毒死蜱残留检测间接竞争ELISA 试剂盒的研制

在多克隆抗体的基础上研制一种适用于检测样品中毒死蜱残留的间接竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒,并对试剂盒的灵敏度、特异性、精密度、准确度和有效期进行测定。结果表明,研制的试剂盒最低检测限为0.5μg/L,线性检测范围为1.8～1000μg/L,供试样品检测结果的批内、批间变异系数均低于8%,回收率均高于85%。试剂盒在4℃或－ 20℃条件下至少可保存6 个月。     

鳗鱼中恩诺沙星残留量的酶联免疫检测方法

运用酶联免疫分析方法测定鳗鱼中恩诺沙星残留。测试曲线线性范围为0.3～10μg/kg,最低检测限为3μg/kg。向样品中分别添加25、50、100μg/kg 3个浓度水平的恩诺沙星, 平均回收率分别为74.5%、76.6%和66.5%,批内变异系数为7.62%～14.31%,批间变异系数为6.03%～7.00%,灵敏度达到0.3μg/kg。特异性试验结果表明与喹诺酮类中的其它药物以及其它类抗生素均无交叉反应。     

吗啡及可待因酶联免疫检测方法的研究

通过对吗啡分子结构进行改造,制备了吗啡半抗原及人工抗原,通过免疫动物得到了吗啡的单克隆抗体,建立了吗啡及可待因间接竞争酶联免疫检测方法。该方法对火锅底料和辣椒酱的检出限分别为4.92 μg/kg、4.85 μg/kg,半抑制浓度(IC50)为0.7 μg/L,标准曲线线性范围为0.3～24.3 μg/L。抗体与吗啡、可待因的交叉反应率分别为100%、150%。火锅底料、辣椒酱样品中平均添加回收率为80%～120%,变异系数＜15%。     

高效液相色谱- 串联质谱法快速测定鱼肉中4 种氟喹诺酮类药物残留

建立快速测定鱼肉中4 种氟喹诺酮类药物残留的高效液相色谱- 串联质谱方法。采用酸性乙腈提取样品中的氟喹诺酮药物残留,然后用正己烷脱脂,氮吹浓缩定容后,用反相液相色谱分离,以液相色谱- 串联质谱仪测定,外标法定量。该法对4 种氟喹诺酮类药物的线性范围为2～40μg/kg,相关系数(r2)大于0.997,在4、10、20μg/kg 3 个添加水平范围内的回收率为79.9%～98.1%,相对标准偏差为2.7%～8.7%,检出限为0.1～0.4μg/kg,定量限为0.3～1.0μg/kg。结果表明,该方法简便快速、灵敏度高、重现性好、选择性强,适用于鱼肉中氟喹诺酮类药物残留的定量测定。     

高效液相色谱-电喷雾质谱法测定牛肉中3种氟喹诺酮药物残留

采用高效液相色谱-电喷雾质谱(HPLC-ESI-MS)建立牛肉中3种氟喹诺酮类药物(环丙沙星、恩诺沙星和沙拉沙星)残留的分析测定方法。试样经酸化甲醇萃取后直接用于分析,内标法定量。在1～20pg/μl范围内,3种氟喹诺酮药物的线性相关系数均大于0.992。在16.7～50.0μg/kg添加水平内,3种化合物的加标回收率为75.2%～96.3%,相对标准偏差为2.5%～8.3%,检出限为8～19μg/kg。这一检测限远低于我国农业部、JECFA以及欧盟等规定的牛肉组织中氟喹诺酮类药物的最大残留限量(MRL)。该方法简便、快速,可用作动物可食性产品中氟喹诺酮类药物残留分析确证的参考。     

甲拌磷残留检测间接竞争ELISA试剂盒的研制

研制用于检测甲拌磷残留量的间接竞争ELISA试剂盒。甲拌磷包被抗原的最佳工作质量浓度为4mg/L,抗体的最佳稀释倍数为8000,甲拌磷多克隆抗体交叉反应率小于20%,甲拌磷抑制率回归曲线为y=18.846x＋6.9949,在1～5000μg/L范围内呈线性关系,检测限为4.90μg/L,IC50为191.37μg/L。甲拌磷试剂盒的添加回收率均高于75%,供试样品检测结果的批内和批间变异系数均低于10%。试剂盒在4℃或－20℃下有效期为270d。     

酶联免疫法测定肌肉中氟喹诺酮类药物效果探讨

目的探讨酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)快速测定肌肉中氟喹诺酮类药物的效果。方法样品经过前处理之后,在肌肉中添加10、50、100、200和400 ng/g的氟喹诺酮类药物,利用ELISA法在20~25℃下测定。结果氟喹诺酮类药物酶联免疫试剂盒的相关系数r为0.9976,50%抑制浓度(IC50)介于0.306~0.351 ng/g之间;在0~400 ng/g范围内,肌肉中氟喹诺酮类药物的回收率在81.8%~100.3%之间,精密度在0.4%~12.0%之间,最低检测限为4.0 ng/g。结论酶联免疫吸附法检测肌肉中氟喹诺酮类药物的结果相对稳定、可靠,能够满足初检筛选要求,值得在基层检测部门推广使用。     

直接竞争ELISA法快速测定水产品中6种氟喹诺酮类药物

采用过碘酸钠法将抗环丙沙星单克隆抗体(MAb-CIP)与辣根过氧化物酶(HRP)偶联制备酶标抗体MAbCIP-HRP,建立了检测水产品中6种氟喹诺酮类药物残留的直接竞争酶联免疫吸附分析方法(dcELISA),考察了包被原浓度、竞争反应时间和有机溶剂等因素对方法灵敏度的影响。结果表明:在优化的反应条件下,所建立的dcELISA针对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星和双氟沙星6种氟喹诺酮类药物的检测限(LOD)均不超过0.5ng/mL,线性范围(IC20~IC80)在1.0~12.1ng/mL之间;对虾、鳗鲡和鲫鱼三种水产样品中添加5.0、10.0和20μg/kg时,加标回收率为70.4%~104.1%,相对标准偏差为5.0%~14.7%;本方法可用于水产品中氟喹诺酮类(FQs)药物多残留的快速测定。     

直接竞争酶联免疫吸附法检测食品中三聚氰胺残留

采用酶标抗原建立了高效、高灵敏的三聚氰胺直接竞争的ELISA（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测方法。方法 以三聚氰胺单克隆抗体包被作为固相抗体,辣根过氧化酶（Horseradish Peroxidase,HRP）标记的抗原与标准品（或样品）中三聚氰胺竞争结合抗体,建立了直接竞争酶联免疫检测体系。结果 以三聚氰胺为标准品建立标准曲线,得到方法的IC50为8.84μg/L,灵敏度为0.65μg/L,线性范围0.9-35μg/L;检测样品的回收率为70.0%-127.9%,与三聚氰酸交叉反应率为60%,其他结构类似物基本无交叉反应。结论 本方法灵敏度高、特异性强、检测快速, 可以满足实际样品的检测需求。     

水产品中恩诺沙星残留的一步法酶联免疫检测研究

采用过碘酸钠氧化法合成了辣根过氧化物酶(HRP)标记的恩诺沙星抗体,建立一步式直接竞争酶联免疫吸附检测(ELISA)技术,并以鳗鱼为样本进行了恩诺沙星残留的加标检测。结果表明,所制备的酶标记抗体效价达到10000 以上,与同族其他药物及族外药物没有显著的交叉反应;所建立的一步式ELISA 法检测限约为10μg/kg。在10～40μg/kg 浓度范围内,加标鳗鱼样本中恩诺沙星的检测回收率在70% 以上,相对平均偏差小于6%,检测时间缩短到2h 以内,约为传统两步式ELISA 法的一半左右。     

金黄色葡萄球菌新型肠毒素I双抗夹心-酶联免疫检测方法的建立

目的：建立简便、灵敏检测金黄色葡萄球菌肠毒素I（staphylococcal enterotoxin I,SEI）的双抗夹心酶联免疫吸附方法（double-antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay,DAS-ELISA）。方法：利用DAS-ELISA检测程序确定单克隆抗体、抗血清、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的羊抗兔IgG（IgG/HRP）的最佳稀释度,再通过检测不同包被缓冲液、封闭时间、抗原包被时间、IgG/HRP作用时间以及四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB）显色时间条件下的OD450 nm值对实验条件进行优化,最后用灵敏度、批内变异、批间变异和加标回收率指标对方法进行评价。结果：抗SEI单克隆抗体的最佳稀释质量浓度为2.89 mg/L,抗SEI兔血清稀释度1∶2 000,酶标二抗稀释度1∶6 000;1×磷酸缓冲盐溶液（pH 7.4）为最佳包被缓冲液;最佳封闭时间、抗原孵育时间、酶标二抗孵育时间和TMB显色时间分别为60、90、30 min和15 min。该方法的回归方程为y=0.040 9x＋0.042 9,R2=0.993 3;灵敏度为0.5 μg/L,精密度批内变异低于10%,批间变异低于15%,除巴氏杀菌牛乳外,对生理盐水、熟牦牛肉糜、大米饭和超高温瞬时灭菌牛乳回收率达90%以上。结论：本研究建立了一种快速检测SEI的双抗夹心方法。     

直接竞争化学发光酶免疫法检测呋喃妥因代谢物

建立检测动物组织中呋喃妥因代谢物的直接竞争化学发光酶免疫法。采用棋盘法确定抗体和酶标抗原的最佳稀释度,通过单因素试验优化包被条件、封闭液种类和竞争反应时间,建立直接竞争抑制曲线,并对方法的灵敏度、特异性、准确度和精密度进行方法学评价。结果表明,经优化,最佳反应条件为抗体稀释度1∶4 000,酶标抗原稀释度1∶80,包被条件为37 ℃ 2 h后4 ℃过夜,封闭液为1%牛血清白蛋白,竞争反应1 h。该方法的线性检测范围为0.030～10.595 ng/mL,IC50为0.559 ng/mL;加标回收率为84.9%～103.4%,批内变异系数为3.4%～7.8%,批间变异系数为4.7%～11.8%;除与呋喃妥因原药交叉反应率为36.2%,与其他结构类似物及衍生化试剂交叉反应率均小于0.1%。该方法灵敏、准确,可用于动物组织中呋喃妥因代谢物的快速筛查。     

间接竞争ELISA法检测牛乳中β-乳球蛋白含量的准确性评价

研究建立了以β-乳球蛋白标准品为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG:HRP为二抗、邻苯二胺为底物的间接竞争酶联免疫检测法(indirect competitive enzyme-linked immu nosorbent,ELISA)。同时以反相高效液相色谱法定量检测相同样品中β-乳球蛋白含量,采用t检验方法来评价间接竞争ELISA的方法定量检测β-乳球蛋白的准确性。t检验方法结果显示:在显著水平α=0.05下,该间接竞争ELISA法检测β-乳球蛋白的测量值较为准确。     

微型丝网印刷电极快速检测克仑特罗的方法

研制能用于96 孔酶标板快速检测的微型丝网印刷电极,并建立克仑特罗的电化学分析方法。通过间接竞 争免疫反应与计时电流法相结合实现克仑特罗的残留量的定量测定。实验中考察并优化免疫反应与酶催化反应的 条件。结果表明：在优化的条件下,克仑特罗标准溶液质量浓度在0.025～2.0 μg/L范围内呈现良好线性关系（r为 0.999 2）。采用本实验方法检测猪肉和猪尿中克仑特罗的结果与商品化ELISA试剂盒一致。本方法检测限分别为 0.18 μg/L和0.05 μg/L,比ELISA试剂盒检测限低一个数量级。     

固相萃取-高效液相色谱法检测肉鸭表皮组织中的松香酸

采用高效液相色谱法对肉鸭表皮组织中的松香酸含量进行检测。肉鸭表皮组织中的松香酸用乙腈提取,经C18固相萃取柱净化,采用高效液相色谱-紫外法进行检测。色谱柱：反相C18柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）,流动相：0.003 mol/L磷酸溶液-甲醇（8∶92,v/v）;流速：1 mL/min;检测波长：240 nm。结果表明：方法线性范围为0.1～10 mg/L,检出限为0.10 μg/g,定量限为0.33 μg/g。在0.5～50 μg/g的添加范围内回收率为82.2%～88.0%。实际样品分析结果显示,松香脱毛处理的肉鸭表皮中松香酸含量高达14.52 μg/g。本实验建立的分析方法简便快捷、具有较好的灵敏度和可靠性,可用于肉鸭表皮组织中松香酸的定量分析。     

双抗夹心ELISA检测转Bar基因抗除草剂大豆

为快捷有效地检测转Bar基因抗除草剂大豆,利用已制备的抗除草剂Bar基因编码蛋白,膦丝菌素乙酰转移酶（phosphinothricin acetyltransferase,PAT）单克隆抗体和多克隆抗体,建立PAT蛋白双抗夹心酶联免疫吸附检测方法,对转Bar基因抗除草剂大豆不同组织材料进行定量检测。结果显示,最佳检测条件为捕获抗体质量浓度0.125 μg/mL,包被酶标板,37 ℃孵育1 h后4 ℃静置过夜,检测样品37 ℃孵育1.5 h,检测抗体质量浓度6.25 μg/mL,37 ℃孵育1.5 h;PAT蛋白的最低检测限为0.04 ng/mL,大豆蛋白体系中为8 ng/mL;重复性变异系数小于3%。利用上述检测条件,对实验建立的转Bar基因抗除草剂大豆进行PAT蛋白定量检测,成功地在根、茎、花、叶、种子不同部位检测到该蛋白的表达。     

利用DAD-HPLC和LC-MS法检测金丝小枣中黄酮类化合物

采用二极管阵列高效液相色谱分离技术和液相色谱-质谱联用技术对金丝小枣中黄酮类物质进行分析和鉴别。液相色谱条件为：色谱柱为Hypersil BDS-C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）,柱温30 ℃,甲醇-0.1%甲酸溶液为流动相,梯度洗脱,流速0.8 mL/min,进样量10 μL,采用270 nm和370 nm双波长检测。结果表明：金丝小枣中含有杨梅素、芦丁、槲皮素、异鼠李素4 种黄酮类物质,含量分别为40.90、8.40、32.60 μg/g和12.56 μg/g。并且在5～125 μg/mL范围内,该方法显示良好的线性关系和重复性,当信噪比为3时,检出限为1.23～1.73 ng/L。精密度实验的相对标准偏差为1.10%～4.31%,加标回收率为93.50%～106.70%（相对标准偏差为0.68%～2.90%）。由此可以看出：该方法样品前处理简单、回收率较高、精密度良好,是一种便捷且精确的分析方法,适用于金丝小枣中黄酮类化合物的检测。     

超高效液相色谱-质谱法测定豆芽中多菌灵、2,4-二氯苯氧乙酸、恩诺沙星残留

建立豆芽中多菌灵、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D）、恩诺沙星残留检测的超高效液相色谱-质谱的分析方法。样品经酸化乙腈提取,浓缩后经WAX小柱净化,采用Waters C18色谱柱分离,以甲醇和0.1%甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱,采用电喷雾-正负离子多反应监测模式,外标法定量。在5～150 μg/L的质量浓度范围内,各种添加剂相关系数均大于0.999 0,该方法的检出限在0.5 μg/kg之间,定量限在1.5 μg/kg之间。添加5.0、10.0 μg/kg和25.0 μg/kg三个不同水平时,多菌灵、2,4-D、恩诺沙星的回收率在80.4%～97.8%之间,日内和日间相对标准偏差在1.25%～5.47%之间。该方法简单、灵敏度高、分析时间短,适用于多菌灵、2,4-D、恩诺沙星的测定。     

银合欢果皮总黄酮含量测定及抗氧化活性

目的：建立测定银合欢果皮中总黄酮含量的方法,研究其体外抗氧化活性。方法：运用NaNO2-Al(NO3)3显色法,检测总黄酮含量,并采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）法和还原力分析其抗氧化活性。结果：芦丁在0.01～0.05 mg/mL（r=0.999 1）质量浓度范围内,吸光度与质量浓度之间呈良好线性关系,平均回收率为99.35%（相对标准偏差为1.37%）,总黄酮含量为1.76 mg/g;银合欢果皮具有显著的抗氧化活性,且呈剂量依赖性,其抑制DPPH自由基的半数抑制浓度（IC50）为0.32 mg/mL,还原力IC50为70.12 μg/mL。结论：所建立的方法简单快捷、准确、灵敏、重复性好,适合银合欢果皮中总黄酮含量的测定。银合欢果皮中含有丰富的黄酮类化合物,且具有良好的体外抗氧化活性。     

直接竞争ELISA法检测动物源食品中利巴韦林残留

本研究针对动物源食品中利巴韦林残留的问题,建立了直接竞争酶联免疫分析方法,快速高效地检测利巴韦林残留。采用活泼酯法将利巴韦林(RBV)与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联制备利巴韦林完全抗原(KLH-RBV),通过免疫新西兰大耳白兔得到多抗血清,经Protein A-Sepharose 4B凝胶柱纯化后得到纯化抗体,在此基础上建立直接竞争ELISA检测方法。该方法的IC₅₀为10.84 ng/mL,最低检测限达0.002 ng/mL,对鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝等实际样品进行检测,加标回收率为80.23%~90.07%。采用高效液相色谱法进行验证,两种方法测定结果呈现良好的线性关系(R2≥0.99)。本文建立的方法灵敏度高,简便快速,适合现场大批量快速检测动物源食品中利巴韦林残留。