三唑磷多克隆抗体的制备及鉴定

采用活泼酯法将三唑磷半抗原(TZPM-Hap)与牛血清蛋白(BSA)和卵血清蛋白(OVA)偶联,制备出免疫抗原(TZPM-A-BSA)和包被抗原(TZPM-A-OVA),经紫外扫描证明人工抗原合成成功.用免疫抗原TZPM-A-BSA免疫雌性Balb/c小鼠,获得了特异性的三唑磷多克隆抗体.以所获得的抗体建立间接竞争酶联...     

间接竞争酶联免疫法检测水样中的重金属镉

利用重金属镉多克隆抗体,建立一种低仪器成本的检测水样中重金属镉的间接竞争酶联免疫法,其检测限(IC15)为0.76μg/L,灵敏度(IC50)为11.33μg/L。交叉反应结果表明,该抗体除与汞螯合物的交叉反应率为10.9%,与其他金属(锰,铬,镁,铁,铅,镍,银和铜)螯合物的交叉反应率均低于1.32%。自来水和河水样品中镉的添加回收率为93.95%～107.40%,变异系数为3.97%～14.69%。     

ELISA法测定热加工食品中的丙烯酰胺

该研究建立了热加工食品中丙烯酰胺的间接竞争ELISA检测方法.首先用戊二醛法合成丙烯酰胺-BSA免疫抗原,注入兔体内以产生抗丙烯酰胺多克隆抗体.结果显示,在包被抗原为1.5μg/mL,抗体稀释度为1∶16000倍的优化条件下,间接ELISA法检测范围为50μg/L～1280μg/L,IC50为检测限为350μg/L,最低检测限为50μg/L.加标回收率为92.6%～95.5%.该检测方法准确快速,特异性强,适用于热加工食品中丙烯酰胺的快速检测.     

三唑磷单克隆抗体制备以及酶联免疫试剂盒的研究

通过三唑磷与乙酰氯反应,得到三唑磷半抗原,通过免疫动物得到抗三唑磷单克隆抗体,将其应用于能够检测蔬菜中三唑磷残留量的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒,结果表明：该试剂盒对结球甘蓝中三唑磷的检测限为49.6 μg/kg,IC50为6.9 μg/L,加样回收率为70.0%～93.5%,三唑磷标准曲线线性范围为1～81 μg/L,批内、批间的相对标准偏差（RSD）＜10%,三唑磷单克隆抗体与毒死蜱、对硫磷的交叉反应率分别为2.3%,3.8%。4 ℃条件该试剂盒下能够保存12个月,稳定性较好。     

呋喃唑酮残留标示物人工抗原合成与抗体制备

以乙醇肼和碳酸二甲酯为原料,合成2种半抗原3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)和3-(4-羧基苯亚甲基)-氨基-2-恶唑烷酮(CPAOZ),经戊二醛法和碳二亚胺法将半抗原与牛血清蛋白(BSA)偶联合成2种人工抗原AOZ-BSA和CPAOZ-BSA,产物经紫外光谱扫描分析鉴定。用2种人工抗原采取不同程序免疫新西兰大白兔,获得8组多克隆抗体。AOZ-BSA抗体效价1:0.8×104～1:3.2×104,对AOZ灵敏度低,IC50均大于100μg/ml。CPAOZ-BSA抗体效价1:1.6×105～1:6.4×105,对AOZ与苯甲醛衍生物N-苯亚甲基-3-氨基-2-恶唑烷酮(PAOZ)灵敏度高,IC500.91～11.56ng/ml,特异性好,仅与呋喃唑酮(交叉反应率6.15%)、3-(2-硝基苯亚甲基)-氨基-2-恶唑烷酮(NPAOZ,交叉反应率5.73%)有交叉反应,与衍生试剂苯甲醛和其他药物没有交叉反应(交叉反应率<0.01%)。本研究制备出AOZ特异性抗体,为我国开发AOZ酶联免疫试剂盒奠定基础。     

环丙沙星时间分辨荧光免疫分析方法的建立与应用

建立基于时间分辨荧光免疫分析技术的环丙沙星(CPF)间接竞争检测方法。将环丙沙星-卵清白蛋白(CPF-OVA)包被于固相微孔板,CPF标准品或样品中CPF与CPF包被原(CPF-OVA)共同竞争限量的CPF抗体,用铕标羊抗兔IgG示踪,建立环丙沙星时间分辨荧光免疫分析方法(CPF-TRFIA);考察包被质量浓度、抗体稀释液、反应时间等对方法灵敏度的影响。结果表明：在优化条件下,该方法的检测限为0.5μg/L,半抑制质量浓度(IC50)为4.32μg/L,线性范围(IC20～IC80)为1.14～28.85μg/L;该方法对蜂蜜中CPF平均回收率为80.66%～100.30%,对牛奶中CPF的平均回收率为76.30%～95.22%,两者的平均批内和批间变异系数分别为7.42%和10.92%。CPF-TRFIA间接竞争法测定环丙沙星具有灵敏度高、特异性好、性能稳定的优点,适于高通量筛查。     

鸡肉中金刚烷胺间接竞争ELISA检测方法的建立

建立检测鸡肉中金刚烷胺的间接竞争酶联免疫吸附分析(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay,ic-ELISA)法。利用N-(1-金刚烷胺基)肼甲酰胺与乙醛酸合成新式金刚烷胺半抗原,采用活泼酯法将金刚烷胺半抗原分别与血蓝蛋白、牛血清白蛋白偶联合成免疫原和包被原,将所制备的人工抗原免疫BALB/c小鼠,并制备特异性识别金刚烷胺的单克隆抗体。ic-ELISA法经系统优化后,最佳包被原稀释倍数为80 000,抗体工作质量浓度为122.50μg/L,对金刚烷胺的IC50为0.69μg/L,检出限为0.21μg/L,在0.07～6.15μg/L之间线性良好,鸡肉样品中添加回收率为101.69%～108.71%,变异系数均低于15%,且实际样品检测结果与高效液相色谱-质谱联用测定结果相关性良好(R2=0.97),表明建立的ic-ELISA具有良好的准确度和可靠性。利用该特异性抗体建立的方法适用于实际鸡肉样品中金刚烷胺的快速检测。     

ELISA检测盐酸克伦特罗残留的方法学评价

以盐酸克伦特罗(clenbuterolhydrochloride)重氮化后分别连接到牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上制得免疫原BSA-CL和包被抗原OVA-CL。通过免疫兔获得含有多克隆抗体的血清,经硫酸铵沉淀、纯化,得到兔源抗CL的抗体,在此基础上建立了间接酶联免疫检测方法。实验结果表明,抗CL抗体最适稀释度为1:1000,羊抗兔酶联抗体(HRP-IgG)的最适稀释度为1:1500。该检测方法的检测灵敏度为1.452μg/L,线性检测范围为7.26～90.75μg/L。     

间接竞争酶联免疫分析方法检测花生中黄曲霉毒素B1

目的:针对花生中强毒性污染物黄曲霉毒素B_1(AFB_1)建立了一种准确、灵敏的间接竞争酶联免疫分析方法(ic-ELISA)。方法:制备了AFB_1包被抗原,包被量为0.1μg/孔;抗体稀释64 000倍;选用0.1%脱脂乳粉为方法封闭液,0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)为样品稀释液;结果:在最优的试验条件下,建立的ic-ELISA对目标物AFB1的检测线性范围为0.0097～0.088μg/L(R2=0.999);灵敏度(IC50)和检出限(IC15)分别达到0.027μg/L和0.0066μg/L。板内变异系数(n=6)为0.29%～16.9%,板间变异系数(n=6)为0.22%～21.19%。在花生样品中AFB_1的检测灵敏度(IC50)为1.04μg/kg,回收率为96.67%～106.51%。结论 :本研究建立的ic-ELISA方法操作相对简便,检测灵敏度高、准确性好,可稳定地用于花生样品中AFB_1污染物的定量分析检测。     

生物素-亲和素增敏抑制型SPR等离子共振传感器检测牛奶中链霉素

针对牛奶中链霉素(STR)残留问题,开发一种基于生物素-亲和素系统(BAS)增敏及抑制型等离子共振(SPR)免疫传感器。方法:直接交联法获得的半抗原STR-OVA,通过活化酯法偶联生物素得到抗原BNHS-STR-OVA,与芯片上的链霉亲和素(SA)结合,绑定抗原。依据免疫抑制原理,STR与BNHS-STR-OVA共同竞争固定浓度的特异性抗体,依据不同浓度STR所得响应值,计算抑制率并绘制曲线,实现对食品中STR残留的准确、灵敏、快速分析。利用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS)检测该方法的准确性。结果:检测过程中抗原的固定量为6μg,抗体质量浓度为60 mg/mL。构建的抑制型免疫传感器的检出限(IC15)为0.37μg/L,灵敏度(IC50)为1.65μg/L。检测时长不超过10 min,芯片可重复使用90次。结论:研究所构建的BAS-SPR增敏、抑制型免疫传感器,方法简单,灵敏度高,检测时间短,成本低,可满足牛奶样品中STR高效检测的需求。     

消旋氧氟沙星抗体制备及其手性识别特性研究

采用活泼酯法（A）和直接EDC（1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）碳二亚胺盐酸盐）法（D）,合成两种包被抗原（OFL-A-OVA和OFL-D-OVA）和两种免疫抗原（OFL-A-BSA和OFL-D-BSA）,然后分别用两种免疫抗原免疫小鼠获得与其对应的多克隆抗体,建立消旋氧氟沙星残留免疫检测方法。研究结果表明：紫外扫描图谱证明四种抗原均合成成功,OFL-A-BSA、OFL-D-BSA、OFL-A-OVA和OFL-D-OVA的偶联比分别为19.67、3.03、1.93和0.99。消旋氧氟沙星的间接竞争ELISA法的线性检测范围为16.35～444.10ng/mL,IC50为5.42ng/mL,最低检测限为6.23ng/mL。消旋氧氟沙星抗体与恩诺沙星、环丙沙星、加替沙星等其他同类药物的交叉反应率较低,表明消旋氧氟沙星抗体具有较高的特异性,且消旋氧氟沙星抗体对左旋氧氟沙星和右旋氧氟沙星的识别并非对等,对左旋的识别能力较大,左旋氧氟沙星对抗体的产生起主要作用。     

盐酸西布曲明人工抗原的合成与鉴定

目的：建立盐酸西布曲明的免疫分析方法。方法：4-氯苯乙腈和1, 3-二溴丙烷为原料合成与盐酸西布曲明具有相同母核结构的小分子双去甲基西布曲明(M2),以双去甲基西布曲明为半抗原,并分别通过活泼酯法、戊二醛法和混合酸酐法将半抗原与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫原(M2-BSA)和包被抗原(M2-OVA)。结果：紫外光谱扫描证明半抗原M2与载体蛋白偶联比为24.6:1(M2-BSA)和16.2:1(M2-OVA),抗血清ELISA效价均达到1:8000以上,IC50=0.42μg/mL。结论：半抗原M2与载体蛋白均已成功偶联,其中活泼酯法对半抗原活性基团的影响最小,合成人工抗原的特异性最强。     

氯羟吡啶人工抗原合成和鉴定

目的：将氯羟吡啶的衍生物分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)制备人工抗原。方法：采用威廉森合成法合成了氯羟吡啶的衍生物(CLOP-2C),再分别经活泼酯法和氯甲酸异丁酯法合成氯羟吡啶的人工抗原CLOP-2C-BSA,CLOP-2C-OVA)。结果：通过TLC、质谱、红外光谱等方法鉴定表明成功制备了氯羟吡啶衍生物。紫外扫描图谱表明人工抗原偶联成功,且半抗原与载体的分子结合比率分别为8.26 和4.7。结论：成功的制备了氯羟吡啶人工抗原。     

氯吡脲人工抗原的合成与鉴定

为合成新的、有效的氯吡脲（forchlorfenuron,CPPU）人工抗原,在无水三氯化铝的催化作用下,采用傅克反应对CPPU小分子进行结构改造。采用碳二亚胺（carbodiimide,EDC）法将半抗原分别与牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）和卵清蛋白（ovalbumin,OVA）进行偶联,获得CPPU的免疫抗原（CPPU-BSA)和包被抗原（CPPU-OVA）。采用质谱、元素分析和核磁共振氢谱对CPPU半抗原（CPPU-COOH）的分子结构式进行鉴定;采用紫外光谱和高性能基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱对偶联物的结构和相对分子质量进行鉴定。结果显示成功合成出CPPU人工抗原,为其抗体的制备和免疫学方法的构建提供了参考。     

三聚氰胺人工抗原化合物的合成及鉴定

目的：建立三聚氰胺残留的免疫分析方法。方法：以三聚氰胺结构类似物2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪为原料,分别与6-氨基己酸和对氨基苯甲酸,各经两步化学反应合成两种具有不同长度间隔臂的半抗原MEA和MEB,并分别通过碳二亚胺法和混合酸酐法将MEA和MEB与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备三聚氰胺的免疫原(MEA-BSA)和包被原(MEB-OVA)。结果：经质谱和紫外光谱表征,证明所合成的产物为目标半抗原MEA和MEB,并且与载体蛋白偶联比可达到25.28:1(MEA-BSA)和13.11:1(MEA-OVA)。结论：半抗原MEA和MEB及人工抗原合成成功。     

链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸人工抗原的合成及其多克隆抗体制备

本研究采用肟化法用羧甲基羟胺半盐酸盐对链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸(Tenuaconic acid,TA)进行衍生后引入连接臂,得到了半抗原TAO。通过活性酯法将半抗原TAO分别与牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)偶联制备得到免疫原TAO-BSA、与血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)偶联制备得到包被原TAO-KLH。经透析纯化后分别采用紫外光谱、红外光谱扫描法对合成的人工抗原进行初步鉴定,制备得到的人工抗原的偶联比分别为18.3:1、38.7:1。此人工抗原免疫Balb/c小鼠后获得的鼠源抗血清进一步验证了人工抗原合成成功,制备得到特异性识别TA的多克隆抗体。通过ELISA棋盘法确定了最佳包被原浓度以及最佳抗体稀释度并建立了TA间接竞争ELISA检测方法,其灵敏度以半抑制浓度IC50表示为335.55 ng/m L,最低检出限(LOD)为19.00 ng/m L,定量线性检测范围为200.00~1563.00 ng/m L。     

格列本脲人工抗原的合成与鉴定

目的：合成格列本脲人工抗原。方法：采用对氨基苯甲酸法制备半抗原,将半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)通过碳二亚胺法偶联制备免疫原(Gli-BSA)和包被原(Gli-OVA),利用紫外扫描进行抗原的化学鉴定,通过免疫原免疫Balb/c小鼠,间接酶联免疫吸附法测定抗血清进行生物鉴定。结果：制备了Gli-BSA、Gli-OVA的人工抗原,经紫外光谱扫描,偶联比分别为4:1和17.7:1。免疫小鼠后获得抗血清的效价均达到32000以上,半抑制质量浓度为10μg/mL。结论：成功合成了格列本脲人工抗原,并获得了格列本脲抗体,为格列本脲的免疫学检测方法进一步研究提供了实验基础。     

保健酒中萘普生免疫学检测方法的建立

萘普生是疗效显著但有一定副作用的非甾体抗炎药物,近期频繁发现不法生产者在抗风湿保健酒中添加萘普生增加治疗效果,这种现象对消费者健康构成威胁。为了究建立快速检测萘普生的免疫学方法, 本文以活泼酯法将萘普生分别连接到BSA制备免疫抗原,连接到OVA上制备检测抗原。用免疫抗原免疫家兔制备多克隆抗体,配合检测抗原经条件优化建立竞争抑制酶联免疫吸附检测方法。实验结果表明,检测体系IC50值为23.0 ng/mL,最低检测限为3.1 ng/mL,检测保健酒中萘普生加标回收率在87.3~102.1%,变异系数小于8.9%,与8种相关药物交叉反应率都小于0.05%。且与用ELISA方法与HPLC检测市售保健酒,1例阳性和19例阴性结果全部吻合。因此,本文所建立的免疫学检测萘普生的实验方法,具有高灵敏度和特异性,能够满足保健酒萘普生快速筛选的需要。