转基因玉米的多重PCR－毛细管电泳紫外检测技术研究

建立了转基因玉米Ly038、Mon863和Mon810的品系特异性基因多重PCR产物的毛细管电泳-紫外检测方法。根据三种转基因玉米的基因序列设计多重PCR引物,优化PCR扩增体系和条件,以8.0g/L羟乙基纤维素为筛分介质,用毛细管电泳-紫外检测法同时检测出三种玉米的品系特异性基因,11.195min内即可完成检测。用Origin软件对电泳结果进行分析并得出不同范围的DNA曲线方程,样品出峰时间的相对误差在1.03%～5.02%之间。并对纯化前后的样品进行了毛细管电泳分离的对照,发现PCR产物纯化后更适于紫外检测的毛细管电泳。多重PCR具有节约模板、节省试剂和缩短检测时间的优点,毛细管相对于传统的琼脂糖凝胶电泳,具有高效、快速、灵敏且经济环保的优点,所以此方法可广泛地应用于食品安全检测和临床检验等领域中。      

玉米及其制品中转基因成分的单一 PCR及多重PCR检测

采用CTAB法提取玉米及其制品的总DNA，用PCR方法检测其中的转基因成分如花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）35S启动子、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）胭脂碱合成酶甚因（nos）终止子、根癌农杆菌CP4菌株的EPSPS基因、吸水链霉菌（Treptomyces hygroscopicus）bar基因及苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种（Bacillus thuringiensis subsp．kurstaki）crylA（b）基因，筛选到阳性样品，并建立了几组玉米内源zein基因和转基因成分之间的多重PCR检测方法。结果表明，建立的多重PCR方法用于同时检测玉米内源基因和转基因成分是可行的，值得推广；虽然我国还未有己获准商品化生产的转基因玉米，但国外转基因玉米已流入福建省。     

毛细管电泳间接紫外检测酱油中的游离氨基酸

以三羟甲基氨摹甲烷（Tris）（pH=10．50）为缓冲液，苯甲酸为背景吸收添加剂，利用毛细管电泳-间接紫外检测方法分离测定了酱油中的丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸、谷氨酸及天冬氨酸。在优化条件下，上述六种氨基酸于5min内实现了摹线分离，各物质吸光度的相对标准偏差（RSD）均小于5％。线性范围为10～1000μmol/L，检测限（S／N=3）分别为2．0、3．5、4．0、5．0、3．5、5．01μmol／L，六种氨基酸的加标回收率均在95．9％～104．2％范围内。     

四重PCR结合全自动电泳系统检测食品转基因成分

根据转基因食品中最常见的四种外源元件(CaMV35S启动子、NOS终止子、cry1Ab/cry1Ac基因、bar基因)的核苷酸序列,设计特异性检测引物,扩增产物大小分别为101、180、301、430bp,通过引物浓度、退火温度的优化,特异性、灵敏度测试,并结合微流体芯片全自动电泳技术,建立了同时检测这4个参数的四重PCR方法。结果表明,该方法可特异性地从复杂样品中检测出预期转基因成分,检测灵敏度达到0.1%。本方法特异性好,灵敏度高,适用于食品中转基因成分的快速筛查。     

多重PCR-液相芯片技术检测13个品系转基因玉米

为建立多重PCR-液相芯片检测13个品系的转基因玉米的方法,针对BT11,BT176,Mon810,Mon863,T25,GA21,NK603,TC1507,Mon89034,Mir162,Mon88017,MIR604和BVLA430101这13种玉米品系的侧翼序列,设计合成了品系特异性引物/探针。在生物素标记的PCR扩增产物与固定在荧光编码微球上的品系特异探针杂交后,对微球进行流式检测。试验结果显示,13种转基因玉米的引物和探针具有较高的特异性,引物/探针相互之间无交叉扩增和非特异杂交,大部分转基因玉米品系的检测灵敏度达到0.1%水平,符合欧盟和其他国家有关转基因产品标识的要求。本方法的检测效率和准确性均高于传统方法,可作为进出口转基因产品和国内转基因检测的有效方法。     

通用引物多重PCR新技术对番木瓜转基因成分检测的研究

为了满足能够同时对多个靶标进行检测,克服传统多重PCR的引物间排斥、重现性差等缺点的要求,建立通用引物多重PCR新方法对番木瓜中转基因成分进行高效、快速的检测。选用三种转基因番木瓜(Event 55-1、"GM-YK"和"华农一号")和非转基因番木瓜("台农2号")的新鲜叶片为研究对象,根据三种转基因番木瓜的外源基因和内标木瓜蛋白酶基因(papain)序列,设计五种特异性引物。通过比较不加入接头的特异性引物的PCR验证结果,发现复合引物(带通用接头的引物)无论在单重PCR或者多重PCR的检测中的电泳条带均更为明亮清晰。而由灵敏度的对比,可以得出通用引物多重PCR灵敏度比普通引物的灵敏度提高了1个数量级。通用引物多重PCR新技术较普通多重PCR方法检测番木瓜中转基因成分拥有更低的检测限和灵敏度,为转基因成分的快速检测提供一种新技术。     

多重荧光定量PCR快速鉴定转基因玉米品系

采用多重实时荧光 PCR技术的高通量特征,对转基因玉米MIR604、GA21、DAS-40278-9和98140的特异性靶标序列设计TaqMan-MGB荧光探针,通过退火温度和引物探针浓度梯度优化建立了四重实时荧光PCR检测方法,经特异性,重复性和灵敏性等方法学验证确认了方法的可靠性。MIR604、GA21、DAS-40278-9、98140四个特异性基因的标准曲线回归方程分别为y=-3.263x+36.632,y=-3.422x+36.384,y=-3.294x+38.978和y=-3.278x+37.514;Ct值变化范围分别在23.556～37.524,22.893～37.412,25.304～39.110和24.501～37.618之间;标准偏差分别在0.078～0.476,0.085～0.463,0.120～0.487和0.148～0.353之间;相关系数R2分别为0.997,0.996,0.995和0.993;检出限可达10个拷贝,扩增效率满足欧盟等国际要求。该方法一管多检,操作简便,成本较低,适用于大批次样本的高效分析检测,为转基因产品合规使用和进出口食品安全监测提供方法参考。     

利用多重PCR方法检测7种转基因卡诺拉油菜籽品种(系)研究

为对商业化进口7种转基因卡诺拉油菜籽品种(系)进行高通量、快速、准确检测,建立可用于鉴定7种转基因卡诺拉油菜籽品种(系)多重PCR检测方法。首先建立7种转基因油菜籽品种(系)稳定单重PCR检测体系,在此基础上再建立和优化7种转基因油菜籽品种(系)多重PCR检测体系;获得4组可用于鉴定7种转基因卡诺拉油菜籽品种(系)多重PCR检测体系,其中1组为四重PCR检测体系,3组为两重PCR检测体系。优化多重PCR体系具有较高稳定性和重复性,可作为检测该7种转基因油菜籽品种(系)有效方法。     

转基因油菜籽PCR检测技术研究

以转基因抗草甘膦油菜籽F4—27和转基因抗草丁膦油菜籽T—21为材料,通过使用特异性引物,对转基因油菜籽常见启动子、终止子、筛选标记基因和转入目的基因等多个外源转基因元件进行采用PCR检测,以期建立一套快速、准确、高效转基因油菜籽筛查鉴定技术。     

用PCR检测熟食中的转基因Bt-玉米

用8种已知并已发表的PCR（聚合酶链反应）引物组进行比较，用以测定熟食中转基因Bt“极产”玉米“event 176”的zein(玉米醇溶蛋白－－泽注）基因，crylA(b)基因，bla基因、bar基因和35S cauliflower mosaic virus promoter(花椰菜马赛克病毒启动区－－译注）。以转基因爆玉米花、粟粉粥、酥饼作样品。粟粥粉和酥饼用含有不同百分率（100％，1％，0．1％，w/w)的转基因玉米粉制作。在不同熟时间从样吕提取的DNA，其平均DNA碎片长度逐渐下降，但仍能通过PCR扩增。试验的几种引物组，以Cyr 03/04表现最好，可以检测出仅含0．1％Bt-玉米DNA的熟食中的转基因DNA。     

双重数字聚合酶链式反应定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系

目的 建立双重数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法精准定量检测转基因马铃薯EH92-527-1品系的方法。方法 基于马铃薯内源UGPase基因和EH92-527-1品系外源插入片段旁侧序列,设计合成引物和探针,确定反应体系和反应条件,建立转基因马铃薯EH92-527-1品系双重数字PCR定量检测方法。对方法的特异性、定量检测范围、定量检出限、检测准确度进行评估。结果 该方法特异性良好,除转基因马铃薯EH92-527-1品系外,其他物种和品系均无扩增;在线性范围内,内参基因和品系特异性基因拷贝数的相对标准偏差值介于 0.86%～22.90%（＜25%为可接受的范围）,线性决定系数R2＞0.99;品系特异性基因的定量检出限为3拷贝;不同浓度样品EH92- 527-1品系含量测定值与真实值之间的偏差分别为1.54、4.92和-1.31。结论 方法具有良好的重复性和准确度,可以用于进出口产品中转基因马铃薯EH92-527-1成分的定性定量检测。该方法的建立对于转基因马铃薯及其制品的监控监管、安全评价和风险预警具有重要意义。     

多重PCR技术在食源性致病菌检测中应用的研究进展

食源性致病菌的多重PCR检测技术是指能够同时扩增得到同种或多种致病菌的不同基因片段的技术。因该技术特异、灵敏且分析效率高,现已被广泛应用于食源性致病菌的检测工作中。本文介绍了多重PCR在食源性致病菌检测中应用的研究近况,并对影响因素及存在的问题进行了阐述。      

Detection of genetically modified insect-resistant Bt maize by means of polymerase chain reaction

 A method for the detection of genetically modified insect-resistant maize expressing a synthetic gene encoding a truncated version of the CryIA(b) protein derived from Bacillus thuringiensis is described. The procedure includes: (1) extraction of genomic DNA, (2) amplification of the inserted synthetic gene by means of the polymerase chain reaction (PCR) method, and (3) characterization and confirmation of the PCR product by Southern hybridization with a digoxigenin-labelled oligonucleotide probe and DNA sequencing. Received: 18 February 1997 / Revised version: 27 March 1997     

转基因鲑鱼AquAdvantage品系特异性实时荧光聚合酶链式反应检测方法的建立

目的实现转基因鲑鱼AquAdvantage的标识管理,建立其品系特异性实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检测方法。方法针对转基因鲑鱼的品系特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立转基因鲑鱼实时荧光PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测。结果建立的转基因鲑鱼实时荧光PCR方法特异性强,在600 000~60拷贝范围内呈良好的线性关系,其线性回归方程为y=-3.2194x+40.805,R~2=0.997,检测限为60拷贝,检测重复性良好。结论建立的品系特异性实时荧光PCR方法可应用于转基因鲑鱼AquAdvantage的鉴定。     

Vancomycin-modified poly-l-lysine magnetic separation combined with multiplex polymerase chain reaction assay for efficient detection of Bacillus cereus in milk

In this study, a new vancomycin (Van)-modified poly-l-lysine (PLL) magnetic bead (MB) technique was developed for isolation of gram-positive bacteria. The method combines magnetic separation with a multiplex PCR (mPCR) assay and gel electrophoresis for easy and rapid detection of Bacillus cereus. Vancomycin was used as a molecular ligand between the MB and the d-alanyl-d-alanine moieties on the cell wall surface of B. cereus. The PLL served as a flexible molecular tether between the MB and Van that reduced steric hindrance maintaining the biological activity of Van. The MB-PLL-Van capture nanoprobes exhibited excellent capture and isolation efficiency for B. cereus in spiked milk matrix samples without interference from the complex food matrix. The subsequent mPCR assay showed high specificity for the 4 target genes in B. cereus, the entFM, cesB, cer, and 16S rRNA genes, that were used to achieve efficient genotyping and detection. Under optimum conditions, the limit of detection reached 10³ cfu/mL, with a dynamic range of detection at 10³ to 10⁷ cfu/mL in pure culture. Application of the MB-PLL-Van mediated mPCR assay for B. cereus in milk matrix samples achieved results similar to those of the pure culture. In addition, with a 6-h pre-enrichment of B. cereus that was spiked in milk matrix samples, the limit of detection reached 10¹ cfu/mL. The MB-PLL-Van mediated mPCR assay developed in this study could be used as a universal technology platform for the efficient enrichment and genotyping of gram-positive bacteria.     

多重聚合酶链式反应技术检测罗非鱼5种常见食源性致病菌

目的 建立一种可同时检测无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门菌(Salmonella) 5种罗非鱼常见食源性致病菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法 根据5种致病菌特异性基因片段设计并合成引物,优化多重PCR体系条件,并对多重PCR体系的特异性、灵敏度以及人工模拟样品进行检测。结果 建立的多重PCR方法可同时扩增5种目的菌株的特异性条带,且不与非靶标细菌发生交叉反应。敏感性实验结果显示,该方法对无乳链球菌、嗜水气单胞菌、沙门菌、霍乱弧菌、大肠杆菌纯培养物基因组DNA的检出限均为0.4 ng/μL。人工模拟样品检测结果显示,该方法可以快速且准确地检测上述5种食源性致病菌,且检出限可达到2×10¹ CFU/g。结论 本研究建立了一种可同时检测无乳链球菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌、大肠杆菌和沙门菌5种罗非鱼常见食源性致病菌的多重PCR检测...     

The effect of ensiling on PCR-based detection of genetically modified Bt maize

 The detection of the genetic modification in silage obtained from insect-resistant Bt maize by means of the polymerase chain reaction (PCR) is described. The detectability of the transgene was shown to be dependent on the length of the genomic target sequence chosen for amplication by the PCR. By amplifying a Bt-maize-specific DNA sequence of 211 bp the genetic modification was detected up to 7 months after ensilage. The effect of maize DNA degradation in the course of the ensilage on the detectability of target sequences was demonstrated in model experiments. Received: 17 December 1998