陈皮中川陈皮素的提取分离及改性

以陈皮中川陈皮素的提取、分离纯化以及改性为目的,采用无水乙醇浸提陈皮得浸膏,以氯仿为萃取剂萃取浸膏,得到多甲氧基黄酮混合物,再以硅胶为吸附剂、乙酸乙酯和石油醚的混合液为洗脱剂,采用柱色谱法分离多甲氧基黄酮化合物,经高效液相色谱和气相色谱-质谱检测并与标准品对比,最终确证得到川陈皮素纯品。研究从川陈皮素到5-去甲基川陈皮素的合成路线,优化了改性条件,在浓盐酸与无水乙醇体积比为1∶9条件下,将川陈皮素加热回流反应24 h,可以得到纯度大于97%的5-去甲基川陈皮素。     

正相柱色谱法分离制备陈皮中橘皮素和川陈皮素

该实验建立一种从陈皮中分离制备高纯度橘皮素和川陈皮素的方法。选用陈皮作为原料,先用无水乙醇浸提,得陈皮粗提物Ⅰ,然后依次用正己烷和二氯甲烷萃取,得到陈皮粗提物Ⅱ。再以硅胶为吸附剂,乙酸乙酯-石油醚为洗脱剂,探究橘皮素和川陈皮素的最佳分离条件,在最优分离条件下得到橘皮素和川陈皮素两种单体。该法所得的橘皮素和川陈皮素单体,经高效液相色谱（HPLC）法峰面积归一化法计算其纯度均≥98%,并采用质谱（MS）法对其结构进行了确证。     

AB-8大孔吸附树脂精制芦柑皮总黄酮及黄酮类化合物的分离

目的：研究AB-8大孔吸附树脂精制芦柑皮总黄酮的工艺条件及芦柑皮黄酮类化合物的分离纯化。方法：采用AB-8大孔吸附树脂动态法精制芦柑皮总黄酮,考察上样液总黄酮质量浓度、pH值、上样流速、洗脱液乙醇体积分数对吸附解吸性能的影响;然后将精制的芦柑皮总黄酮经硅胶柱层析、半制备高效液相等技术进行分离纯化,并根据理化性质和波谱数据鉴定化学结构。结果：AB-8大孔树脂精制芦柑皮总黄酮的最佳工艺条件为上样液总黄酮质量浓度3.03 mg/mL、上样液pH 3.0、上样流速3.0 BV/h、洗脱液乙醇体积分数为90%,最优条件下可使芦柑皮总黄酮的纯度从17.8%提高到63.1%;此外,从精制的芦柑皮黄酮中分离到8 个黄酮类化合物,分别鉴定为：橘皮素、川陈皮素、4’,5,7,8-四甲氧基黄酮、5-去甲基-橘皮素、橙黄酮、橙浸膏、柚皮苷、橙皮苷。结论：AB-8大孔树脂能很好地富集纯化芦柑皮总黄酮,该法简单、可行;从精制的芦柑皮黄酮中分离到8 个黄酮类化合物,其中,4’,5,7,8-四甲氧基黄酮、5-去甲基-橘皮素、橙浸膏、柚皮苷、橙皮苷首次从芦柑皮中分得。     

高速逆流色谱分离制备橘皮中多甲氧基黄酮

建立高速逆流色谱法分离制备橘皮中4种多甲氧基黄酮类化合物的方法。以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶0.8∶1∶1.2,V/V)为两相溶剂系统,上相为固定相,下相为流动相。在主机转速800 r/min、流动相流速2.0 m L/min、检测波长254 nm条件下分离,从200 mg橘皮粗提物中一步分离制备得到5,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黄酮32.8 mg、3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮10.9 mg、5,6,7,8,4’-五甲氧基黄酮43.5 mg和5-羟基-6,7,8,3’,4’-五甲氧基黄酮18.7 mg。产物纯度经HPLC检测分别为98.9%,97.8%,99.2%和99.8%。通过质谱和核磁共振氢谱、碳谱等波谱分析确定各化合物结构。     

染料木黄酮抑制3T3-L1细胞成脂分化机制

目的：研究染料木黄酮是否通过雌激素受体介导影响3T3-L1前脂肪细胞成脂分化,并探讨其可能的机制。方法：以不同浓度染料木黄酮处理3T3-L1细胞,四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法测定细胞存活率;在3T3-L1前脂肪细胞成脂分化过程中分别加入不同浓度染料木黄酮、染料木黄酮和ICI182780（一种雌激素受体抑制剂）混合物及不同浓度雌二醇,油红染色观察分化结果,测定细胞甘油三酯（triglyceride,TG）含量;染料木黄酮、染料木黄酮和ICI182780混合物及不同浓度雌二醇处理诱导成熟后的脂肪细胞,测定培养液甘油含量;分别用染料木黄酮（30 μmol/L）、染料木黄酮（30 μmol/L）和ICI182780混合物干预细胞成脂分化,Western blotting法检测细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）、p-ERK、腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK）、p-AMPK、激素敏感性脂肪酶（hormone sensitive lipase,HSL）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase,FAS）蛋白表达量。结果：3T3-L1细胞存活率随染料木黄酮浓度的升高而降低,50～200 μmol/L染料木黄酮能抑制细胞生长（P＜0.01）;染料木黄酮能负向调节成脂分化后细胞胞浆内TG含量,在0～50 μmol/L浓度范围内呈剂量依赖关系,高剂量雌二醇（100 nmol/L）能下调TG含量;染料木黄酮能促进成熟脂肪细胞脂解,提高细胞培养液甘油浓度;染料木黄酮（30 μmol/L）能上调p-AMPK、HSL蛋白表达,下调FAS蛋白表达（P＜0.01）,对ERK、p-ERK、AMPK表达量无明显影响（P＞0.05）。ICI182780（1 μmol/L）能部分阻断染料木黄酮（30 μmol/L）对p-AMPK的调节作用（P＜0.05）。结论：染料木黄酮能抑制3T3-L1细胞成脂分化,其机制可能是染料木黄酮一方面下调FAS蛋白表达,抑制脂肪合成,另一方面激活AMPK-HSL途径促进脂肪分解;染料木黄酮还可能通过非雌激素受体途径抑制3T3-L1细胞成脂分化。     

大豆及丹贝异黄酮对乳腺癌、子宫癌和卵巢癌癌细胞的抑制效应

用分离纯化的大豆和丹贝异黄酮的5个单位Genistein.Daidzein.Glycitein.Genistin.Daidzin分别作用于乳腺癌MCF-7细胞株、子宫癌Hela细胞株和卵巢癌H0-8910细胞株,研究各单位对各种癌细胞株的抑制率和IC50值.结果Genistein在1.00E-04(mol/L)时对乳腺癌MCF-7细胞株抑制率为63%;IC50=8.47E-05,对子宫癌Hela细胞株的抑制率为58.04%;IC50=9.45E-05,对卵巢癌HO-8910细胞株的抑制率为67.70%;IC50=8.87E-05,Daidzein在1.00E-04(mol/L)浓度时对卵巢癌HO-8901细胞株的抑制率为67.70%;IC50=2.62E-05.     

昆仑雪菊结合型黄酮类化合物的分离与鉴定

昆仑雪菊结合型黄酮类化合物因与细胞壁以共价键结合,难以直接用溶剂萃取出来。本研究采用碱降解法使结合型化合物释放出来并优化降解条件,在此基础上,利用不同溶剂对降解产物进行提取筛选出最佳的溶剂得到粗提物,利用常压硅胶柱层析和SepdexLH-20凝胶柱层析对粗提物中的黄酮类化合物进行分离纯化得到单体化合物,采用Fe3+还原/抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power,FRAP）法、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl,DPPH）法及2,2’-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2’-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）,ABTS）法对单体化合物进行抗氧化活性评价。结果表明：最佳的碱降解时间2 h、温度50 ℃、NaOH浓度2 mol/L,最佳提取溶剂为正丁醇;从粗提物中分离得到2 个单体化合物,采用核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）和电喷雾质谱（electrosprayionization mass spectra,ESIMS）鉴定其化学结构分别为金鸡菊查尔酮-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖（化合物1）、3’,4’,7,8-四羟基二氢黄酮（化合物2）;活性测定结果表明两个化合物的总抗氧化能力均强于阳性对照VE,化合物1与化合物2对DPPH自由基的半数抑制率IC50分别为（17.29±0.17）μmol/L和（70.09±0.09）μmol/L、对ABTS＋·半数抑制率IC50分别为（22.86±0.21）μmol/L和（33.4±0.18）μmol/L,远低于阳性对照VE的IC50值（分别为（78.08±1.63）μmol/L和（38.54±0.42）μmol/L）,说明两个化合物均有很强的抗氧化活性。     

发酵乳中血管紧张素转换酶抑制剂的分离与鉴定

用瑞士乳杆菌生产具有抑制血管紧张素转换酶(ACE)活性的发酵乳并从其中分离血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)。脱脂乳经灭菌后,接种4%(V/V)的发酵剂,37℃培养24h,获得抑制ACE活性较高的发酵乳。对此发酵乳的乳清进行超滤、上海732阳离子树脂交换、SephadexG-15凝胶过滤和HPLC分步纯化,最终得到两种起主要作用的ACEI肽。经氨基酸分析和液相-质谱分析,这两种肽的氨基酸序列分别为:Phe-Pro(IC50:12.05μmol/L)和Ala-Glu-Glu(IC50:12.42μmol/L)。     

抗赭曲霉素A单克隆杂交瘤细胞系的建立及特性

为快速检测食物中的赭曲霉素A ,建立了抗OchratoxinA的单克隆杂交瘤细胞株。用OA -匙孔嘁血蓝素 (OA KLH)偶联物免疫 8～ 10周龄雌性Balb c小鼠后 ,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2 0融合 ,经过 3～ 4次亚克隆建立了 3个稳定分泌抗赭曲霉素A抗体的杂交瘤细胞株 ,分别命名为 10G7、10G10和 5G11。将上述 3株杂交瘤细胞分别注入Balb c小鼠腹腔 ,获得含抗赭曲霉素A单克隆抗体的腹水。将腹水用饱和硫酸铵法纯化 ,得到 10G7、10G10和 5G11单克隆抗体。其中10G10、5G11单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,10G7单克隆抗体的Ig亚类为IgG2a。抗体腹水的稀释度为 1∶6 4× 10 6～ 1∶1 3× 10 8,参考工作浓度为 1∶1 0× 10 6～ 1∶3 2× 10 7。纯化后 10G7抗体的IgG含量为 16 4g L ,亲和常数为 9× 10 -8mol L。 10G7抗体与其它结构类似物无交叉反应 ,具有较高的特异性。     

衍生电化学法测定橘皮中的咪酰胺

采取简便的衍生电化学法灵敏地测定橘皮中的咪酰胺。用丙酮和乙酸乙酯分别萃取橘皮中的咪酰胺,然后用吡啶盐酸盐对其进行水解,使没有电化学活性的咪酰胺生成具有电化学活性的2,4,6-三氯苯酚。在优化实验条件(pH4.0,富集电位和富集时间分别是0V和300s)下,运用差示脉冲溶出伏安法建立测定橘皮中咪酰胺含量的新方法。进一步实验结果表明,2,4,6-三氯苯酚氧化峰电流与其浓度在9.0×10-9～8.0×10-5mol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为9.7×10-10mol/L,回收率为98.5%～113.0%。     

应用前沿亲和色谱评价5 种知母糖苷类化合物的α-淀粉酶抑制活性

以硅胶为载体,制备α-淀粉酶亲和色谱柱,以线扫循环伏安法为检测方法,评价知母提取物的α-淀粉酶抑制活性。首先考察固定化条件对固定化酶的影响以及亲和色谱柱的稳定性。其次利用前沿亲和色谱检测5 种知母糖苷类化合物（新芒果苷、芒果苷、知母皂苷AⅡ、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ）的α-淀粉酶亲和力。最后检测化合物的α-淀粉酶抑制活性。结果表明5 种化合物的α-淀粉酶结合力大小排序为：新芒果苷（Kd＝0.230 5 μmol/L）＞芒果苷（Kd＝0.299 5 μmol/L）＞知母皂苷BⅡ（Kd＝0.312 4 μmol/L）＞知母皂苷BⅢ （Kd＝0.316 2 μmol/L）＞知母皂苷AⅡ（Kd＝0.453 3 μmol/L）,其排序结果与样品的α-淀粉酶抑制活性一致。说明前沿亲和色谱可以用来定量检测化合物的α-淀粉酶抑制活性,且可根据亲和力的大小将化合物的抑制活性进行排序。     

外源L-Arg处理对蜜橘果实贮藏品质的影响

用100、200 μmol/L外源L-精氨酸（L-arginine,L-Arg）溶液浸泡处理蜜橘果实10 min,探讨该处理对采后蜜橘果实贮藏品质的影响。结果表明,适宜浓度（200 μmol/L）的外源L-Arg处理可以有效抑制蜜橘果实黄化,在一定程度上抑制果皮细胞膜透性的增加;在贮藏的前28 d内,L-Arg浸泡处理能够维持果实可溶性固形物的含量;各处理组之间的呼吸速率没有显著性差异,适宜浓度（200 μmol/L L-Arg）的L-Arg浸泡处理能够在一定程度上抑制蜜橘果实质量损失率的增加;延缓果实总酚、抗坏血酸含量的减少,贮藏前期（0～21 d）处理组果实果肉类黄酮含量与对照组之间无显著差异,贮藏后期（28～35 d）处理组果实类黄酮含量显著低于对照组果实。即200 μmol/L外源L-Arg处理能够在一定程度上有效延缓采后蜜橘果实的衰老和品质下降。     

果汁原浆中葡萄糖含量测定的酶电极设计

利用易于制备的水不溶性普鲁士蓝制备了介体掺入式丝网印刷电极,并以该电极作为电化学换能器制备葡萄糖氧化酶电极。电化学表征结果显示,酶电极对葡萄糖的电流响应特征良好,其线性范围为8.0 μmol/L～2.2 mmol/L,检测限达0.082 7 μmol/L（RSN=3）,灵敏度为1.016 μA·L/mmol,响应时间5 s,其抗干扰性能、稳定性及重复性良好。实验还确定了该酶电极的最佳制备配方及工作条件。该电极制作简单、廉价,适用于成分复杂的果汁原浆的快速分析测试。     

壬基酚致NCTC1469细胞的损伤作用及活性氧水平、谷胱甘肽含量变化

目的：探究壬基酚对NCTC1469细胞的损伤作用及细胞内活性氧类、还原型谷胱甘肽含量的影响。方法：通过体外细胞实验,用不同质量浓度壬基酚作用NCTC1469细胞24 h;CCK-8法检测细胞存活率;测定药物作用后培养液上清中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）和谷草转氨酶（aspartate transaminase,AST）活性及细胞内还原型谷胱甘肽含量;流式细胞仪检测细胞内活性氧类水平。结果：壬基酚可显著抑制NCTC1469细胞增殖及促进活性氧类生成（P＜0.05）,呈一定剂量依赖性;培养液上清液中LDH、ALT活性在壬基酚浓度大于0.1 μmol/L处理组中,与自然释放对照组相比显著升高（P＜0.05）;且壬基酚在高剂量（1、10、100 μmol/L）能明显增加培养液上清中AST活性（P＜0.01）;壬基酚呈剂量依赖性降低细胞内还原型谷胱甘肽含量,与空白对照组比较有显著差异（P＜0.05）。结论：推测壬基酚可能通过上调细胞内活性氧类水平,下调胞内还原型谷胱甘肽含量,引起氧化应激反应,从而对NCTC1469细胞产生损伤作用。     

褪黑素处理对盐胁迫下番茄果实品质及挥发性物质的影响

以“金棚1号”番茄为材料,研究在150 mmol/L NaCl胁迫下施加不同浓度褪黑素对番茄果实产量、品质及挥发性物质含量的影响。结果表明：在施加50、100 μmol/L褪黑素处理下,可以显著提高番茄果实中可溶性糖、可溶性固形物、VC、β-胡萝卜素含量,降低果实中有机酸和硝酸盐含量。相比于单纯盐胁迫处理,果实品质更好。利用顶空固相微萃取技术,对各处理进行气相色谱-质谱检测,分析各处理组番茄果实挥发性物质成分和含量。结果表明,胁迫处理提高了果实挥发性物质总含量,而施加不同浓度褪黑素会进一步提高挥发性物质含量,其中在50 μmol/L褪黑素处理下,其含量最高。综上,在利用褪黑素缓解番茄盐胁迫时,施加浓度为50～100 μmol/L的褪黑素能够提高果实品质、增强果香,效果最佳。     

血根碱清除自由基及抑制生物大分子氧化的作用

目的：评价血根碱的体外抗氧化活性,为血根碱作为天然抗氧化剂的应用提供理论依据。方法：采用DPPH自由基清除法测定血根碱的体外抗氧化能力;采用Cu2+/H2O2和AAPH体系诱导牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）氧化损伤和羰基化损伤模型,研究血根碱对上述损伤的保护作用;采用TBA法分别测定血根碱对FeSO4诱导的大豆卵磷脂氧化损伤的抑制作用,及AAPH诱导的鲱鱼精DNA氧化损伤的抑制作用。结果：血根碱可有效清除DPPH自由基,且呈浓度依赖性,在100 μmol/L时清除率为85.94%;1～100 μmol/L的血根碱可显著保护Cu2+/H2O2及AAPH体系诱导的BSA损伤;10～100 μmol/L的血根碱可显著保护由Cu2+/H2O2体系诱导的BSA蛋白羰基化,当浓度为0.1～100 μmol/L时可显著保护由AAPH诱导的BSA蛋白羰基化;血根碱浓度在6.25～100 μmol/L范围内均可显著抑制由FeSO4及AAPH诱导的大豆卵磷脂及鲱鱼精DNA的氧化损伤。结论：血根碱可有效清除自由基及保护蛋白氧化损伤和羰基化损伤,亦可显著抑制脂质及DNA氧化损伤。     

鸭肝乳酸脱氢酶的分离纯化及部分性质研究

新鲜鸭肝经匀浆、磷酸盐缓冲液抽提,乙醇和硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的乳酸脱氢酶。该酶经纯化后酶比活力达到668.82 U/mg,酶活回收率为25.79%,纯化倍数为185.78。该酶的全分子质量约为170.93 kD,亚基分子质量为44.72 kD;最适反应温度为45 ℃,最适pH值为7.4,在25～45 ℃及pH 5～10的范围内稳定性较好;在45 ℃、pH 7.4条件下,测得该酶对底物还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid,NADH）的Km值为3.407 μmol/L,对丙酮酸钠的Km值为8.431 μmol/L;草酸、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）、Cu2＋、Ag＋对该酶的抑制作用最强,Co2＋、K＋对该酶有双重作用,低浓度时有激活作用,而高浓度时具有抑制酶活性的作用。     

牛胰脏组织蛋白酶L的纯化和酶学性质

新鲜牛胰脏匀浆物经酸化粗提后,再通过盐析、柱层析等步骤纯化,制备了0.58 mg纯酶,纯化倍数达530.54。经凝胶电泳分析,该酶有2 个亚基,分子质量为29.1 kD和18.9 kD。牛胰脏组织蛋白酶L的最适反应温度为50 ℃,最适反应pH值为6.5。巯基还原剂二硫苏糖醇、L-半胱氨酸均明显激活了该酶活性,10 μmol/L的N-（反式-环氧丁二酰基）-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺（E-64）可完全抑制其活性。1 mmol/L的Zn2＋对酶活性有明显抑制作用。该纯化酶可水解苄氧羰基-苯丙氨酰-精氨酰-甲基香豆素（Z-Phe-Arg-MCA）,其Km值为3.52 μmol/L。     

电化学法对苦荞茶中芦丁含量的测定

采用循环伏安法和差分脉冲伏安法研究芦丁在活化电极上的电化学行为。分别用0.5 mol/L硫酸溶液对玻碳电极进行酸法循环伏安处理和酸法恒电位极化处理,用1 mol/L NaOH溶液对玻碳电极进行碱法循环伏安处理和碱法恒电位极化处理使电极活化。对比4 种不同的玻碳电极活化方法,结果发现经过1 mol/L NaOH溶液恒电位极化法处理的玻碳电极活化效果好;使用该活化电极考察芦丁的电化学行为,发现在pH值为2的布列顿-罗宾逊缓冲液中,芦丁在活化玻碳电极上的电化学响应较好,产生一对主要的准可逆的氧化还原峰,氧化还原过程涉及2 电子及2 质子。使用差分脉冲伏安法测得氧化峰电流在0.6～10 μmol/L的范围内与芦丁浓度呈良好的线性关系,最低检出限为0.08 μmol/L,依此建立芦丁含量的测定方法。该方法简便、灵敏、重复性较好,应用此法能够成功分析苦荞茶中芦丁的含量。