用中国仓鼠卵巢细胞构建内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶筛选系统

糖苷水解酶85家族的内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶具有糖基转移酶活性,利用该类酶,可以合成特定结构N-糖链修饰的糖基化复合物。为构建糖基转移酶筛选系统,将N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的跨膜定位区域与绿色荧光蛋白融合表达,成功把带有天冬酰胺连接糖基化位点的单体增强绿色荧光蛋白定位到中国仓鼠卵巢细胞的高尔基体中。流式细胞仪分析显示,融合了定位区域后,绿色荧光蛋白仍可以发出荧光,且在引入糖基化位点后,细胞荧光强度约降低10倍。经衣霉素处理,细胞糖基化被抑制,同时荧光强度减弱。此细胞株荧光强度对于糖基化水平的依赖性表明其在糖基转移酶的进化筛选方面的应用潜力。     

右旋糖苷蔗糖酶的研究进展

右旋糖苷蔗糖酶(dextransucrase)是一种典型的葡萄糖基转移酶,可利用蔗糖为底物合成右旋糖苷,而后者在医药、食品等领域用途广泛。从酶的来源、产量优化、制备方法和活性检测的角度总结右旋糖苷蔗糖酶的研究进展,并对其发展趋势进行的展望。     

不同环境因子对海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkoniiHZ引导糖基转移酶基因表达的影响

为了研究海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ所产多糖的生物合成基因簇,首先需要克隆到在多糖合成中起关键作用的引导糖基转移酶基因。通过设计引物,采用PCR技术从海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ成功克隆到该基因,并通过实时荧光定量PCR技术检测了温度、p H及海盐浓度对引导糖基转移酶基因表达量的影响。结果表明:低温有利于引导糖基转移酶的表达,随着温度的上升,引导糖基转移酶基因的表达量先增后减,在20 h时,引导糖基转移酶的表达量急剧上升,15℃和35℃引导糖基转移酶表达量分别是20℃表达量的5.2倍、5.8倍;海盐浓度为4.5%时引导糖基转移酶的表达量为海盐浓度3.5%的2.5倍,海盐浓度为5.5%时引导糖基转移酶的表达量为海盐浓度3.5%的2.0倍;10 h时p H为8、9的培养基中引导糖基转移酶的表达量分别为p H为7的1.64和1.67倍。该结果为探究菌体环境适应性机制提供了一定的基础。     

地杆菌α-L-岩藻糖苷酶的分子改造及其在合成2’-岩藻糖基乳糖中的应用

对地杆菌α-L-岩藻糖苷酶进行分子改造，以提高其酶法合成2’-岩藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）的转化效率。利用易错聚合酶链式反应构建了α-L-岩藻糖苷酶的突变体文库，筛选得到一个合成2’-FL转化率提高的突变酶（mPbFuc29A1）。酶学性质研究结果表明mPbFuc29A1的最适pH值和温度分别为pH 5.0和40 ℃，最适温度较野生型PbFuc29A1提高了5 ℃；突变酶水解2’-FL的比活力提高到3 倍，但是水解4-硝基苯基-α-L-岩藻糖苷（4-nitrophenyl-α-L-fucopyranoside，pNP-FUC）和3’-岩藻糖基乳糖（3’-fucosyllactose，3’-FL）的比活力分别降低了22.8%和52.5%。以pNP-FUC和乳糖为底物，采用mPbFuc29A1酶法催化合成2’-FL和3’-FL，转化率分别为23.6%和56.4%，其中2’-FL的转化率较PbFuc29A1提高了9.1%。通过序列及定点突变分析发现mPbFuc29A1的氨基酸序列中有2 个位点发生突变（Asp21Val和Glu266Lys），其中位于loop区的Glu266Lys可能是mPbFuc29A1底物特异性和转糖苷产物组成发生改变的关键。优良的酶学特性使mPbFuc29A1在2’-FL合成中具有较大的应用潜力。     

糖苷酶的特性与应用

介绍了糖苷酶的作用机制,综述了糖苷水解酶在催化寡糖合成、烷基糖苷和芳香醇合成以及生物大分子糖基化中的应用,还介绍糖苷酶的生物法制备.     

红花钓钟柳中新型糖基转移酶的筛选与鉴定

苯乙醇苷类化合物因具有抗氧化、抗肿瘤等生理活性在食品、医药等领域备受关注。糖基转移酶作为生物催化剂可用于各种糖苷产物的制备。为丰富苯乙醇苷类化合物的糖苷多样性,在红花钓钟柳转录组中筛选糖基转移酶候选基因并进行功能鉴定。该研究基于不同植物组织中基因差异表达分析筛选到7条候选基因,将其克隆到pET-MBP表达载体上,并导入大肠杆菌Escherichia.coli Transetta (DE3)异源表达后利用体外酶促反应进行其生物催化活性研究。获得一个新型糖基转移酶UGT712A2,可以催化桂叶苷B C4-OH的葡萄糖基化反应生成新的苯乙醇苷类化合物桂叶苷B-4-葡萄糖苷。同时,UGT712A2也可以催化毛蕊花糖苷、芦丁、胡黄连苷Ⅱ、7-去甲基软木花椒素等化合物的糖基化,具有一定的底物宽泛性。因此,UGT712A2可能是一种潜在的酶工具,用于苯乙醇苷类化合物和其他多种新型糖苷产物的制备,从而发现新的糖苷化合物应用于食品、医药领域。     

以卤代糖为原料合成糖苷的方法述评

综述了近年来以溴代糖、氟代糖和碘代糖作为糖基供体合成糖苷的方法.指出这些卤代糖作为糖基供体的优点是合成的产物为纯净的O-苷,收率高,主要为β-构型;缺点是反应条件苛刻,需严格无水、避光条件,重金属盐催化剂比较贵而且有很大的毒性,溴代糖在常温下极不稳定,不易长期保存.因此,探索新型的卤代糖衍生物、实现立体专一性的合成糖苷,探索绿色合成条件、避免使用重金属盐,是该领域未来研究的方向.     

体外偶联UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶 高效催化合成莱鲍迪苷A

本研究构建了UDP-糖基转移酶UGT76G1基因的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-UGT76G1和绿豆来源的蔗糖合成酶(mbSUS)基因的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K/pPICZA-mbSUS。通过甲醇诱导产酶,制备UDP-糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶,并构建生物催化级联反应体系,生物催化甜菊糖苷(Stevioside,ST)合成莱鲍迪苷A(rebaudioside A,RA),有效实现了级联反应体系中尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的循环利用。本研究通过反应条件优化,发现级联反应中的限速酶是糖基转移酶UGT76G1,添加酶活比例为U_((UGT76G1)):U_((mbSUS))=6:1为合成莱鲍迪苷A的最佳酶活比例,在pH7.0,UDP浓度1mM,蔗糖浓度50mM,MgCl_2浓度3 mM的反应条件下,10 mM ST转化合成8.20±0.11 mM RA,RA的产率达到82.91%,与在大肠杆菌表达系统中相比,极大缩短了催化反应时间。利用体外偶联UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶催化合成RA为酶法高效生物合成RA及其产业化应用提供技术支持。     

α-葡萄糖苷合成酶的制备及其合成低聚糖的研究

一种新型的合成低聚糖的方法是利用来自于嗜热古菌Thermotoga neapolitana的α-葡萄糖苷酶及其突变后形成的糖苷合成酶。这种糖苷合成酶的构建是在糖苷酶催化中心亲核体氨基酸位点用非亲核体氨基酸取代亲核体氨基酸,从而使糖苷酶水解活性丧失,只具有糖苷合成能力,使寡糖的合成量增加。此糖苷合成酶合成寡糖过程是利用氟代吡喃葡萄糖作为供体,麦芽糖作为受体,产物为麦芽三糖。产物用HPLC进行分析,然后通过正交试验对合成低聚糖反应条件进行优化,得到最适加酶量为0.06 mg/mL,最适底物浓度为35 mmol/L,最适反应时间为6 h。     

甜菊糖苷的生物合成途径与生物转化制备策略的研究概述

甜菊糖苷(steviol glycosides,SGs)是从甜菊叶片中提取的天然甜味剂,具有低热量、高甜度的特性,可作为食品和医药添加剂。在植物体内,通过甲基赤藓糖醇途径合成的异戊烯焦磷酸能够转化成甜菊醇。甜菊醇在各类UDP-糖基转移酶作用下,糖基化生成各类SGs。在SGs生物合成途径基础上,通过生物转化方法合成相关酶,改善了SGs的味质。文中就其生物合成途径和生物转化制备策略的研究现状进行了综述。