响应面法优化植物乳杆菌代谢产细菌素的发酵条件

为提高一株分离自内蒙古传统发酵稀奶油“焦克”中的植物乳杆菌KLDS1.0391 代谢产细菌素量,以中性蛋白酶水解脱脂乳为培养基,以枯草芽孢杆菌为指示菌,以抑菌圈直径为考察指标,在单因素试验的基础上,采用响应面法优化发酵pH 值、温度以及接种量。结果表明：对该菌代谢产细菌素的活性影响大小依次为：发酵pH值＞接种量＞发酵温度;最优发酵条件为：pH5.1、发酵温度33℃、接种量1%。在此条件下,发酵液的抑菌圈直径为15.00mm,细菌素的效价为601.32IU/mL,较优化前提高了43.08%。在最优发酵条件下获得的实验结果与模型预测值吻合,说明所建立的模型是切实可行的。     

与特定乳酸菌共培养对植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成的诱导作用

植物乳杆菌KLDS1.0391与76株乳酸菌分别共培养后,测定培养物的抑菌活性和活菌数,判断与乳酸菌共培养对植物乳杆菌细菌素合成的影响及细菌素合成与菌体密度的关系。结果表明：植物乳杆菌KLDS1.0706、KLDS4.0315、KLDS4.0351、罗伊氏乳杆菌KLDS1.0736这4株菌与植物乳杆菌KLDS1.0391共培养后,抑菌活性显著增加(P＜0.01)。与罗伊氏乳杆菌共培养过程中细菌素的抑菌活性与植物乳杆菌KLDS1.0391的细胞密度呈现明显的正相关性,并且发现只有活的诱导菌与植物乳杆菌KLDS1.0391共培养才能够诱导细菌素的合成。     

基于聚醚砜(PES)超滤膜的粘杆菌素发酵液预处理过程优化

利用超滤对粘杆菌素发酵液进行膜分离处理并对其工艺过程进行优化。根据膜材料特性,选择聚醚砜(PES)为基材的超滤膜,通过不同截留分子量超滤膜的分离性能比较、操作条件选择,最终确定PES-10(截留分子质量为10 000 u)为超滤膜件,适宜的操作压力为0.3 MPa、料液pH值为6。经过超滤处理,滤液蛋白质含量为4.6mg/100mL,蛋白质去除率为96%,吸光度为0.185,发酵液中的色素得到有效地去除。     

超滤法提取发酵液中核黄素

采用截留分子质量(MWCO)为1000 Da、10 kDa和30 kDa的卷式膜,探索卷式膜超滤核黄素发酵液的可行性。对比分析超滤膜的杂质截留率和膜通量,发现MWCO为10 kDa的卷式超滤膜对核黄素具有较好的分离效果。通过研究操作压力、温度、流速及浓缩倍数对膜通量的影响,确定核黄素发酵液超滤的最佳条件为:温度30℃,流速5 m/s,操作压力0.2 MPa,浓缩倍数为3.8倍。超滤后,经过氧化结晶核黄素的纯度可达98.6%,总回收率达95%。     

植物乳杆菌KLDS1.0391在酸奶体系中的细菌素产生特点

植物乳杆菌KLDS1.0391能够合成细菌素,也是益生菌,在食品中既可作为益生菌使用,也可作为辅助发酵剂用于生物防控,该研究主要考察了KLDS1.0391菌株在酸奶体系中细菌素的产生特点。研究结果表明,在发酵的6 h期间,抑菌活性随发酵时间延长而增强,发酵结束时,添加植物乳杆菌KLDS1.0391酸奶组的抑菌活性显著高于仅使用酸奶发酵剂的对照组(P<0.01)。与对照组相比,加入辅助发酵剂的实验组的感官品质未发生明显的变化。植物乳杆菌KLDS1.0391具备开发益生酸奶的潜力。     

植物乳杆菌KLDS1.0391 PurR和PurL蛋白的原核表达、纯化及其与细菌素合成启动子的相互作用

通过体外实验探究purR、purL基因对植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）KLDS1.0391细菌素合成是否具有直接调控作用。基于植物乳杆菌KLDS1.0391全基因组序列,通过聚合酶链式反应扩增得到PurR和PurL蛋白的编码基因,构建原核表达载体,将重组质粒导入大肠杆菌M15中进行诱导表达,采用镍柱亲和层析法纯化得到目的蛋白,透析后超滤浓缩,通过凝胶阻滞实验以及生物膜干涉技术研究两种蛋白与菌株细菌素合成调控区域是否具有结合作用。结果表明,PurR蛋白以可溶性蛋白形式存在,PurL蛋白以包涵体蛋白形式存在,纯化后经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示条带单一,达到电泳纯,经过浓缩后PurR蛋白质量浓度为0.74 mg/mL,PurL蛋白质量浓度为3.8 mg/mL。凝胶阻滞实验以及生物膜干涉技术结果表明,2 个重组蛋白与菌株细菌素合成基因的启动子在菌体外无直接的结合作用,对于两种蛋白对细菌素合成的调控是否属于间接调控作用以及在菌体内的调控情况,需进一步研究。     

植物乳杆菌M1-NTG300产细菌素培养条件优化

以植物乳杆菌素的效价作为特征性考察指标,对植物乳杆菌M1-NTG300产细菌素培养条件进行优化。通过响应面分析结合实际值确定培养基最佳组分为:葡萄糖浓度3.5%、蛋白胨浓度3.5%、吐温80浓度0.35%、氯化镁浓度0.20%,此培养条件下植物乳杆菌M1-NTG300所产细菌素的效价为1 269.4IU/mL,细菌素效价提高了19.8%。     

胶质芽孢杆菌SM-01胞外多糖提取纯化工艺

针对胶质芽孢杆菌SM-01发酵液粘度高,菌液分离困难而导致胞外多糖提取效率低的问题,采用硅藻土吸附-抽滤法,对提取工艺及超滤条件进行了研究,确定了工艺参数。结果表明,发酵液中NaCl添加量为3 g/dL,发酵液稀释倍数为3倍,硅藻土添加量为10 g/L时,在室温下抽滤可除去菌体和蛋白质。滤液在0.1 MPa下经截留相对分子质量为200 000的超滤膜超滤纯化,多糖回收率可达73.2%。     

AI-2的体外合成及其对植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成的影响

本文采用单因素实验,优化AI-2合成的孵育温度、pH、酶浓度以及孵育时间。利用优化的合成条件,成功合成具有生物活性的AI-2,活性约为阳性对照的2倍。添加合成的AI-2到MRS培养基中,研究AI-2对植物乳杆菌KLDS1.0391生长和细菌素合成的影响,并采用实时荧光定量PCR分析培养15 h的植物乳杆菌KLDS1.0391的细菌素结构基因pln EF的转录水平。结果表明:AI-2合成的最优条件为:0.5 mg/m L Pfs蛋白、1.0 mg/m L Lux S蛋白、2 mmol/L SAH,p H7.5,37℃孵育5 h。添加合成的AI-2对植物乳杆菌的生长无明显影响;培养3 h后,相同培养时间时添加AI-2的实验组对枯草芽孢杆菌ATCC6633的抑菌圈直径显著高于空白对照和阴性对照组(p0.01);添加AI-2的实验组的pln EF基因的表达量上调至空白对照的2.89倍。本研究成功优化AI-2的体外合成条件;添加合成的AI-2对植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成有促进作用,且这种促进作用可能与pln EF基因转录水平上调有关。     

超滤法去除食源性低聚肽中的细菌内毒素

目的:探讨超滤法去除食源性低聚肽中细菌内毒素的效果。方法:采用凝胶法半定量检测5种食源性低聚肽中细菌内毒素的含量;利用膜材料为聚醚砜、截留分子质量为3000、5000、10000、30000、50000的超滤离心管去除样品溶液中的内毒素,评价不同截留分子质量超滤膜的内毒素清除效果;综合考虑内毒素清除率、超滤速度、生产效率、产品回收率等因素,选定截留分子质量为13000的卷式超滤膜进行工艺放大。结果:截留分子质量为3000、5000、10000的超滤膜可将内毒素控制在50 EU/g以内,截留分子质量为30000和50000的超滤膜可分别将内毒素控制在50~200 EU/g、200~400 EU/g范围内;经截留分子质量为13000的卷式超滤膜超滤后,食源性低聚肽样品中细菌内毒素<50 EU/g,清除率>97.5%,产品回收率>75%。结论:超滤法可有效去除食源性低聚肽中细菌内毒素,并且具有可重复利用、生产成本低等优点,适合用于工业化生产中。     

一株产细菌素植物乳杆菌高密度发酵培养基的筛选及其在酸奶中的应用

目的:优化用于高密度发酵产细菌素的植物乳杆菌KLDS 1.0391的经济有效培养基,旨在生产具有益生作用的辅助发酵剂。方法:以发酵液中活菌数量和抑菌效果为指标,比较不同水解度的脱脂乳粉、乳清粉、麦麸,以及玉米浆粉的发酵效果,制备冻干形式的植物乳杆菌直投式发酵剂,将其添加至酸奶中,评价其对酸奶发酵时间、pH、滴定酸度、粘度和感官评价的影响,进而确定其在酸奶中应用的可行性。结果:确定脱脂乳粉、乳清粉和麦麸培养基的最佳水解度分别为15%、15%和20%;植物乳杆菌KLDS 1.0391在玉米浆粉培养基中获得的发酵效果最佳,活菌数量达到9.53 lg CFU/mL,抑菌圈直径达到12.69 mm。植物乳杆菌直投式菌种的添加对酸奶发酵时间和感官评价无显著影响(P>0.05),酸奶粘度下降,但可以缓解酸奶的后酸化程度。通过优化得到植物乳杆菌KLDS 1.0391高密度发酵的廉价培养基为:4%玉米浆粉,同时补充2%葡萄糖和0.1% Tween-80。结论:制得的植物乳杆菌直投式发酵剂可应用于酸奶生产中。     

luxS基因对盐胁迫下植物乳杆菌生长及细菌素合成的影响

以植物乳杆菌KLDS1.0391野生株及其luxS基因缺失突变株为研究对象,探究luxS基因对该菌盐耐受能力的影响,并测定在0%、2%、3%、4%和6%质量分数NaCl胁迫条件下,luxS基因缺失对该菌生长及细菌素合成的影响,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术在转录水平上测定该菌细菌素合成相关基因的表达水平。结果表明：随NaCl质量分数的升高,2 株菌的存活率均逐渐下降,当NaCl质量分数大于3%时,相同条件下野生株对盐的耐受能力显著强于突变株（P＜0.05）;除此之外,NaCl质量分数越高,菌株进入稳定期的时间越向后延迟,luxS基因缺失突变株在各NaCl质量分数下生长及细菌素合成能力均显著弱于野生株（P＜0.05）。实时荧光定量PCR结果显示,当培养至稳定期24 h时,细菌素结构基因plnEF以及双组分调节基因plnD和plNC8HK均因luxS基因的缺失,表达显著下调（P＜0.05）。因此,luxS基因缺失显著降低植物乳杆菌KLDS1.0391盐耐受能力,并且在NaCl胁迫条件下,该菌生长及细菌素合成能力也因luxS基因缺失而显著下降。     

1株抑制乳房炎病原菌乳杆菌的筛选、鉴定及其抑菌机理研究

为了研究乳酸菌对牛乳房炎病原菌的抑制作用,降低牛乳房炎所造成的经济损失。本实验以大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、无乳链球菌ATCC14556作为指示菌,综合抑菌试验和黏附试验从8株乳杆菌中筛选抑菌效果较好的菌株。结果表明,乳杆菌KLDS1.0344对指示菌的抑制作用比其他乳杆菌的作用更明显,最大抑菌直径为15.4 mm,经过对16S rDNA鉴定,发现KLDS1.0344为植物乳杆菌,同时,对抑菌机理的初步研究表明,其代谢过程中产生的乳酸和细菌素类物质对抑制三种指示菌发挥主要作用,而且这些抑菌活性物质在酸性条件下才具有更强的抑菌活力。     

The role of plNC8HK-plnD genes in bacteriocin production in Lactobacillus plantarum KLDS1.0391

The function of plNC8HK gene and plnD gene on the bacteriocin production of Lactobacillus plantarum KLDS1.0391 was studied. The results of bioinformatics analysis showed that PlNC8HK protein was a histidine protein kinase and a cytoplasmic membrane protein with six transmembrane helices. PlnD protein was a response regulator of the LytR/AlgR family. Quantitative real-time PCR revealed that plNC8HK and plnD genes of L. plantarum KLDS1.0391 were up-regulated significantly (P < 0.01) when L. plantarum KLDS1.0391 co-cultured with Lactobacillus helveticus KLDS1.9207. The plNC8HK-plnD mutant was also constructed. The change of antibacterial activity, AI-2 activity and cell number of plNC8HK-plnD mutant in co-culture and mono-culture demonstrated that plNC8HK and plnD genes were essential for bacteriocin production in L. plantarum KLDS1.0391, and the increase of bacteriocin production correlated closely with plNC8HK and plnD genes in co-culture. These results are beneficial to understand the role of two components system in the bacteriocin production of L. plantarum.     

营养胁迫植物乳杆菌KLDS 1.0328的生理特性及其冷冻干燥菌粉贮存稳定性分析

为探究冷冻干燥植物乳杆菌KLDS 1.0328的贮存稳定性受初始营养条件调控的差异性,分析葡萄糖胁迫、吐温80胁迫以及葡萄糖和吐温80复合胁迫对该菌株生长、产酸、细菌素抑菌活性、形态、细胞膜脂肪酸和菌粉贮藏过程中存活率的影响。研究发现,葡萄糖和吐温80胁迫对菌体的生长、产酸和细菌素的产生有不同程度的影响。扫描电镜结果显示,吐温80胁迫或葡萄糖和吐温80复合营养胁迫环境下,菌体由短杆状转变为长棒状或卵圆形,尺寸也随之增大或减小。经多种营养胁迫处理后,各处理组中菌体细胞膜的不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸含量比值均有所提高。此外,葡萄糖胁迫可显著提高冷冻干燥植物乳杆菌KLDS 1.0328在－18 ℃贮存42 d期间的稳定性和存活率。     

1 株水开菲尔粒中植物乳杆菌的鉴定及产细菌素基因分析

目的：对从水开菲尔粒中分离得到1 株能产生抑菌物质的菌株QF01进行菌种鉴定,并对其产细菌素进行实验、鉴定和基因序列分析。方法：通过牛津杯法测定抑菌能力,采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增16S rDNA和细菌素相关基因并测序,利用ProParam tool、TMHMM 2.0、InterProScan、SOPM和SWISS-MODEL在线软件对基因编码产物进行分析。结果：该菌株产的细菌素对大肠杆菌（Escherichia coli JM109）有明显的抑制作用,通过16S rDNA序列分析初步确定该菌株属于植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。该菌株含有plnD、plnEF、plnV、plnR四种基因,其中plnV基因编码产物有跨膜螺旋结构,其结构存在信号肽特征。此外,从三级结构的模型预测得到4?种基因的编码产物均存在α-螺旋、β-转角、伸展链和无规则卷曲。结论：从水开菲尔粒分离得到的L. plantarum QF01菌株,含有plnD、plnEF、plnV、plnR细菌素基因,对大肠杆菌有很好的抑制作用。