PEG-CaCl2介导苏云金杆菌CryIA(b)基因转化哈茨木霉

为构建兼具杀虫防病双重功效的工程菌株,通过PEG-CaCl2介导的原生质体法将来自苏云金芽孢杆菌的Cry Ⅰ A(b)基因导入生防真菌哈茨木霉中.转化频率约为2～3个转化子/μg质粒DNA.Southern blot和RT-PCR检测结果表明,CryⅠ A(b)基因已经整合到哈茨木霉基因组DNA中,并且在转录水平上得到了表达.各转化子都能够稳定遗传.对转化子的抑菌活性和杀虫活性检测结果表明,转化子不但保持了野生菌株的抑菌活性,而且表现出了一定的杀虫效果.转化子Tp1和Tp2对玉米螟幼虫的矫正死亡率分别为75.00%和72.73%.杀虫防病哈茨木霉工程菌株的构建为研究和开发新型微生物农药探索了新的途径.     

PEG-CaCl2介导苏云金杆菌QyIA（b）基因转化哈茨木霉

为构建兼具杀虫防病双重功效的工程菌株，通过PEG-CaCl2介导的原生质体法将来自苏云金芽孢杆菌的CryIA（b）基因导入生防真菌哈茨木霉中．转化频率约为2～3个转化子／雌质粒DNA.Southern blot和RT-PCR检测结果表明，CryIA（b）基因已经整合到哈茨木霉基因组DNA中，并且在转录水平上得到了表达．各转化子都能够稳定遗传．对转化子的抑菌活性和杀虫活性检测结果表明，转化子不但保持了野生菌株的抑菌活性，而且表现出了一定的杀虫效果．转化子Tp1和Tp2对玉米螟幼虫的矫正死亡率分别为75．00％和72．75％．杀虫防病哈茨木霉工程菌株的构建为研究和开发新型微生物农药探索了新的诛径．     

哈茨木霉Chiv基因的原核表达及优化

通过筛选哈茨木霉的DNA文库,克隆到Chiv基因的cDNA全长序列.以连接有哈茨木霉Chiv基因的质粒pBK902为模板,设计含有EcoRI和XhoI酶切位点引物,采用PCR方法扩增得到具有完整开放阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上并转化大肠杆菌BL21菌株中,成功地获得了大量的阳性转化子.质粒通过EcoRI和XhoI酶切鉴定及测序鉴定,证明Chiv基因成功地转化到大肠杆菌中.重组大肠杆菌经IPTG诱导表达及SDS-PAGE检测后,发现特异的蛋白表达条带,其分子量为50 kDa左右.通过对诱导剂量与诱导时间等因素的优化,结果显示几丁质酶的最佳诱导时间为13 h,最佳诱导剂浓度为1 mM,为几丁质酶的工业化生产奠定基础.     

哈茨木霉Cu-ZnSOD的克隆表达及活性鉴定

为研究哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的生物防治机制并获得与生物防治相关基因,通过构建哈茨木霉菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了哈茨木霉超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)基因的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为465 bp,编码154个氨基酸,理论分子量为15.7 ku.将该基因构建到表达载体pET28上,转化到大肠杆菌BL21菌株中,通过诱导表达条件的优化后,经裂解菌体取上清进行酶活鉴定,确定在蛋白水平上得到了表达.蛋白质表达的最佳条件为:IPTG浓度为0.125 mmol/L,OD600为0.600,培养温度37℃,诱导时间为4 h.目的蛋白SOD的粗酶活为26.69 U/mL.该研究结果为进一步研究哈茨木霉的抗逆境胁迫分子生物学机制奠定基础.     

对哈茨木霉转化子菌体形态观察及抗药性测定

为深入了解木霉转化子的抗药性，对哈茨木霉及其转化子在PDA培养基上进行平板点植培养和小室培养，其菌体形态于40倍显镜镜下观察，结果显示，转化子的菌落形、菌丝形状、菌丝横隔间隔、孢子颜色、产孢数量均发生一定变化。对传代3年转化子抗药性的测定结果表明，哈茨木霉野生菌在多菌灵质量浓度度为1.0μg/mL时不能生长，而其转化子在多菌灵质量浓度高达1000.0μg/mL时仍能正常生长，说明此转化仍具抗药性且抗药性稳定。     

哈茨木霉UBc基因的克隆及表达

筛选哈茨木霉的cDNA文库,克隆到泛素结合酶基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,该序列的长度为951 bp,包含一个455 bp的完整开放阅读框,编码157个氨基酸,其理论分子量为17.64ku.在氨基酸水平上,具有较高的保守性.以克隆载体pBK5313为模板,设计含有XhoI和BamH I酶切位点的引物,成功地获得包含完整阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上,构建出含有泛素结合酶基因的重组子pET28-UBc,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,成功地获得了大量的大肠杆菌转化子.通过对大肠杆菌转化子菌落PCR检验、质粒双酶切鉴定及测序分析,证实了成功转化.通过IPTG诱导,优化了泛素结合酶原核表达的条件,最佳诱导时间为4 h,诱导剂浓度对蛋白表达量影响不大.本研究为进一步研究哈茨木霉的生物防治作用机制,诠释蛋白质代谢途径提供基本技术支持.     

哈茨木霉丝/苏氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆表达

为深入研究丝/苏氨酸蛋白磷酸酶的功能,从哈茨木霉cDNA文库中克隆丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2A)基因,并成功构建到原核表达载体pET28a,在大肠杆菌中表达.表达产物经SDS-PAGE电泳分析,在40.5kDa处出现特异性条带.在22℃以0.5mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白大部分以可溶形式存在,在37℃以1.0mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白则大部分以包涵体存在.全长cDNA序列为1286bp,5′非编码区91bp、3′非编码区237bp,编码327个氨基酸,没有信号肽.本研究为PP2A基因的功能验证奠定基础,以便进一步研究蛋白磷酸酶的功能,从而获得更多关于哈茨木霉蛋白磷酸酶作用机制的信息.     

哈茨木霉几丁质酶基因的cDNA克隆及表达

为了研究全新几丁质酶基因Chit37(DQ647957)的特性与功能,将该基因在大肠杆菌中进行了外源表达.通过构建哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了基因Chit37的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为1032bp,编码343个氨基酸,理论分子量为36.6kDa.采用PCR扩增的方法克隆该基因并将其构建到原核表达载体pET28(a+)上,构建了原核表达载体pET-Chit37并转化宿主菌BL21(DE3),菌落PCR及酶切鉴定均证实转化子的正确性,重组蛋白经IPTG诱导后获得表达.优化的表达条件为终浓度0.1mM IPTG诱导培养4h.     

哈茨木霉cDNA文库构建及表达序列标签分析

为了从分子水平上研究哈茨木霉的生物防治作用机制,构建了哈茨木霉菌丝体时期的cDNA文库并随机挑选部分克隆进行了测序分析.所构建的文库滴度为1.2×106pfu/m l,重组率为93%,插入片断平均长度>1.2 kb.对随机挑选的305条ESTs测序分析,其中67条EST为已知基因,58条为已知EST,其余的180条为新EST.在已知基因中,有9条ESTs与生物防治相关.从对文库的初步检验结果看,文库具有良好的质量,符合大规模测序的标准.通过ESTs研究是获得功能基因的有效手段.     

球孢白僵菌几丁质酶基因chitl真核表达

采用PCR方法从球孢白僵菌的DNA中克隆出几丁质酶基因chitl,并将该序列构建到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)诱导型表达载体pYES2上,转化到酿酒酵母H158菌株中,通过Northern检验确定该基因在酿酒酵母中成功表达.经过酶活检测该转化子在培养48 h达到酶活高峰,达0.47 U/mL.     

绿色木霉内切葡聚糖酶基因Ⅰ的克隆表达

为深入研究绿色木霉(Trichoderma viride)内切葡聚糖酶(EGⅠ)的特性与功能,利用Northern blot方法分析不同碳源条件下绿色木霉的egⅠ表达,采用RT-PCR方法从绿色木霉T4中克隆egⅠ基因的cD-NA序列,测序与生物信息学分析,并构建诱导型表达载体pYES2-egⅠ,转化酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSc1和H158中表达.结果表明:绿色木霉在含有纤维素的液体培养基中生长,egⅠ高效表达,在秸秆中表达量最高.纤维二糖中表达量相对较低,在葡萄糖、果糖中没有表达.egⅠ基因编码框长度1 377bp,编码459个氨基酸.含有信号肽,为分泌蛋白,属于糖苷水解酶家族7,具有纤维素酶结合域(CBD)和催化域(CD).INVSc1转化子发酵培养48 h达到转录高峰期,60 h达到酶活高峰期,酶活为0.081 6 U/mL,酶活比H158转化子提高32.5%.     

球孢白僵菌几丁质酶基因chit1真核表达

采用PCR方法从球孢白僵菌的DNA中克隆出几丁质酶基因chit1,并将该序列构建到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)诱导型表达载体pYES2上,转化到酿酒酵母H158菌株中,通过Northern检验确定该基因在酿酒酵母中成功表达.经过酶活检测该转化子在培养48 h达到酶活高峰,达0.47 U/mL.     

纤维素酶E5基因在E．coli中的克隆与表达

将含纤维素酶E5基因的质粒pD541用Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后,经电泳分离获取含E5基因的小片段,将该片段定向插入表达质粒pSE420的多克隆位点上,进一步将重组DNA转人大肠杆菌宿主．采用刚果红染色法检测出选择性平板上的转化子具有羧甲基纤维素酶(CMCase)活性．摇瓶产酶试验进一步表明,基因重组后的大肠杆菌能高效表达E5基因并将产物分泌出胞外,培养液中可检测到的CM-Case活力达31．6U／mL．该研究结果为进一步构建高效纤维素分解菌株打下了良好的基础,具有重要的学术意义和实际应用价值．     

海参溶菌酶C端多肽在毕赤酵母中的重组表达

为构建并筛选具有抑菌活性的重组海参溶菌酶C端(SjLys-C)多肽的毕赤酵母基因工程菌,根据已构建的pMD18-T-SjLys-C质粒为模板,设计特异性引物,扩增出带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的海参溶菌酶C端多肽基因,将其亚克隆到真核表达载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9K-SjLys-C。该重组质粒经BglⅡ线性化后,采用电转化方式将线性DNA转化至毕赤酵母GS115中,经含不同浓度抗生素G418的YPD培养基筛选鉴定转化子,再经1%甲醇诱导表达,共筛选出4株高拷贝重组海参溶菌C端多肽基因工程菌。结果表明,该酵母基因工程菌经甲醇诱导72h,其目的蛋白表达量最高,并对革兰阳性菌和阴性菌均具有抑菌活性,尤其对通常引起水产动物严重病害的病原菌副溶血弧菌和铜绿假单胞菌具有明显的抗菌效果。     

纤维素酶E_5基因在E.coli中的克隆与表达

将含纤维素酶 E5基因的质粒 p D5 4 1用 Nco I和 Eco R I双酶切后 ,经电泳分离获取含 E5基因的小片段 ,将该片段定向插入表达质粒 p SE4 2 0的多克隆位点上 ,进一步将重组 DNA转入大肠杆菌宿主 .采用刚果红染色法检测出选择性平板上的转化子具有羧甲基纤维素酶 (CMCase)活性 .摇瓶产酶试验进一步表明 ,基因重组后的大肠杆菌能高效表达 E5基因并将产物分泌出胞外 ,培养液中可检测到的CMCase活力达 31.6 U/ m L .该研究结果为进一步构建高效纤维素分解菌株打下了良好的基础 ,具有重要的学术意义和实际应用价值 .     

赤霉菌原生质体外源基因高效转化方法研究

赤霉素(gibberellic acid,GA)是一种非常重要的植物生长调节剂,具有促进植物种子萌发和生长等功效.生产上用的赤霉素主要通过水稻赤霉病菌藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)工业发酵而来.赤霉菌工业生产菌株不产生孢子,不易进行以孢子为受体的外源基因转化.本研究建立了工业赤霉菌原生质体制备以及以原生质体为受体、利用电击高效转化外源基因的方法.结果发现崩溃酶(Dryslase)和溶壁酶(Lysing enzyme)以3:7的质量比混合时对赤霉菌原生质体的制备效果最好.电压为0.8～1.0kV的范围内原生质体的转化率最高,1μg DNA可以得到18个转化子.提供的方法不仅可以用于藤仓赤霉工业菌株的遗传改良,还可以用于水稻赤霉病菌分子生物学研究.     

桂林猫儿山地区Bt菌株的筛选及其抑菌成分的热稳定性

通过对桂林猫儿山原生态地区采集的166份土样样品进行筛选,分离到含有新的杀虫晶体蛋白基因、所产抑菌物质热稳定性好的苏云金芽胞杆菌菌株。采用温度筛选法对土样进行初筛和复筛,结合SDS-PAGE分析和牛津杯法抑菌试验来挑选目的菌株。从采集的166份天然土壤样品中分离出49株苏云金芽胞杆菌,出菌率29.5%。光学显微镜观察发现有大菱形、小菱形和不规则晶体类型。用SDS-PAGE分析了其中14株野生菌株的杀虫晶体蛋白表达谱,发现14株均表达了130和65 k D的蛋白,其中有7株表达约90 k D蛋白、2株表达35 k D和6株表达30 k D的蛋白。对其中8株表达不同分子量蛋白的菌株发酵44h,取其发酵液的上清液进行抑菌活性成分热稳定性检测,发现其热稳定性相差较大,95℃水浴加热2 h处理后,除247-1外,其他几株产生的抑菌物质全部失活。菌株247-1不仅产生耐热的Zwittermicin A,可能还产生其他热敏感性的抑菌成分。     

绿色木霉DNA提取方法研究

利用CTAB法、简化CTAB法、氯化苄法和快速提取法等4种方法提取了绿色木霉DNA,并采用琼脂糖凝胶电泳和PCR对DNA进行了评价.凝胶电泳检测结果表明4种方法均可提取到绿色木霉DNA,但PCR检测结果表明只有CTAB法和简化CTAB法提取的DNA可用作CBHII基因的PCR模板.     

黑曲霉ZF-34脂肪酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

为了使黑曲霉脂肪酶基因在毕赤酵母中表达并实现高密度发酵生产,采用PCR方法从黑曲霉基因组DNA中扩增出脂肪酶基因Lip A,测序结果表明Lip A基因编码区全长894 bp,编码297个氨基酸,与其他黑曲霉脂肪酶基因列序相似性高达99%。将Lip A基因连接到质粒p PIC9K上,构建了p PIC9K-LipA重组载体。将该重组载体转化到毕赤酵母GS115中,经甲醇诱导,该酶基因在酵母细胞中获得活性表达,并能将酶蛋白分泌到胞外。重组菌株GS115/p PIC9K-LipA经100 L发酵罐发酵144 h,菌体湿重高达100. 5 g/L,发酵液中酶活性达1 950 U/m L。     

提高原油采收率的耐热产多糖基因工程菌构建

为了提高用于微生物采油的掺水不溶性多糖的JD菌的耐温性能,将嗜热质粒pET-ecoRRF和pET -tteRRF转化至菌株JD中,用卡纳霉素筛选转化子。在耐热性初步鉴定中,所构建的菌株可在45 ℃下生长;再进 行Western-blot检测确认,结果表明,RRF基因有高量的表达。RRF基因转化到JD菌中有较好的表达,提高了目 标菌株的耐热性能,耐热范围提高了5~8 ℃。由于Enterobactersp.和Escherichiacoli 的亲缘关系较近,所以将 Escherichiacoli 中的RRF基因在JD菌中表达效果比Thermusthermophilus 中的基因表达效果要好。最终将野生 JD菌改造成了一株能够在45℃耐热、产多糖的基因工程菌。