北京优质杂交玉米种子内生细菌种类多样性

通过传统微生物培养方法研究北京市自主培育并具有遗传相关性的优质杂交玉米种子内生细菌种类的多样性。实验表明来自共同父本京2416的杂交玉米京华8号、京农科728、京单68和NK718种子的内生细菌分别有10,14,13和18个OTUs;Microbacterium maritypicum DSM 12512T(AJ853910)是京农科728种子的第一优势种,是京单68种子的第二优势种,也是NK718种子的并列第三优势种;Microbacterium saperdae IFO 15038T(AB004719)是京农科728和京单68的并列第三优势种。来自共同父本京92的杂交玉米京科968和京科665种子的内生细菌分别有14和7个OTUs;京科968种子的第二优势种Bacillus horneckiae DSM 23495T(FR749913)也是京科665的第一优势种。结果表明玉米种子基因型对其内生细菌的种类多样性具有一定的影响,来自共同父本的杂交玉米内生菌在OTU数目上相近,并且具有相同的优势菌种;不同父本的玉米种子内生菌OTU数目不同,且内生菌群落结构也有所差异。这是首次以具有遗传相关性的北京优质玉米杂交种子为实验材料研究玉米种子内生细菌种类多样性与其基因型的关系。     

超级杂交水稻种子内生细菌群落结构及其多样性

通过采用构建16S r DNA克隆文库的非培养方法,对超级杂交水稻品种深两优5814及Y两优900种子内生细菌群落结构多样性进行研究。实验表明,深两优5814种子内生细菌含13个OUT,第一优势菌属为Pantoea,丰度为89.44%,第二优势菌和第三优势菌分别为Flavobacterium及Methylobacterium;Y两优900种子内生细菌含13个OUT,第一优势菌属为Pantoea,丰度为76.11%,第二优势菌和第三优势菌分别为Pseudomonas及Xanthomonas。由研究可见,泛菌属细菌为水稻种子中的优势菌群,同时,水稻种子基因型对其内生细菌的丰度及多样性具有一定的影响。     

3个杂交水稻亲本成熟期种子内生细菌多样性研究

通过传统微生物培养方法,对成熟期的杂交水稻亲本深08S、和620S及16A007种子内生细菌群落结构多样性进行分析。实验表明,处于成熟期的杂交水稻亲本种子内生细菌群落结构具有多样性。深08S种子内生细菌含40个分类操作单元(operational taxonomic units,OTU),分属Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria及Bacteroidetes类群,其中,第一优势菌属为Rhizobium,丰度为15.83%,第二优势菌属为Bacillus,第三优势菌属为Sphingomonas和Curtobacterium。和620S种子内生细菌含20个OTU,分属Firmicutes、Proteobacteria及Actinobacteria类群,其中,第一优势菌属为Curtobacterium,丰度为25.33%,第二和第三优势菌属分别为Microbacterium和Pantoea。16A007种子内生细菌含24个OTU,分属Firmicutes、Proteobacteria及Actinobacteria类群,其中,第一优势菌属为Pantoea,丰度为35.00%,第二优势菌属和第三优势菌属分别为Micrococcus和Pseudomonas。相比处于灌浆期的水稻种子内生细菌,成熟期的水稻种子内生细菌更丰富,种类更多。由研究可见,种子内生细菌的种类随种子成熟度而变化,成熟期的水稻种子具有丰富的内生菌资源,可为开发新的植物益生菌剂奠定基础,且水稻种子内生细菌的组成与水稻品种有一定的关系。     

应用Illumina MiSeq高通量测序技术分析玉米内生细菌多样性

为了调查玉米内生细菌种类多样性。应用高通量测序技术测定玉米内生细菌的16S rDNA-V4变异区序列,应用Qiime和Mothur等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元(OTUs)数量,分析物种的丰度、分布和Alpha多样性,以及物种丰富度的差异。本研究获得用于分析的有效序列和OTU数为96334/156;稀疏曲线表明测序深度充分,OTU的数量接近于饱和。玉米(样品名YM)的Chao1指数为156.0,Shanno多样性指数为1.211。玉米内生细菌分布于以下6个属:鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas,37.78%)、盐单胞菌属(Halomonas,33.33%)、假单胞菌属(Pseudomonas,13.33%)、希瓦氏菌属(Shewanella,6.67%)、甲基杆菌属(Methylobacterium,4.44%)、土地杆菌属(Pedobacter,4.44%);玉米内生细菌优势菌属为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas,37.78%)、盐单胞菌属(Halomonas,33.33%)。Illumina Mi Seq高通量测序技术为植物内生细菌的研究提供了更加准确、科学的数据资源。     

吉烟9号内生细菌的分离及多样性分析

为了解烤烟内生细菌的多样性,以吉烟9号为供试材料,分别从汪清、和龙、延吉烤烟的根、茎、叶分离得到内生细菌24株、18株、16株,依据菌落表型特征及16S rRNA序列同源性对分离的内生菌进行初步鉴定和多样性分析,结果表明,主要为变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）,其中的芽孢杆菌属（Bacillus）是3地共同的优势菌属。Neighbor-joining聚类分析表明,3个取样地烤烟内生细菌分别划分为13、9、11个类群。通过数值分类比较9个表型特征,结果表明,汪清、和龙在7.2水平聚为5个表观群,延吉在6.3水平聚为3个表观群。为吉烟9号内生菌的进一步应用提供了一定的理论基础。     

西沙野生诺尼叶片内生菌的分离与初步鉴定

主要研究西沙群岛野生诺尼叶片中可培养内生菌的多样性。利用常规平板分离方法进行菌株分离。通过测定真菌核糖体基因翻译间隔序列(ITS序列)和细菌16S r DNA基因序列,结合系统发育研究对所分离菌株进行鉴定分析。共分离到32株内生菌,分为19种。其中2种霉菌,共2株,分别属于炭层菌属(Nemania sp.)和毛壳菌属(Chaetomium sp.);细菌17种,共30株,分别属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)、土地芽孢杆菌属(Terribacillus sp.)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)等7个已知属,其中芽孢杆菌属(Bacillus sp.)为绝对优势属,共20株,11种。     

库车小白杏内生细菌多样性及其产酶特性

分析采后库车小白杏果实内生细菌多样性,挖掘潜在的微生物资源及功能。利用高通量测序法对采后库车小白杏内生细菌结构组成进行分析,同时,采用传统分离培养法对内生细菌进行分离筛选,并对所获得的菌株进行16S rRNA基因序列分子鉴定,进而对相关菌株的产酶特性进行分析。高通量测序结果显示,采后库车小白杏内生细菌共包括406个操作分类单元,涉及9个门,94个属。其中,拟杆菌属(Bacteroidetes)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和未分类菌群等物种多样性最为丰富。通过分离筛选共获得99株菌,分别归属于放线菌门(Actinobacteria)、变形杆菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)4个菌门的28个属。同时,获得7个未在高通量测序结果中检出的属类群,发现潜在新种5个。实验获得了一批蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶产生菌。本研究的开展为深度挖掘库车小白杏果实中的潜在微生物资源及相关酶制剂的筛选和研制提供丰富的材料,同时,也为从微生物角度揭示小白杏腐败变质等研究提供新思路...     

西沙野生诺尼种子内生真菌的群落多样性

采用种子表面灭菌、菌种分离与纯化、ITS rDNA和26S rDNA D1/D2区序列测定和系统发育分析方法,对西沙野生诺尼种子内生真菌群落多样性进行了初步研究。从诺尼种子中共分离到内生真菌48株,其中酵母菌39株,霉菌9株;39株酵母菌分属于4个属内的5个种,其中榛针孢酵母(Eremothecium coryli)、Pseudozyma aphidis和浅黄隐球酵母(Cryptococcus flavescens)为优势种,分别占总菌株数的31.25%、27.08%和16.67%;9株霉菌分属于4个属内的4个种,其中Phaeoacremonium sp.和赤霉属(Gibberella sp.)是霉菌中相对优势的种,分别占总菌株数的8.33%和6.25%。研究结果表明,西沙野生诺尼种子中存在大量内生真菌,且种类丰富,其中酵母菌占绝对优势,部分优势种具有潜在的药用价值。     

烟草内生细菌分离方法的优化研究

用研磨组织稀释分离法与表面消毒有效性评价相结合的方法确定了适宜烟草组织的表面消毒方法以及内生细菌分离培养基。采用1%次氯酸钠浸泡5分钟,再用75%酒精浸泡2分钟能够100%去除表面附生菌,并且分离得到更多的内生细菌。研究比较了TSA、NA、PDA、LB 四种常用的细菌分离培养基在分离烟草内生细菌中的差异,其中TSA和NA培养基分离得到的内生细菌数量较高,TSA培养基从烟草根、茎、叶中分离出的内生细菌数量分别为5.18 log cfu/g.fw、2.17 log cfu/g.fw、4.69 log cfu/g.fw;NA培养基分别为5.01 log cfu/g.fw、1.81 log cfu/g.fw、4.93 log cfu/g.fw。对分离得到的127株内生细菌进行16S rDNA序列测定表明,TSA和NA培养基分离得到的内生细菌种类最多,其中TSA培养基分别从根、茎、叶中分离到9、7、13种内生细菌;其次是NA培养基,分别从根、茎、叶中分离到8、6、10种内生细菌。结果表明,采用TSA和NA培养基分离烟草内生细菌,可以达到较为理想的分离效果。      

桃杏果实内生细菌多样性分析及软腐病原菌的分离与验证

为了解桃和杏采后果实内生细菌群落组成,并对潜在病原细菌进行筛选与验证,为其贮藏保鲜、软腐病害防治等相关研究奠定基础,利用高通量测序技术,对新疆地产油桃和库车小白杏采后果实内生细菌群落组成进行分析;同时,利用微生物传统分离培养,采用16S rDNA序列分析对潜在病原细菌进行分子鉴定,并利用离体接种法和再分离法,对相关菌株的致病能力进行验证。研究结果表明,油桃和库车小白杏内生细菌共包括128个操作分类单元,涉及9个门117个属,其中变形杆菌门(Proteobacteria)为绝对优势菌门,其次为厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes);在属水平上,油桃以泛菌属(Pantoea)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拟杆菌属(Bacteroides)等菌属为优势菌群;库车小白杏以葡糖杆菌属(Gluconobacter)、泛菌属(Pantoea)、克里斯滕森菌(Christensenella)、普氏菌属(Prevotella)等菌属为优势菌群。通过分离筛选获得了1株潜在采后致腐病原细菌XAAS-P1,经分子鉴定初步确定其归属于泛菌属(Pantoea)。XAAS-P1对采后油桃和库车小白杏均具有较强的致腐能力,并呈现出与自然软腐一致的病状。接种4 d后,XAAS-P1致腐率可达100%,与阴性对照组相比,接种组样品的软腐现象提前了1 d。对接种组病灶中的微生物进行再分离、鉴定,结果显示,菌株XAAS-P1是病灶组织中的绝对优势菌群,证明了菌株XAAS-P1是导致采后油桃和库车小白杏软腐变质的主要病原细菌。研究表明,桃和杏果实中存在丰富多样的内生细菌,其内生泛菌XAAS-P1可导致采后油桃和库车小白杏的软腐变质。     

4种海南诺丽果内生细菌多样性及其关键生物活性研究

诺丽果富含生物活性成分,具有较强抑菌性和抗氧化能力。为探讨海南诺丽果中内生菌多样性的区别及其关键活性与多样性之间的联系,通过高通量测序技术(HTS),从4种诺丽果(长果标号为L、圆果标号为R、连体果标号为C、大溪地诺丽果标号为T)中发现了它们共同的优势菌属为短波单胞菌属(Brevundimonas)、泛菌属(Pantoea)和芽孢杆菌属(Bacillus),并测定内生细菌抑菌性,对具有抑菌活性的内生细菌进行总抗氧化性测定,发现具有抑菌性的诺丽果内生细菌均具有抗氧化性,抗氧化值在3.07～20.78U·mL-1,同时内生细菌的抗氧化性和抑菌活性呈正相关性。挑选4个品种诺丽果中2种关键活性较高的内生菌8株,进行16S rDNA和gyrA分子生物学鉴定,鉴定结果均为芽孢杆菌属(Bacillus),并分别属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、摩加夫芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。研究结果从微生物学角度比较了不同品种诺丽果内生细菌群落多样性差异,并探讨了内生细菌功能性之间以及与内生群落之间的关联,证实了植物-微生物相互作用学说。希望研究可为今后研究内生菌和宿主功能的协调性和统一性提供帮助,为具有特定功能的诺丽果内生菌的筛选应用提供理论基础,为内生菌在食品工业中的应用及植物与微生物互作研究提供更多思路。     

百香果籽内生细菌的分离鉴定及生长条件的研究

百香果籽提取物具有多种生物学活性,其活性物质可能来源于内生菌的代谢产物,该文对柳州百香果果籽中的内生细菌进行分离和鉴定。以新鲜的百香果为原料,用平板计数琼脂(plate count agar,PCA)培养基分离纯化果籽中的内生细菌,然后对其进行分子生物学鉴定,最后测定其最适生长温度、最适pH值、生长曲线等生物学特征;结果显示利用PCA培养基从百香果果籽中分离到的内生细菌菌落均呈白色;经革兰氏染色,均为革兰氏阳性球菌,直径在1.3μm^1.9μm之间;随机挑选3株菌进行分子生物学鉴,均属于不动杆菌属;测定其生长条件,均在LB培养基中生长较好;最适生长pH值均为7.0;最适生长温度均为25℃,而在15℃以下和40℃以上时其生长收到较强的抑制;用LB培养基测定其生长曲线,菌株在接种后的6 h^16 h处于对数期。通过对百香果果籽中内生菌的分离鉴定,发现柳州百香果果籽中存在不动杆菌属细菌。     

烟草种子内生真菌群落结构和多样性分析

种子内生菌对种子的生长发育具有重要作用。为深入了解烟草种子内生真菌群落结构与多样性,以ITS区的rDNA为靶标序列,采用Illumina MiSeq测序技术对K326、云烟85和云烟87烟草种子内生真菌群落结构组成和多样性进行测定分析。结果表明,3个品种烟草种子共获得342 264条序列,聚类到110个分类操作单元（OTU）,分别属于5个门、13个纲、24个目、34个科、56个属。品种K326和云烟85种子内生真菌群落结构相似,多样性均高于云烟87。其中赤霉菌属Gibberella、小画线壳属Monographella、链格孢菌属Alternaria、镰刀菌属Fusarium、红酵母菌属Rhodotorula、炭疽菌属Colletotrichum、隐球菌属Cryptococcus和曲霉菌属Aspergillus等在烟草种子中丰度较高。FUNGuild功能预测结果显示,烟草种子内生真菌包括以下功能菌群：植物病原菌、动物病原菌、内生菌、木材腐生菌、地衣寄生菌、土壤腐生菌、木材腐生菌等。烟草种子有丰富的内生真菌定殖,其中潜在的有益功能菌群包括镰刀菌、炭疽菌、隐球酵母菌、赤霉菌、曲霉菌等。     

库车小白杏仁内生细菌的筛选及其功能特性初探

为探究库车小白杏仁内生细菌群落多样性,挖掘其中潜在的功能微生物资源,利用Biolog-ECO微平板技术结合传统分离培养法,对库车小白杏仁内生细菌群落碳源的利用类型进行分析,并对其内生细菌进行筛选与鉴定。同时确定所得菌株的产酶特性和拮抗作用。结果显示,库车小白杏仁内生细菌群落主要利用的碳源类型为碳水化合物类和氨基酸类,约占总体的77%。其中,D-半乳糖醛酸、D-甘露醇和N-乙酰-D-葡萄糖胺为主要的碳水化合物类型;L-天门冬酰胺为主要的氨基酸类型。试验获得的47株内生细菌,分别归属于变形杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门4个门的13个属,发现潜在新种1个。多数菌株可产蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、果胶酶,以及具有良好的拮抗作用。上述研究表明,库车小白杏仁内生细菌群落存在丰富的生物多样性,为进一步开发和利用相关菌株的功能特性提供试验依据。     

拮抗砀山梨炭疽菌的内生菌筛选及抑菌效果分析

从健康砀山梨中分离出15 株内生菌,筛选出1 株对砀山梨胶孢炭疽菌抑菌活性较高的菌株,命名为DSL-9,初步鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。DSL-9菌株对炭疽菌的抑制主要是通过胞外分泌物作用的结果。采用硫酸铵沉淀法获得DSL-9的粗蛋白提取液,蛋白提取液在30～60?℃抑菌率无明显变化,大于60?℃抑菌率下降;在pH?7～10区间抑菌活性较高,且无明显变化;紫外线对抑菌物质无明显影响;蛋白提取液经蛋白酶处理后,抑菌活性下降。研究内生菌DSL-9对感染炭疽菌砀山梨防御酶活性的影响,发现内生菌DSL-9可提高砀山梨果实对病菌的抗性。从砀山梨中分离筛选的枯草芽孢杆菌DSL-9?对砀山梨炭疽病害的生物防治具有潜在的应用价值。     

库车小白杏采后内生细菌群落代谢特征及结构组成的变化

为分析小白杏采后内生细菌群落的碳源代谢特征和结构组成的变化,实验利用Biolog生态板法及高通量测序法,对其内生细菌群落进行相关分析。结果表明,完熟库车小白杏采后内生细菌群落代谢活性明显高于青熟小白杏,两者主要碳源类型利用存在明显差异。随着采后成熟度的增加,利用氨基酸类、羧酸类、多聚物类内生细菌群落比例明显升高。高通量测序表明,库车小白杏采后内生细菌共包括47?个操作分类单元,涉及15?个目,33?个属,两者内生细菌群落结构差异明显;黄杆菌目（Flavobacteriales）、拟杆菌目（Bacteroidales）、梭菌目（Clostridiales）占青熟小白杏内生细菌群落的83%;完熟小白杏内生细菌群落的主要组成为红螺菌目（Rhodospirillales）、肠杆菌目（Enterobacteriales）、梭菌目,总计占总体的86%。且随着成熟度的增加,黄杆菌目、拟杆菌目所占比例逐渐下降,而红螺菌目、肠杆菌目所占比例逐渐上升,但梭菌目未见明显差异。同时,研究发现小白杏内生细菌中存在水果软腐病和人体肠胃条件致病等相关菌群,为进一步阐明库车小白杏采后腐败变质内在机理,开发相关的贮存、保鲜方法及其科学合理食用等提供一定研究基础。     

新疆圆柏叶内生菌的分离及其抑菌特性研究

对新疆圆柏叶内生菌进行分离,确定分离条件,分离纯化得到7 株菌株,采用打孔法对这7 株菌的发酵液进行抑菌实验。结果表明：其中两株菌的发酵液对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌呈现较强的抑菌活性。通过形态学观察和革兰氏染色,确定1 号菌株为革兰氏阳性球菌,2 号菌株为革兰氏阴性球菌,均无荚膜,无芽孢,不产酸,不产气,淀粉水解为阴性。