18S rDNA和ITS相结合鉴定一株盐生海芦笋内生真菌的研究

对分离自盐生海芦笋的一株代号为Salicorn 8的真菌进行鉴定,提取基因组DNA后分别PCR扩增18S rDNA和ITS区域,基因测序并进行同源性分析,构建ITS基因系统发育树,结合形态学分析,将该菌鉴定为木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)。     

浓香型白酒窖泥中细菌多样性的免培养技术分析

采用免培养(culture independent)技术直接从浓香型白酒窖泥中提取细菌微生物混合基因组DNA(也叫元基因组DNA),利用细菌16S rDNA通用引物扩增窖泥细菌的序列,根据16S rDNA序列对细菌多样性进行初步分析。采用PCR扩增技术、分子克隆技术以及序列同源性分析等方法测定细菌的16S rDNA,通过与基因数据库中相似菌群序列同源性的比较,得到样品菌种多样性,分别构建系统发育树。结果显示,细菌含有几大类群,表现出高度的细菌多样性。共分为Uncultured bacterium、Clostridium、Lactobacillus、Eubacterium和Syntroph-omonas五个细菌分类。     

分子生物学与形态学相结合鉴定盐生海芦笋内生真菌Salicorn 15

从盐生海芦笋中分离出一株内生真菌(Salicorn 15),采用分子生物学与形态学观察相结合对其鉴定。提取该菌的基因组DNA后分别对其18S rDNA和ITS区域进行PCR扩增并进行单克隆测序分析,在NCBI上进行同源性分析,进而构建系统发育树,再结合形态学观察,将菌株Salicorn 15鉴定为层出镰刀菌Fusarium proliferatum。     

烟草18S rDNA染色体原位杂交技术优化研究

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）在细胞遗传学中有较多应用,其中重复序列常被作为探针来研究物种进化、分类。但现常用的探针序列均较长（200 bp-500 bp）,杂交耗时较多。本研究以烟草（Nictiana tabacum）为材料,克隆并标记18S rDNA保守序列（254 bp）,以其为探针对烟草染色体进行FISH,经18 h杂交获得了清晰的信号。在此基础上,利用荧光素直接标记引物序列（寡聚核苷酸）,经较短时间（2 h）的杂交,也获得了清晰的信号。以寡聚核苷酸为探针对云烟87四倍体、N.tabacum-N.plumbaginifolia五倍体、烟草六倍体、云烟87八倍体以及N.plumbaginifolia的染色体进行杂交,均获得了良好效果。且杂交液可简化配制,洗脱过程也可简化。18S rDNA寡聚核苷酸探针与5S rDNA寡聚核苷酸探针结合,实现了N.plumbaginifolia的18S rDNA和5S rDNA双色FISH。所以,该寡聚核苷酸序列可以应用于烟草属植物18S rDNA（45S rDNA）位点的分析,且较大程度缩短了操作时间并简化了操作过程。      

印度谷螟18S rDNA的克隆及定量PCR方法的建立

利用分子生物学方法从印度谷螟幼虫体内克隆获得了18S rDNA的基因全长序列(1 888 bp,GenBank登录号为KJ836335)。利用邻位连接法(neighbor-joining)分别构建了基于18S rDNA基因全长、保守序列Ⅱ以及多变区的系统发育树,比较了与其他已知昆虫18S rDNA基因的同源性和遗传距离。与其他序列的系统发育树相比,其全长序列的系统发育树更能反映鳞翅目昆虫的亲缘关系,印度谷螟与大蜡螟的亲缘关系最近。此外,建立了以18S rDNA为内参基因的实时荧光定量PCR方法。     

普洱茶发酵过程中真菌群落结构的变化分析

该文通过变性剂法提取普洱茶样品中微生物的基因组DNA作为模板,以真菌的通用引物扩增18S rDNA的NS31/Glol区,再将PCR产物用变性梯度凝胶电泳进行分析,通过对DGGE图谱的统计分析和18S rDNA序列分析研究普洱茶发酵过程中真菌群落结构的组成和演变规律。研究结果表明:普洱茶不同发酵阶段的真菌多样性呈现出一定差异和变化趋势,黑曲霉(Aspergillus niger)在整个发酵过程中占有优势地位,此外还包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和光孢青霉(Penicillium glabrum)。     

免培养技术对浓香型白酒大曲中细菌多样性的影响

采用免培养(culture independent)技术直接从浓香型白酒大曲中提取细菌微生物基因组DNA,利用细菌16S rDNA通用引物扩增大曲混合微生物的16S rDNA,采用PCR扩增技术、分子克隆技术以及序列同源性分析等方法测定大曲中细菌的16S rDNA基因全序列,通过与基因数据库中相似菌群序列同源性的比较,构建系统发育树。结果显示,成熟的大曲中细菌共分为Lactobacillus,Pantoea,Enterobacter,Klebsiella,Leuconostoc,Erwinias,Pseudomonas,Bacillus licheniformis几大类群,表现出高度的细菌多样性。     

长双歧杆菌PCR快速定向筛选方法

传统筛种方法具有随机性、盲目性,而PCR筛菌,增加了目的性和效率.在基因序列数据库中查找益生双歧杆菌的16S rDNA共有序列,找出它们共有的特异性序列,设计了PCR引物.平板培养分离,初步筛选双歧杆菌菌落.根据细菌16S rDNA和23S rDNA两侧高度保守区域设计通用引物,提取菌落基因组DNA,扩增16S-23S rDNA间区序列,并送测序.通过序列同源性比对分析,鉴定、筛选到人体长双歧杆菌.     

16S rDNA克隆文库法分析生鲜牛乳中 细菌种群的多样性

目的 利用16S rDNA基因文库分析法, 对生鲜牛乳中微生物的种群多样性进行研究。方法 提取生鲜牛乳中总微生物基因组DNA为模板, 将扩增到的生鲜牛乳样品的16S rDNA的PCR产物与pMD~18T载体连接, 构建其菌群的16S rDNA文库。对随机选取的56个阳性克隆子进行序列测定和BLAST比对。结果 文库序列分析表明, 有53个克隆子分属3个不同的类群, 即厚壁菌类群、变形菌类群和异常球菌-栖热菌类群, 其余3个克隆子属于未知类群。其中, 优势细菌类群为厚壁菌类群(86%), 在该类群中, 尤以无乳链球菌为主要代表, 约占所有克隆子的82%; 其他类群为γ~变形菌类群(7.1%)和异常球菌-栖热菌门类群(1.8%)。系统发育分析表明, 未知类群在分类地位上更接近与厚壁菌类群。结论 生鲜牛乳中微生物具有多样性, 无乳链球菌为其中的优势种群, 同时生鲜牛乳中还存在葡萄球菌等致病菌, 或不动杆菌和肠道菌等条件致病菌。     

16S rDNA克隆文库法分析生鲜牛乳中细菌种群的多样性

目的利用16S rDNA基因文库分析法,对生鲜牛乳中微生物的种群多样性进行研究。方法提取生鲜牛乳中总微生物基因组DNA为模板,将扩增到的生鲜牛乳样品的16S rDNA的PCR产物与pMD~18T载体连接,构建其菌群的16S rDNA文库。对随机选取的56个阳性克隆子进行序列测定和BLAST比对。结果文库序列分析表明,有53个克隆子分属3个不同的类群,即厚壁菌类群、变形菌类群和异常球菌-栖热菌类群,其余3个克隆子属于未知类群。其中,优势细菌类群为厚壁菌类群(86%),在该类群中,尤以无乳链球菌为主要代表,约占所有克隆子的82%;其他类群为γ~变形菌类群(7.1%)和异常球菌-栖热菌门类群(1.8%)。系统发育分析表明,未知类群在分类地位上更接近与厚壁菌类群。结论生鲜牛乳中微生物具有多样性,无乳链球菌为其中的优势种群,同时生鲜牛乳中还存在葡萄球菌等致病菌,或不动杆菌和肠道菌等条件致病菌。     

芦笋老茎中黄酮类物质的提取工艺优化及其微胶囊的性质研究

目的 优化芦笋老茎中黄酮类物质的提取工艺条件,提高芦笋副产物的高值化利用率。方法 采用超声波协同酶法提取芦笋老茎中的黄酮类活性物质,以总黄酮提取率为评价指标,通过单因素试验确定芦笋老茎中的黄酮类物质的最优提取工艺,对其黄酮类物质的抗氧化活性进行评价。以海藻酸钠为壁材制备芦笋黄酮微胶囊,对其理化性质、体外模拟胃肠消化进行分析。结果 超声波协同酶法提取芦笋老茎中的黄酮类活性物质的最优提取工艺为料液比1:20(g:mL)、乙醇体积分数60%、纤维素酶添加量2%、超声功率80 W和超声时间1.5 h,此时的总黄酮提取率为0.263%,其ABTS阳离子自由基、DPPH自由基清除率IC50值分别为43.57和34.83 μg/mL,具有一定的抗氧化活性;微胶囊的粒径为(0.8±0.1)mm、含水量为3.10%、密度为0.562 g/cm³、平均包埋率为73.62%、其超微结构显示微胶囊完整、结构致密。体外模拟胃肠消化分析表明,微胶囊在肠道中的释放率为40.55%,具有定点缓慢释放有效成分的作用。结论 采用超声波辅助酶法提取芦笋老茎中的黄酮类物质具有良好效果,微胶囊品质良好,可为芦笋副产物的精深加工提供理论数据和技术支撑。     

芦笋芦荟复合饮料的研制

利用正交实验设计 ,对芦笋、芦荟复合饮料制作进行探讨。芦笋汁的制作以芦笋头芽、主茎部分为主 ,辅以根基部分汁。芦笋的合理杀青条件为 0 0 1mol/L柠檬酸 ,96℃ ,4min。芦荟汁中加入Vc、Na2 SO3、柠檬酸均可增强其稳定性。芦笋汁和芦荟汁的最佳配比为V(芦笋 )∶V(芦荟 ) =3∶1。糖酸调整如下 :加入m(蜂蜜 ) =10 %～ 30 %的蜂蜜 ,加入苹果酸调pH值为 3 5～ 4。成品风味浓郁 ,口感柔和 ,具有保健、清凉止渴之功效     

芦笋总皂苷抗肿瘤作用研究

利用荷瘤小鼠观察研究芦笋总皂苷对移植性肿瘤S180、H22 的体内抗肿瘤活性和对免疫器官质量的影响。结果表明：芦笋总皂苷对S180 和H22 荷瘤小鼠的肿瘤生长有明显抑制作用,高剂量组对S180 和H22 抑瘤率分别达到39.53%(P ＜ 0.05)和34.81%(P ＜ 0.01),并呈现良好的量效关系。     

产还原型谷胱甘肽酵母菌的筛选与初步鉴定

从自然界筛选出98株产还原型谷胱甘肽(GSH)的酵母菌,发酵30h,分别测定胞内GSH含量,其中2053#菌株的GSH产量最高。初步发酵实验结果表明,2053#酵母菌株在发酵28h时菌体生物量(细胞干重)达到最大值11.55g/L,而胞内GSH含量在发酵30h时达到最大值49.74mg/L。在常规生理生化方法鉴定的基础上,结合18SrDNA序列分析表明2053#与Candidaparapsilosis(近平滑假丝酵母)的相似性达99.75%,为Candidaparapsilosis的1个亚种。     

印度谷螟18S rDNA的克隆及定量PCR方法的建立

为挖掘储粮害虫印度谷螟的基因信息,开发用于生物系统进化研究的工具,建立基因表达水平的研究方法,本文利用分子生物学方法从印度谷螟幼虫体内克隆获得了18S rDNA 的基因全长序列（1888 bp,GenBank登录号为KJ836335）。利用邻位连接法（neighbor-joining）分别构建了基于18S rDNA 基因全长、保守序列II以及多变区的系统发育树,比较了与其他已知昆虫18S rDNA基因的同源性和遗传距离。与其它序列的系统发育树相比,其全长序列的系统发育树更能反映鳞翅目昆虫的亲缘关系,印度谷螟与大蜡螟的亲缘关系最近。此外,建立了以18S rDNA为内参基因的实时荧光定量PCR方法。     

食源亚历山大藻核糖体DNA分子特征及其产毒特性的遗传差异

亚历山大藻可代谢产生麻痹性贝毒素,对人类健康和食品安全造成严重威胁。以核糖体DNA为研究对象,利用生物信息学及计算机分析软件对食源亚历山大藻核糖体DNA的分子特征进行分析,并且对亚历山大藻的产毒特性进行遗传差异研究。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增亚历山大藻核糖体18S rDNA-28S rDNA区域,利用DNAdist计算5.8S rDNA-ITS区域序列间距离值序数,同时,利用PCR-限制性片段长度多态性（restricted fragment length polymorphisms,RFLP）技术,对核糖体18S rDNA-28S rDNA进行测序分析,选择限制性内切酶MboⅡ绘制内切酶图谱。结果表明：亚历山大藻无毒株L35与产毒株在5.8S rDNA-ITS区域序列间核苷酸的差异值可达到0.201～0.488,与同属无毒亚历山大藻的核苷酸差异值＜0.004;通过酶切图谱特征条带可以准确地将不同亚历山大藻种产毒类型分3 类,酶切图谱相似的藻种产生的毒素组分相同。因此,食源亚历山大藻产毒与否以及产毒类型体现为核糖体DNA遗传信息中存在显著差异。     

芦笋下脚料皂苷超声提取工艺

采用超声强化技术对芦笋下脚料中的皂苷成分进行提取,通过两轮均匀试验对提取工艺进行优化。结果得到的最优提取工艺为液料比1:1、温度30℃、占空比0.4:1.6、功率200W、提取时间30min、pH5.05、酒精体积分数70%,该工艺条件下单次提取得率为7.5%(干基);两次提取累积回收率达到93.37%,3次提取累积回收率达到98.40%。在2L循环超声提取装置中的放大实验表明,两次提取累积回收率达到97.49%,3次可提取完全。表明超声强化方法适用于芦笋下脚料中皂苷的提取。     

Anthocyanins of Asparagus

SUMMARY— Four anthocyanin pigments were isolated from asparagus spears, Asparagus officinalis L., and identified by chromatographic, spectral, and chemical properties. The major pigment was a linear triglycoside, cyanidin-3-rhamnosylgluco-sylglucoside, followed by cyanidin-3-rhamnosylglucoside. The peonidin analogues of the above pigments were also present in minor quantities.     

Efficacy of recA gene sequence analysis in the identification and discrimination of Lactobacillus hilgardii strains isolated from stuck wine fermentations

Conventional phenotypic methods sometimes lead to misidentification of some heterofermentative wine lactobacilli such as Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus buchneri, and Lactobacillus brevis. We establish the specificity of 16S rDNA sequencing in the differentiation of these species and in the rejection of the Lactobacillus vermiforme species name. Moreover, we succeeded in differentiating these heterofermentative species by means of recA gene sequence comparison. Short homologous regions were amplified by PCR with degenerate consensus primers, sequenced, and 280 bp were analysed and considered for the inference of phylogenetic trees. The phylogram obtained was coherent and clearly separated the three species. The recA gene sequence was a reliable and useful method that allowed a good discrimination among closely related species. The validity of the recA gene sequence, restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of the PCR-amplified 16S-23S rDNA intergenic spacer region (ISR), and random amplified polymorphic DNA (RAPD) to study the L. hilgardii intraspecies heterogeneity was tested in five strains isolated from stuck wine fermentations at the same winery in the same vintage. The results indicated that L. hilgardii is a heterogeneous species. Since L. hilgardii is a malolactic species that can influence the final quality of the wine, the presence of oenological relevant genes, such as those involved in ethyl carbamate or biogenic amine production, was investigated.