食品中单核细胞增生性李斯特菌的快速分离鉴定

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌)是一种重要的食源性致病菌,能引起人畜共患李斯杆菌病。本文采用两种不同的增菌分离方法从散装牛奶和猪肉中共分离得到8株单增李斯特菌。通过革兰氏染色、生化鉴定、PCR扩增hlyA基因、16SrDNA测序、血清分型等一系列实验对可疑菌株进行分析鉴定。综合实验结果和其他单增李斯特菌分离标准,探讨开发了一种快速分离鉴定单增李斯特菌的方法,该方法可在4～5d内完成单增李斯特菌的分离检测过程。      

多方法分离鉴定食品中单核细胞增生李斯特菌

参加中国检验检疫科学研究院编号为ACAS-PT1343 (2022)的能力验证,该能力验证考核能否从人工污染的样品中检出单核细胞增生李斯特菌检验。对随机人工污染样品22-D378、22-G483进行单核细胞增生李斯特菌检验,采用国标法、酶联免疫法和荧光定量PCR技术3种检测方法,探讨食品中单核增生李斯特菌的快速检测及鉴定。试验结果表明,编号22-D378样品检出单增李斯特菌,22-G483未检出。在国标方法的基础上,辅助酶联免疫和荧光定量PCR技术进行检测,缩短了检测时间,特异性和敏感性均较好,3种方法互相补充可确保试验结果的准确性。     

鸡肉中单核细胞增生李斯特氏菌的分离与鉴定

对从长春地区一家最大的肉鸡屠宰加工厂扦取的152个冻鸡肉样品(44份去皮胸肉,44份带皮胸肉,40份胸碎肉和24份鸡翅)进行了单核细胞增生李斯特氏菌分析,对分离菌株用AP1 Listeria试剂盒及其它方法进行了鉴定。经检验,152个样品中有16个样品(10．5％)为单核细胞增生李斯特氏菌阳性,另有87个(57．2％)为L．innocua,L．welschimeri和L．gray阳性。在16个(10．5％)单核细胞增生李斯特氏菌阳性样品中,去皮胸肉样品3个(6．8％),带皮胸肉样品5个(11．4％),胸碎肉样品6个(15．0％),翅肉样品2个(6．3％)。为了比较OXA和PALCAM两种选择培养基的单核细胞增生李斯特氏菌的分离效果,在进行细菌分离时同时选用了这两种培养基,用OXA从152个样品的16个(10．5％)中分离出单核细胞增生李斯特氏菌,用PALCAM从152个样品的12个(7．9％)中分离出单核细胞增生李斯特氏菌,表明在OXA和PALCAM这两种分离培养基中,OXA的分离效果更好些。     

生肉中单核细胞增生性李斯特菌的分离与鉴定

目的了解哈尔滨市售生肉中单核细胞增生性李斯特菌的污染状况。方法将显色培养基法、API试剂条法和PCR法联合应用对哈尔滨市售128份生肉进行单核细胞增生性李斯特菌的分离鉴定。结果共分离出单核细胞增生性李斯特菌18株,检出率为14.06%。其中生猪肉检出率最高,达20.00%。结论哈尔滨市售生肉中单核细胞增生性李斯特菌污染状况比较严重,应引起有关部门的重视,加强管理和监测。     

牛乳中单核细胞增生李斯特菌的分离与鉴定

牛乳中单核细胞增生李斯特菌的分离与鉴定唐敏莉，刘敏娟，孙钊，黄金文（齐齐哈尔市卫生防疫站）前言李斯特菌是引起人、畜单核细胞增生的一种致病菌，已逐渐被人们注意，世界卫生组织１９８８年报告，在乳及乳制品、肉类、禽类等食品中均发现李斯特菌的存在［１］．近年...     

环介导等温扩增技术快速检测奶粉中的单增李斯特菌

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种在等温条件下特异、灵敏、快速的新型基因扩增技术。试验以单增李斯特菌为研究对象,根据其特有的hlyA基因设计了一套特异性引物,进行LAMP扩增。结果表明,LAMP检测单增李斯特菌的灵敏度为2.45×101cfu/mL,其对人工感染奶粉样品的检出限为7.32×101cfu/mL。对其它食品病原菌进行检测,结果均未出现目的条带,特异性强。表明LAMP法适合于食品中污染单增李斯特菌的快速检测。     

食品中单增李斯特菌快速检测技术研究进展

单核细胞增生性李斯特氏菌(简称单增李斯特菌)是一种广泛存在于自然界中可导致人畜共患病的病原菌, 同时也是一种常见的食源性致病菌。目前, 食品中单增李斯特菌的检测主要采用国标法, 传统检验方法虽然可操作性高, 但检验流程耗时过长。随着生活水平不断提高, 人们在饮食中摄入受单增李斯特菌污染的食品的风险增大, 如遇到食品安全突发事件, 传统检测不能及时得到检测结果, 无法保障人们的饮食安全。本文概述了基于分子生物学和免疫学发展起来的快速检测方法, 包括PCR法、实时荧光定量PCR法、环介导等温扩增法、酶联免疫吸附法、免疫层析试纸条, 其中环介导等温扩增法已经应用于食品致病菌的检测。通过分析对比以上快速检测方法, 为探索更灵敏高效且适用于基层食品检验的检测方法提供参考。     

基因探针快速检测食品中单增李斯特氏菌

应用AccuProbe基因探针方法快速检测食品中单增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes),结果表明,采用该基因探针方法检测食品中单增李斯特氏菌特异性强,对食品中单增李斯特氏菌鉴定时间仅需30min,采用增菌肉汤检测低限为7.5×107cfu/mL。对206个样品检测结果表明,AccuProbe基因探针方法可快速准确地检测食品中单增李斯特氏菌。     

用PCR技术快速检测食品中的单核细胞增生性李斯特菌

建立了食品中单核细胞增生性李斯特菌快速、敏感、特异的聚合酶链反应PCR检测方法.选择的引物具有良好的单增李氏菌种的特异性.对人工污染在冷冻食品中单增李氏菌的检测低限是4-8CFU/10g,对其增菌液的检测低限是7.2-11×103/ml,每PCR反应体系的检测低限为86-132CFU.对400份自然污染样品的检测结果显示,PCR方法的检测结果同常规培养法的结果完全相符.     

可视化跨越式滚环扩增技术检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

建立一种新型的单核细胞增生李斯特氏菌检测方法,即通过可视化跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术检测单核细胞增生李斯特氏菌.根据单核细胞增生李斯特氏菌hlyA基因序列设计引物,进行特异性验证,对灵敏度和人工污染样品的检出限进行测定.通过检测70种...     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌调查及毒力研究

为了解和掌握各类食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Lm)污染状况及菌株的毒力情况,采集5类265件食品,菌株鉴定应用API细胞鉴定系统;毒力测定采用溶血实验、多聚酶链反应（PCR）以及小鼠致病力实验的方法进行,结果显示Lm检出率为4.90%;其中从生肉、熟肉、灌汤和速冻食品中的检出率分别为15.00%、2.48%、9.52%;从熟肉和速冻食品中还检出其它李斯特氏菌,检出率分别为4.96%、5.92%;乳制品和水产品中未检出Lm。13株Lm毒力测定显示,溶血实验与小鼠的致病力和PCR测定的溶血素基因无必然联系,而溶血素基因与内化素基因阳性结果相同,Lm对多种抗生素敏感,其中对氨氨苄青霉素、头孢唑啉和环丙沙星敏感率为100%。     

免疫磁性糊精微球的制备及快速分离检测单增李斯特菌

研究免疫磁性糊精微球的制备及在快速分离检测单增李斯特菌中的应用。将磁性糊精微球由环氧氯丙烷活化后,与抗体交联制得免疫磁性糊精微球,通过单因素和正交试验对合成条件进行优化。再利用合成好的免疫磁性糊精微球捕获单増李斯特菌,在外加磁场的作用下,富集免疫磁性糊精微球,提取细菌DNA,经过PCR扩增后,进行琼脂糖凝胶电泳。结果表明:活化反应的最佳条件,环氧氯丙烷用量0.4 mL/g,NaOH浓度2.0 mol/L,最佳反应时间5 h;制备免疫磁性糊精微球的最优合成条件:抗体质量浓度1.0 mg/mL,反应温度28℃,反应时间2.5 h;捕获单增李斯特菌时,免疫磁性糊精微球的最佳用量100μL、最佳捕获时间1 h。通过研究得出免疫磁性糊精微球可以快速捕获单增李斯特菌,并能扩增出特异性产物,检出限达到每mL菌液中10个单增李斯特菌。     

食品中单核细胞增生李斯特菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立

基于单核细胞增生李斯特菌胞壁质水解酶iap基因,设计两对特异性引物,利用DNA环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以扩增副产物焦磷酸镁实时浊度为判定标准,建立食品中单核细胞增生李斯特菌LAMP快速检测方法。结果显示,本LAMP方法特异性强,经过对29株细菌进行检测,所试单核细胞增生李斯特菌均为LAMP阳性,其他菌株为阴性;本LAMP方法对单核细胞增生李斯特菌纯培养菌的检测灵敏度为8CFU/管,对污染食品中单核细胞增生李斯特菌的检测灵敏度为12CFU/管。本研究建立的LAMP检测方法简便快速、结果判断直观。     

单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光RPA检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种快速检测单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)的实时荧光重组酶聚合酶扩增(real-time RPA)方法。基于LMhly A基因保守序列,设计合成特异性RPA引物和exo探针,所建立的LM real-time RPA方法能够在37℃等温条件下20 min内完成扩增。该方法仅对LM基因组DNA为阳性扩增,对其它20种致病菌基因组DNA的扩增均为阴性;以LM纯培养菌液的基因组DNA进行10倍列梯度稀释,并以之作为模板,其灵敏性可达到5×10-1 pg,与实验室已建立的real-time PCR方法一致。人工污染实验中,对于LM接菌量为3 CFU/25 g的羊肉和生菜样品,增菌14 h即可通过建立的real-time RPA方法检出,与传统培养方法和real-time PCR检测结果均一致,但是前者所需时间明显少于后者。本文建立的LM real-time RPA方法特异性强,灵敏性高,操作简单,反应迅速,并能够摆脱对价格昂贵的荧光PCR仪和专业实验室的需求,可应用于食品突发事件中LM的现场快速检测,对保障我国食品安全具有重要意义。     

一种快速鉴定单增李斯特菌的方法

通过单增李斯特菌的生化特性对李斯特菌进行鉴定,并根据单增李斯特菌的actA基因序列,以及其他李斯特菌的特异性靶序列设计引物,用PCR技术快速鉴定单增李斯特菌.结果表明,生化实验时间较长且误差较大,而通过PCR能成功扩增出827bp的特征性条带,同时用CTAB/NaCI法和热裂解法分别提取基因组后进行PCR和电泳,结果两种方法都可以很好的扩增出特征性条带,而热裂解法由于更简便快速,实验确定了热裂解法是一种快速有效的鉴定单增李斯特菌的方法.     

单增李斯特菌反转录环介导等温扩增检测方法的建立

本研究针对单增李斯特菌的快速检测方法进行开发,首先根据单增李斯特菌hly A基因序列保守区设计2对引物,在同一体系中对单增李斯特菌的RNA进行反转录及环介导等温扩增,同时使用羟基萘酚蓝(终浓度200μM)作为反转录环介导等温扩增产物的指示剂,在不开盖进行凝胶电泳检测的情况下,可直接根据体系颜色变化判读结果,能够在20 h内(包括增菌时间)检测出样本中是否存在单增李斯特菌的RNA。本研究建立的RT-LAMP-HNB检测方法对单增李斯特菌RNA的检出限为5.8×10~(-3)μg/m L,起始接种浓度检出限为10 CFU/10 mL,灵敏度是RT-PCR的10倍,且能够检测出是牛奶中否存在的单增李斯特活菌,具有实际应用价值。本研究开发的检测方法具有快速、准确、便捷、灵敏度高等特点,适用于在基层或不便利地区推广使用。     

应用PCR技术快速测定食品中单核细胞增生李斯特菌毒力

目的：采用PCR 技术准确、快速测定单核细胞增生李斯特菌(单增李斯特氏菌)分离株的毒力基因,鉴别强毒株和弱毒株或无毒株,以有效地限制李斯特氏菌病的传播。方法：以单增李斯特氏菌相关毒力基因(hly、plcB、inlA、inlB、inlC、inlJ、prfA)设计引物,检测重庆市2007 - 2009 年分离的40 株单增李斯特氏菌分离株中的毒力基因携带率,并进行小鼠毒力实验。结果：40 株分离株中有15 株7 种毒力基因检测结果均为阳性,6 株hly 基因阴性,4 株plcB 基因阴性,4 株prfA 基因性,5 株inlA、inlB 基因阴性,11 株inlC 基因阴性,9 株inlJ基因阴性,1 株inlA、inlB、inlC、inlJ 基因均为阴性。4 株分离株的毒力与标准菌株ATCC191161E 相当,小鼠LD50 在1.2 × 108～6.0 × 108CFU/mL 之间,为强毒株。筛选出弱毒株09-132,LD50 为1.7 × 1011CFU/mL。结论：重庆市存在发生李斯特菌食物中毒的潜在危险,内化素基因(inlA、inlB、inlC、inlJ)的缺失可能是导致菌株毒力降低的原因,而prfA 和plcB 基因与菌株毒力的相关性较小。     

食品中单核细胞增生单核细胞增生李斯特菌的重组酶聚合酶扩增检测方法的建立

目的 建立食品中单核细胞增生李斯特菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)检测体系。方法 针对单核细胞增生李斯特菌的特异性基因hlyA,筛选出一组特异性强且高效的引物,建立单核细胞增生李斯特菌的RPA检测体系,并进行特异性、灵敏度检测。结果 建立的RPA方法在37 ℃恒温反应仅需30 min,能够特异地检测单核细胞增生李斯特菌,最低模板浓度可低至0.5 ng/μL。人工染菌试验显示,该RPA体系可以有效扩增出每2.5 g样品中人工染菌10⁴ CFU样品中的单核细胞增生李斯特菌。结论 RPA等温扩增方法特异较强、灵敏度较高,具有操作简便、不需要昂贵仪器、常温进行扩增反应等优点,适用于现场检测以及在基层实验室推广应用。     

二烯丙基二硫醚对单增李斯特菌毒力基因表达的影响

二烯丙基二硫醚(DADS)是一种典型的硫醚类香料。该类香料在抗菌消炎,提高机体免疫力,预防和治疗心血管疾病等保健及药理作用方面具有显著效果。而对其在食源性致病菌中的抑制作用及相关机理研究较少。四大食源性致病菌之一单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)容易感染食物而引发脑膜炎、败血症及孕妇流产等一系列恶性疾病。本研究以如何高效抑制单增李斯特的生长为出发点,以DADS为研究对象,采用微量肉汤稀释法初步筛选出其对单增能李斯特菌的最小抑菌浓度(MIC),利用RT-qPCR技术考察其对单增李斯特菌毒力基因inlA、hlyA、prfA表达的影响。结果表明:亚抑菌浓度下DADS均可显著抑制毒力基因inlA、hlyA、prfA的表达,且抑制作用呈现一定的浓度依赖性,hlyA及prfA对其作用更敏感。