第6d～8d为纤维素酶旺盛分泌期,其最适反应温度为50%左右,且在40℃以下热稳定性较好:纤维素酶的最适反应pH值为4.0-6.0,在pH4.0～7.0时稳定性较好.在1.0%的浓度下,CaCl2、MnSO4和CoCl2均对该酶有激活作用;而KCI、ZnSO4和CuSO4则对该酶活力有不同程度的抑制作用;NaCl、FeS04和Mg2SO4对根霉纤维素酶活力影响不明显.     

胃乙醇脱氢酶δδ-ADH的原核表达及酶学性质

为获得人胃乙醇脱氢酶δδ-ADH,根据GeneBank中δδ-ADH的基因序列合成目的基因ADH7,构建重组表达载体pET-32a(+)-ADH7,并转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。获得的阳性转化子经异丙基硫化-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,目的蛋白质以包涵体的形式得到大量表达。用1 mol/L尿素溶解包涵体获得有活性的粗酶液,经HisTrapTM excel亲和层析柱纯化获得目的蛋白质,检测δδ-ADH酶活并对其基本酶学性质进行研究。结果显示,δδ-ADH的活性为2.085 U/mg,Km为28.43 mmol/L,Vmax为316.46μmol/(L·min)。δδ-ADH的最适反应温度为40℃,在30～50℃范围内温浴60 min,相对酶活在47%以上;最适pH为9.0,将δδ-ADH在不同pH(pH 3.0～11.0)的广泛缓冲液中于25℃保温30 min,在pH 6.0～11.0范围内酶活较稳定。pH 5.0时,相对酶活剩余60%;在0、500、1 000、1 500 mmol/L乙醇中37℃温浴30 min,相对酶活分别为65.6%、51.1%、45.4%和44.4%。     

米根霉F6生长和发酵特性的研究

研究米根霉F6的生长和生产特性。以菌体生长情况和菌株的糖化力为主要评价指标,以单因子试验评价主要营养因素对F6菌株生长的影响,并分析了用F6与其他常用米根霉菌株酿造的甜酒中的氨基酸含量。结果表明,F6对各种元素的需求从高到低的顺序依次为:磷、镁、钾、硫、铁、锌;在PDA培养基中菌体生长较好;经察氏麸皮培养基培养后糖化力明显提高;32℃下糖化力最高;可耐受温度范围为-18~65℃;与F14和Q303菌株相比,其甜酒中18种氨基酸总含量(1.7 g/100 mL)和人体中8种必需氨基酸的总含量(0.53 g/100 mL)均达最高。PDA适合做F6的传代或保存培养基;察氏麸皮培养基做米根霉F6的生产活化培养基为佳;32℃是根霉F6的最适生长和产酶温度;F6菌株具有较好的发酵特性。     

米根霉产糖化酶发酵条件的研究

以R.SCLG 0319菌株的糖化酶催化活性为指标,研究了发酵时间、温度、装液量、初始pH值及相关金属离子等因素对该菌株发酵产糖化酶活力的影响.结果表明,R.SCLG 0319菌株摇瓶发酵产糖化酶40h为宜,最适发酵温度30℃,装液量100mL/250mL,培养基初始pH值6.0;菌株对低浓度乙醇作用呈现依赖性,培养基中6%vol酒精度时酶活力达到135 U/mL,可耐12%vol酒精度,在高浓度乙醇作用下酶活力迅速下降;Cu2+、Ca2+ 和Mg2+呈现激活效应,其中Mg2+的效应最明显,酶活力增强50%,Fe2+、Zn2+ 和Mn2+呈现出抑制效应,其中Fe2+的抑制作用最大,酶活力降低近80%.     

米根霉糖化酶酶促反应条件的研究

以米根霉(Rhizopus oryzae)为供试菌株采用DNS法测定糖化酶的酶活力,系统地研究由该菌株分泌的糖化酶的酶促反应条件,主要考察反应时间、不同底物、底物浓度、反应温度、底物pH及金属离子等因素对酶活力的影响.结果表明,该酶系具有较高的酶活力可达到90 U/mL.对碳链较长的底物表现出较强的酶活力,最适酶促温度50～55℃,最适pH5.0～5.5,Mg2 、Zn2 和Ca2 对该酶系有不同程度的激活作用,其中Mg2 激活效应最大,而Mn2 、Cu2 和Fe2 对该酶系有不同程度的抑制作用,其中Mn2 的抑制作用最大.     

高产L-乳酸米根霉的原生质体制备与再生条件研究

为建立原生质体融合法选育高产L-乳酸米根霉(Rhizopus oryzae)菌株,对米根霉菌株原生质体制备及再生条件进行研究。考察酶种类、酶质量浓度、时间、温度、pH值、渗透压、预处理等因素对原生质体制得量及再生率的影响,获得原生质体制备及其再生的优良条件：不添加甘氨酸,渗透压稳定剂为0.6mol/L的NaCl缓冲液,按1.5mg/mL组合酶质量浓度,蜗牛酶、纤维素酶和溶壁酶质量浓度配比为1:1:1进行混合,35℃、pH6、酶解2h,可获得原生质体制得量最大为2.74×106个/mL,再生率最高为6.8%。     

耐氨米根霉菌株ST50-2产L-乳酸发酵条件研究

为研究耐氨米根霉菌株ST50-2产L-乳酸的发酵特性,采用氨水中和剂,进行7L反应器发酵实验。与ST50-2的出发菌株AS3.819相比,发酵周期由原来的72h缩短为56h,L-乳酸产量提高12.30%,乙醇含量降低22.22%,乳酸脱氢酶(LDH)比活力提高83.09%,乙醇脱氢酶(ADH)比活力降低16.06%,对还原糖的利用速率及生物量的积累均高于出发菌株。7L反应器发酵实验表明：CaCO3影响菌体的成球;搅拌转速、氨水体积分数影响菌体的生长、成球大小及L-乳酸产量;pH值影响L-乳酸产量及发酵周期。其优化结果为：在搅拌转速400r/min,中和剂氨水体积分数为15%,pH值控制在6.0时,ST50-2菌球直径为1.0～1.5mm,发酵周期为56h,L-乳酸产量达93.32g/L。     

Rhizopus oryzae产酸性蛋白酶条件及其酶学性质研究

本文以少孢根霉(Rhizopus oligosporus)为对照研究了豆豉中的一个分离菌株米根霉(Rhizopus oryzae)产生酸性蛋白酶的条件及所产蛋白酶的性质,结果表明这个菌株的产酶条件和蛋白酶的性质与少孢根霉相比有相似性但也存在一些差异:米根霉在水分含量57%~59%、pH2.5~3.0的酸性介质中、28~31℃下培养36h时产酸性蛋白酶能力最强,所分泌的蛋白酶系在pH4.0和pH6.0附近有最强的催化活性,在pH3.0~6.0的范围内有较好的稳定性,催化反应的最适作用温度为50℃,它的温度稳定性很差,在50℃保温30min已完全失活;少孢根霉在水分含量52%~55%、pH2.5~3.0的酸性介质中、31℃下培养48h时产酸性蛋白酶能力最强,在35℃条件下培养36h也能产生较高的酶活力,少孢根霉分泌的蛋白酶系在pH3.0和pH6.0附近有最强的催化活性,在pH4.0～6.0范围内很稳定,催化反应的最适作用温度可达55～60℃,但它的温度稳定性较差,在50℃保温30min,酶活力损失达到90%,保温120min酶几乎完全失活。     

米根霉AS 3.819基因启动子片段的克隆及功能鉴定

从L-乳酸生产菌米根霉（Rhizopus oryzae）菌株AS 3.819基因组DNA中分别扩增得到了乳酸脱氢酶基因（ldhA）、丙酮酸脱氢酶基因（pdcA）、淀粉糖化酶基因（amyA）以及磷酸甘油酸酯激酶基因（pgk1）的启动子片段,并构建启动子探针载体pUKMR,以β-内酰胺酶基因（bla）为报告基因在大肠杆菌JM109中对这些启动子片段进行筛选及启动活性检测。结果表明：4 种启动子片段成功启动报告基因表达;在非底物诱导情况下,ldhA和pgk1启动子启动活性较强;在有合适碳源底物诱导情况下pdcA和amyA启动子拥有更高的启动活性;ldhA基因的启动子启动活性随着启动子片段长度的增加有一定提高,而在长度为500 bp以上时,其启动活性变化不明显。本研究为Rhizopus oryzae提供了一种快速简便的启动子捕获分离及启动活性检测方法。     

对米根霉在不同条件下产酸情况的研究

乳酸是目前世界上公认的3大有机酸之一,其广泛应用于食品、医药、化工、制革、纺织、环保和农业等诸多领域。用微生物发酵法生产L-乳酸可以达到较高的纯度要求。根霉属中的米根霉(Rhizopus oryzae)是目前发酵生产L-乳酸的重要菌株,本课题研究的是从自然界选取的米根霉在不同条件下的产酸情况。采用分析方法包括还原糖的测定,pH测定,NaOH滴定确定乳酸产量。通过对不同条件下产酸情况的分析,可以优化产酸条件,提高产酸率。最终确定出在葡萄糖浓度为130g/L,氯化铵作为氮源,其浓度在2.0g/L的条件下,实验室菌株的最佳产酸量是44.2g/L,葡萄糖的转化率是40.1%。     

米根霉原生质体电融合条件研究

以米根霉突变株mut-A、mut-B为亲本,采用双亲灭活标记筛选融合子,对亲本灭活条件、原生质体电融合条件进行了研究。实验结果表明,0.6mol/L山梨醇溶液为最适的渗透压缓冲液,mut-A、mut-B的灭活条件分别为50℃加热6min及紫外照射180s。原生质体在电场中排队所需的细胞浓度为1×107/mL,交变电场电压为8V;最佳的电融合参数为直流脉冲电压260V,脉冲持续时间40μs,脉冲次数2次;最高融合率可达7.29±0.71%。     

Lipase production by Rhizopus oryzae growing on different carbon and nitrogen sources

Nitrogen and carbon sources influencing the growth and production of lipase by Rhizopus oryzae were studied. High yields of enzyme activity were obtained when proteose peptone was the nitrogen source in media with olive oil (MWO) and without olive oil (MWHO). Carbon sources increased lipase activity in MWHO but decreased it slightly in the presence of oil. Lipase activity was significantly (P < 0.5) higher in MWO than in MWHO. Biomass concentration was also higher in the presence of oil. Industrial by-products bran and whey have been used as efficient media for the production of lipase by R oryzae. © 1999 Society of Chemical Industry