进口薯格中转基因成分的检测

目的建立了一种快速检测进出口食品中转基因成分的方法。方法本实验采用DNA提取试剂盒对薯格中的DNA进行快速提取,接着用实时荧光PCR方法对其进行转基因成分和品系的鉴定。结果通过对食品标签进行初筛,发现其标识成分中含有未标明的转基因成分。进一步对所含转基因成分的品系进行鉴定,确定薯格的外包裹玉米粉中含有多种转基因成分,包括转基因玉米TC1507、NK603、MON810、59122、MON89034等5个品系。结论本文方法可以用于加工食品中转基因玉米成分及品系的定性检测,也可以作为常规PCR定性方法的确证试验方法。     

3种动物源性成分阳性标准分子的构建与应用

为了准确、快速地进行食品中猪、牛、鸭成分的定性和定量检测,设计了这3种动物源性成分特异性的引物和探针,构建了3种检测用阳性标准分子,并分别进行了实时荧光PCR检测。这3种阳性标准分子相对检测灵敏度、特异性高,稳定性好,能够满足日常检测工作的要求。     

多重荧光定量PCR快速鉴定转基因玉米品系

采用多重实时荧光 PCR技术的高通量特征,对转基因玉米MIR604、GA21、DAS-40278-9和98140的特异性靶标序列设计TaqMan-MGB荧光探针,通过退火温度和引物探针浓度梯度优化建立了四重实时荧光PCR检测方法,经特异性,重复性和灵敏性等方法学验证确认了方法的可靠性。MIR604、GA21、DAS-40278-9、98140四个特异性基因的标准曲线回归方程分别为y=-3.263x+36.632,y=-3.422x+36.384,y=-3.294x+38.978和y=-3.278x+37.514;Ct值变化范围分别在23.556～37.524,22.893～37.412,25.304～39.110和24.501～37.618之间;标准偏差分别在0.078～0.476,0.085～0.463,0.120～0.487和0.148～0.353之间;相关系数R2分别为0.997,0.996,0.995和0.993;检出限可达10个拷贝,扩增效率满足欧盟等国际要求。该方法一管多检,操作简便,成本较低,适用于大批次样本的高效分析检测,为转基因产品合规使用和进出口食品安全监测提供方法参考。     

转基因玉米59122品系的特异性检测

使用反向聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了转基因玉米59122的外源基因与玉米基因组之间的两段侧翼序列,并据其左侧侧翼序列设计了具品系特异性的引物,运用半巢式PCR技术建立了59122的品系特异性二重PCR检测方法,扩增片段100bp,横跨pat终止子与转基因玉米侧翼基因之间。以转基因玉米59122、MON863、MON810、GA21、NK603,转基因大豆Roundup Ready和转基因油菜GT73等为材料,证明本方法与其他转基因作物具有高特异性。本方法在检测59122时,确定出连接体系中线性DNA的最佳质量浓度为1ng/μL左右,检出限达到0.1%,灵敏度为38个单倍体基因组拷贝数。因此可准确、快速、高效地检测转基因玉米及其产品,或作为常规PCR定性检测后的验证方法。     

转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立针对我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的转基因苜蓿草品系J163品系特异性实时荧光(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测方法。方法利用Taq Man实时荧光PCR(real-time PCR)技术,根据转基因苜蓿草品系J163 5’端外源插入片段P-e FMV与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计引物和探针,建立了转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法,并对本方法的特异性、灵敏度及可重复性进行了测定。结果建立的检测方法特异于转基因苜蓿草J163成分检测,检测最低DNA浓度为(1imit of detection,LOD)为15 pg,相当于9拷贝转基因苜蓿草J163基因组DNA,重复性试验显示,其标准偏差(Standard deviation,SD)和相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均在可接受范围内。结论本研究建立的转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法特异性好,灵敏度高,能够快速、准确、稳定地对转基因苜蓿草J163成分进行检测分析。     

四重实时荧光PCR快速检测转基因玉米及其加工产品

本研究运用四重实时荧光聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction,PCR）对转基因玉米及其深加工制品进行筛选检测。选定花椰菜花叶病毒35S启动子（pCaMV35S）、农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子（tNOS）以及根癌农杆菌CP4蛋白基因和5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因（EPSPS）为外源基因,选定编码玉米淀粉合成酶异构体zSTSII-2 (zSSIIb) 基因作为玉米物种的内参照基因。设计和合成靶标基因特异性引物和多重荧光探针,经特异性、重复性、灵敏性和适用性等方法学验证建立了四重实时荧光PCR检测方法。结果表明该方法检测特异性强,重复性好,扩增效率在90%~110%,标准曲线相关系数R2≥0.99,最低检测限为每20 μL反应13个拷贝,最低定量限为每20 μL反应1.3个拷贝,其检测结果与SN/T 1204-2016标准方法检测结果一致,由于四个目标基因可以在一个反应管中进行扩增反应,且含有内源基因和外源基因,可降低试剂成本,简化操作程序,缩短检测时间,为玉米及其深加工产品转基因成分的快速检测提供参考。     

转基因大豆MON89788实时荧光PCR检测方法的建立

为实现转基因大豆MON89788的标识管理,针对转基因大豆MON89788的品系特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立转基因大豆MON89788实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测。结果显示：建立的转基因大豆MON89788实时荧光PCR检测方法能扩增出127 bp的产物,特异性强,灵敏度达到0.1%,约为40 个单倍体基因组拷贝,检测重复性好,可成功应用于实际样品检测。因此,建立的转基因大豆MON89788实时荧光PCR检测方法可以应用于转基因大豆MON89788大豆及其制品的检测。     

实时荧光定量PCR技术在粮油转基因成分检测中的应用

随着转基因技术在谷物育种中的广泛应用,以及转基因粮油及其制品消费的不断增加,加强粮油转基因成分的检测技术的研究极为必要.阐述了实时荧光定量PCR技术在粮油转基因成分检测中的应用,主要从实时荧光定量PCR技术,实验室条件,实验步骤以及应用范围等方面进行了阐述.     

多重PCR-液相芯片技术检测13个品系转基因玉米

为建立多重PCR-液相芯片检测13个品系的转基因玉米的方法,针对BT11,BT176,Mon810,Mon863,T25,GA21,NK603,TC1507,Mon89034,Mir162,Mon88017,MIR604和BVLA430101这13种玉米品系的侧翼序列,设计合成了品系特异性引物/探针。在生物素标记的PCR扩增产物与固定在荧光编码微球上的品系特异探针杂交后,对微球进行流式检测。试验结果显示,13种转基因玉米的引物和探针具有较高的特异性,引物/探针相互之间无交叉扩增和非特异杂交,大部分转基因玉米品系的检测灵敏度达到0.1%水平,符合欧盟和其他国家有关转基因产品标识的要求。本方法的检测效率和准确性均高于传统方法,可作为进出口转基因产品和国内转基因检测的有效方法。     

实时荧光PCR定量检测加工产品中转基因玉米Mon810成分

采用实时荧光PCR技术，建立了定量(性)鉴定检测加工产品中转基因玉米Mon810成分的方法。实验设计的可以扩增玉米自身基因和外源基因边界序列的引物和探针具有品种和品系特异性，特异性地检测出食品、饲料等加工产品中转基因玉米Mon810成分。某些检测样品不仅检出转基因玉米Mon810成分，还同时检出其它转基因玉米品系或其它转基因品种。本研究实验建立的转基因玉米Mon810品系鉴定检测方法，即可以用于加工产品中转基因成分的定量检测(检测低限为0．1％)，也可以用于定性检测，或作为常规PCR定性检测后的确证实验方法。     

玉米及其制品中转基因成分的单一 PCR及多重PCR检测

采用CTAB法提取玉米及其制品的总DNA，用PCR方法检测其中的转基因成分如花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）35S启动子、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）胭脂碱合成酶甚因（nos）终止子、根癌农杆菌CP4菌株的EPSPS基因、吸水链霉菌（Treptomyces hygroscopicus）bar基因及苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种（Bacillus thuringiensis subsp．kurstaki）crylA（b）基因，筛选到阳性样品，并建立了几组玉米内源zein基因和转基因成分之间的多重PCR检测方法。结果表明，建立的多重PCR方法用于同时检测玉米内源基因和转基因成分是可行的，值得推广；虽然我国还未有己获准商品化生产的转基因玉米，但国外转基因玉米已流入福建省。     

酶连接探针杂交芯片特异性检测转基因水稻品系

酶连接探针杂交芯片是一种基于连接酶催化的探针杂交芯片技术,其原理是采用硫代引物保护法,利用 Lambda DNA外切酶将多重聚合酶链式反应产物切割成单链。在氨基修饰的芯片上固定5’端探针,并与制备的产物 单链进行杂交,加入荧光修饰的第2个探针与之前的探针进行酶连接反应,从而实现高特异性、高通量检测。结果 表明：酶连接探针杂交芯片技术检测4 种转基因水稻品系特异性好,灵敏度可达0.1%（m/m）,可以应用于进出口 检验检疫、食品安全监测等领域。     

转基因玉米的七重PCR鉴定方法

以玉米内源基因IVR、外源抗除草剂基因(BAR、PAT)、抗虫基因Cry1Ab、筛选基因NPTII、CaMV35S启动子和NOS终止子为检测的目的片段,分别设计了7对引物,通过研究较佳引物终浓度配比和退火温度,建立了玉米转基因成分七重PCR检测体系。结果表明,建立的七重PCR体系用于同时检测内源基因和转基因成分是可行的,检测方法效率高、稳定性好。     

实时荧光定量PCR检测转基因玉米59122的方法建立及测量不确定度评估

为了准确定量检测非故意扩散的转基因玉米59122,建立转基因玉米59122及产品的实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法,并用特异性、准确度、灵敏度以及测量不确定度等指标评价该方法。结果显示,利用该方法只能检出转基因玉米59122;16 次重复测量含量为1%的转基因玉米59122样品,平均测量值（0.9%）接近真实值（1%）,相对误差为10%,测试回收率为90%,测量不确定度为0.002;能检测到最低含量为2 拷贝的59122分子片段;除去3 次偏离平均值较大的测量值外,13 次重复测量值的变异系数为0.05。因此,实验建立的转基因玉米59122实时荧光定量PCR方法具有较高的特异性、准确度、灵敏度、精密度,较低的测量不确定度。     

实时荧光PCR定性定量检测转基因番茄“华番一号"

本实验采用了特异性的引物和探针,对转基因番茄“华番一号”进行实时荧光PCR检测。相对检测灵敏度可达到0.05%。可用于转基因番茄“华番一号”的定性和定量检测。     

荧光PCR和数字PCR法检测转基因DAS-44406-6品系大豆

目的：建立实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定性检测方法和使用数字PCR检测转基因DAS-44406-6品系大豆的定量检测方法。方法：针对转基因DAS-44406-6大豆品系,进行5’-RACE,测定该品系转基因大豆外源片段与大豆染色体重组的边界序列,并根据该边界序列设计引物和探针。使用23 种非DAS-44406-6品系转基因植物作为阴性对照测试实时荧光PCR引物和探针的特异性,以DAS-44406-6品系样品制备6 个含量梯度的样品进行检测低限实验。使用数字PCR技术进行定量检测,并确定定量检测的低限。结果：建立的转基因DAS-44406-6大豆品系的实时荧光PCR特异性检测方法品系鉴定特异性较强,实时荧光PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为100 ng/反应时,为0.01%的转基因大豆含量,约为16.6 个拷贝的DAS-44406-6基因组DNA;数字PCR检测方法的检测低限在模板DNA浓度为0.5 ng/反应、转基因大豆含量为1%时,相对标准偏差为0.7%。因此,建立的转基因DAS-44406-6大豆品系实时荧光PCR和数字PCR特异性检测方法符合转基因检测的要求。     

应用间接ELISA方法定量检测转基因抗虫玉米

应用纯化的Bt1杀虫晶体蛋白质作为标准蛋白和免疫抗原 ,通过抗体 抗原 酶标抗体反应 ,建立了间接酶联免疫吸附测定法 (ELISA) ,以快速检测转基因抗虫玉米中的Bt1表达蛋白 .用建立的ELISA法对 4种进口玉米实物样品进行了测定 ,实验结果得到了免疫印迹分析的验证 ,并与进口试剂盒方法的定量分析结果相一致     

马铃薯及其制品中转基因成分的多重PCR检测

采用CTAB法提取15个马铃薯及其制品样品中的总DNA,内源PATA基因的PCR扩增结果均为阳性,表明已提取到DNA。应用根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因(nos)终止子和大肠杆菌K12菌株新霉素磷酸转移酶Ⅱ(nptⅡ)基因的二重PCR对样品进行转基因成分检测,结果均为阴性。将马铃薯DNA和阳性质粒pBI121混合作为PCR的反应模板,建立了内源PATA基因、花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus,CaMV)35S启动子、nos终止子和nptⅡ基因之间的多重PCR检测方法。多重PCR方法具有节约试剂、节省时间等特点,在转基因产品检测上的应用值得推广。