两步盐析联合双水相萃取提取纯化蓝藻中藻蓝蛋白

以巢湖新鲜蓝藻为处理对象,采取冻融破壁的方式获取藻蓝蛋白的粗提液,采取两步盐析联合双水相萃取的方法提取纯化藻蓝蛋白。运用0.618法选点实验研究了两步盐析中(NH4)2SO4饱和度对提取纯化影响,构建了聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）-(NH4)2SO4的双水相体系,综合考虑PEG相对分子质量、PEG质量分数、(NH4)2SO4质量分数、pH值和藻蓝蛋白质量浓度对提取纯化藻蓝蛋白的影响。结果表明：室温25 ℃条件下,一步盐析时(NH4)2SO4的最佳饱和度为21%,二步盐析时(NH4)2SO4的最佳饱和度为30%。两步盐析后得到的藻蓝蛋白构建成PEG-(NH4)2SO4的双水相体系后,当PEG相对分子质量1 000、PEG 1 000质量分数10%、(NH4)2SO4质量分数25%时,藻蓝蛋白的纯度可达3.45。     

双水相萃取地皮菜中藻蓝蛋白的研究

采用单因素实验和正交实验法对双水相萃取纯化地皮菜藻蓝蛋白技术进行优化。研究PEG1000/硫酸铵体系中PEG1000含量、硫酸铵含量及离子强度对地皮菜藻蓝蛋白纯化的影响,以回收率为检验指标,确定了双水相萃取纯化地皮菜藻蓝蛋白的优化条件。结果表明,通过正交实验发现3种因素对地皮菜藻蓝蛋白回收率的影响大小依次为硫酸铵>氯化钾>PEG1000;并得到最优组合：双水相体系总质量为20 g,加入藻蓝蛋白粗提液5 g时,PEG1000质量分数为14%、硫酸铵质量分数为15%、氯化钾质量分数0.5%,得到藻蓝蛋白纯度为0.302,回收率为96.43%。     

双水相萃取藻蓝蛋白的研究

双水相萃取是近年来发展起来的蛋白纯化方法。本研究运用双水相技术分离提取钝顶螺旋藻中藻蓝蛋白,对构成双水相体系中不同分子量PEG和酒石酸钾钠浓度的影响进行了分析。确定了双水相组成体系为16%的PEG 2000（w/w）和25%的酒石酸钾钠（w/w）,pH值为6.0,在此体系中藻蓝蛋白主要分布在上相,最高纯度3.69,分配系数20.7,回收率94.56%。多次双水相萃取有利于藻蓝蛋白纯度提高,3次双水相萃取后,藻蓝蛋白纯度高达4.15。     

葛仙米藻胆蛋白提取工艺及藻蓝蛋白稳定性研究

对葛仙米藻胆蛋白的提取工艺及其稳定性进行了研究。采用单因素实验优化葛仙米藻胆蛋白的提取工艺。结果表明，NaCl浓度为0．24mol／L，pH7及提取时间为4．2h时，藻胆蛋白的得率最高，分别为7．004％，7．438％，5．924％；藻蓝蛋白的稳定性实验表明，藻蓝蛋白在30℃以下，酒精浓度在10％以下，pH值在6～8的范围内比较稳定，     

葛仙米藻蓝蛋白抗氧化作用研究

通过非脂质体系抗氧化实验、体外抗氧化实验研究了葛仙米藻蓝蛋白的抗氧化能力。结果表明:葛仙米藻蓝蛋白对清除O2·、·OH自由基和H2O2具有较好的量效关系。在体外反应体系中,葛仙米藻蓝蛋白能显著地降低MDA生成和血和肝中过氧化物的含量,起到保护细胞膜和红血球的作用。显示葛仙米藻蓝蛋白对小鼠肝线粒体损伤具有保护作用,并能显著影响血浆的抗活性氧能力。     

盐析法联合离子液体双水相纯化木瓜蛋白酶

本实验以海南产番木瓜为研究对象,采取盐析法联合离子液体双水相对其富含的木瓜蛋白酶进行提取纯化。以不同饱和度的(NH4)2SO4对粗酶液进行盐析,通过实验结果分析,确定了以饱和度分别为20%和45%的两步盐析法的最佳条件。然后再进行双水相萃取,通过单因素试验结果设计3因素3水平的响应面试验,优化双水相萃取条件为离子液体[C4mim]N(CN)2质量分数29.76%、(NH4)2SO4质量分数16.08%、pH?8.18,在此最优条件下木瓜蛋白酶萃取率为89.01%,酶活力回收率为86.72%,所得到木瓜蛋白酶比活力为1?056?U/mg,纯化倍数达到9.6?倍。然后对实验产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,经纯化的酶中杂条带明显减少,验证了分离纯化的效果。     

葛仙米藻胆蛋白粗提物、藻蓝蛋白和藻红蛋白的体外抗氧化活性比较研究

在体外模型上,对人工养殖的葛仙米藻胆蛋白粗提物、藻蓝蛋白和藻红蛋白的抗氧化活性进行比较研究。通过考察羟基自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力、脂质过氧化抑制能力,对葛仙米中藻胆蛋白粗提物、藻蓝蛋白和藻红蛋白的抗氧化活性进行评价。体外抗氧化作用结果显示藻胆蛋白、藻红蛋白和藻蓝蛋白都有明显的抗氧化作用,但作用方式和抗氧化程度也有不同,在羟基自由基清除试验中,抗氧化活性由强到弱依次为藻胆蛋白藻蓝蛋白藻红蛋白;在超氧阴离子清除试验中藻红蛋白≧藻蓝蛋白藻胆蛋白;在抑制脂质过氧化试验中藻红蛋白藻胆蛋白藻蓝蛋白。人工养殖的葛仙米中藻蓝蛋白、藻红蛋白及藻胆蛋白粗提物具有很好的体外抗氧化活性,但三者抗氧化方式略有差异。     

聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取螺旋藻藻蓝蛋白的研究

对聚乙二醇-硫酸铵双水相体系直接从螺旋藻破碎液中萃取藻蓝蛋白的技术进行了研究。结果表明,对于藻蓝蛋白含量为0.282mg/mL的螺旋藻细胞破碎液,10%PEG2000与20%的硫酸铵双水相体系萃取藻蓝蛋白的效果最佳,经2次萃取,藻蓝蛋白总萃取率为96.1,藻蓝蛋白纯度达到1.2。     

葛仙米藻胆蛋白的提取工艺优化及其纯化研究

以葛仙米为原料,研究葛仙米藻胆蛋白的超声辅助提取工艺。以藻胆蛋白提取率为评价指标,对提取工艺中葛仙米粉粒径数、超声功率、处理方法、液料比、提取时间、提取温度共6个因素进行单因素试验,并结合响应面分析对提取工艺进行优化。结果表明:采用超声辅助处理方法(超声功率700 W),当葛仙米粒径数120目~200目、液料比58∶1(m L/g)、提取温度42℃、提取时间6 h时,葛仙米藻胆蛋白的提取率达到最大为26.13%,达到预测值的99.54%。采用一步离子交换树脂层析法纯化藻蓝蛋白(Phycocyanin,PC)和藻红蛋白(Phycoerythrin,PE),经聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、凝胶过滤色谱(Gel filtration chromatography,GFC)、紫外可见吸收光谱(Ultraviolet-visible absorption spectroscopy,UV-Vis),藻蓝蛋白纯度达到93%,藻红蛋白纯度83.5%。     

葛仙米藻蓝蛋白和藻红蛋白的体外抗炎和抗紫外活性比较研究

目的:对葛仙米藻蓝蛋白和藻红蛋白的抗炎和抗紫外活性进行体外比较研究。方法:通过Lipopolysaccharide(LPS)诱导RAW264.7细胞分泌NO和TNF-α,比较葛仙米中藻蓝蛋白和藻红蛋白的抗炎活性;通过Ultraviolet radiation B(UVB)辐照诱导NIH-3T3成纤维细胞损伤,考察藻蓝蛋白和藻红蛋白的抗紫外损伤活性。结果:体外抗炎结果显示LPS能极显著诱导RAW264.7细胞分泌NO和TNF-α(P<0.01),藻蓝蛋白和藻红蛋白均能极显著抑制LPS诱导RAW264.7分泌的NO和TNF-α的含量水平(P<0.01),其中藻红蛋白抑制NO分泌能力高于藻蓝蛋白,藻蓝蛋白对TNF-α的分泌抑制作用高于藻红蛋白。体外抗紫外损伤结果显示UVB 4000 mJ/cm²可以成功诱导NIH-3T3细胞的紫外损伤,但是藻蓝蛋白和藻红蛋白对NIH-3T3细胞的紫外损伤并无明显保护作用。结论:葛仙米中藻蓝蛋白和藻红蛋白具有很好的体外抗炎活性,但两者对UVB诱导的细胞损伤并无明显保护作用。     

葛仙米藻胆蛋白与色度降解动力学

以葛仙米藻胆蛋白为原料,研究pH值、温度和光照对其色度和含量的影响,建立葛仙米藻蓝蛋白及其色度的降解动力学,结果发现pH 3色素溶液在可见光区几乎没有藻蓝蛋白特征吸收峰,随pH值增加藻蓝蛋白特征吸收峰值逐渐增强,至pH 6达最高,之后逐渐下降;pH值增加藻蓝蛋白特征峰有轻微的蓝移效应。pH 4色素溶液Hunter-b最小,其蓝色最深,且每种pH值色素溶液的Hunter-b差异极显著。藻蓝蛋白在50 ℃半衰期分别是60 ℃和70 ℃的8.09 倍和11.05 倍;而色度在50 ℃半衰期分别是60 ℃和70 ℃的29.17 倍和72.74 倍。     

逐级盐析结合双水相法纯化贯筋藤凝乳酶

为了高效制备贯筋藤凝乳酶,利用逐级盐析结合双水相萃取对贯筋藤凝乳酶进行纯化,研究成相物质、聚乙二醇(PEG)/盐最佳纯化配比及酶用量对酶凝乳纯化的影响,应用SDS-PAGE电泳技术检测贯筋藤凝乳酶的纯度。结果表明:当硫酸铵饱和度区间为20%~40%,贯筋藤粗酶比活力较高,为167.846 MCA/mg;当PEG相对分子质量为6000且质量分数为20.57%、盐相为硫酸铵且质量分数为14.74%,酶用量为1.0 mL时,贯筋藤凝乳酶活力提高1.87倍。电泳图显示贯筋藤凝乳酶纯度较高,分子量约为25 kDa。利用双水相法分离纯化可获得高纯度的贯筋藤凝乳酶,可为贯筋藤凝乳酶后续规模化生产及应用提供参考价值。     

葛仙米多糖的单糖组成分析

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法及HPLC-质谱联用法测定葛仙米多糖的单糖组成,两种方法测定结果相互吻合。同时采用HPLC法测定了相关单糖的标准曲线,相关系数达到0.995以上,经计算,葛仙米多糖的单糖组成物质的量比甘露糖∶葡萄糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶阿拉伯糖为1∶1.12∶3.24∶1.72∶1.21。     

葛仙米多糖的提取、分离与纯化技术研究

葛仙米中富含多糖，并且具有优异的生物和生理活性，本文对葛仙米多糖的提取、分离进行了初步的研究，以期获得性能优良的葛仙米多糖。葛仙米经破碎、脱色、去脂、提取、Sevage法沉淀蛋白质、酒精沉淀多糖、离心、得到粗多糖，最后，通过真空冷冻干燥得到白色的水溶性多糖和褐色的碱溶性多糖，经红外光谱证实：水溶性多糖和碱溶性多糖具有一般多糖的特征。水溶性多糖的最佳提取参数是：90℃，6h，1：90加水，水提取4次，其提取率是14．09％；碱溶性多糖的最佳提取参数是：1mol／L的NaOH溶液，提取6h，加1：25的碱液，提取4次，其提取率是5，70％。     

3种处理方式对葛仙米藻胆蛋白清除超氧阴离子自由基能力的影响

主要研究反复冻融、溶剂、pH值等对葛仙米藻胆蛋白清除超氧阴离子自由基能力的影响,并探讨藻胆蛋白的模拟胃肠液降解产物对超氧阴离子自由基清除能力的变化情况。结果发现反复冻融不会影响葛仙米藻胆蛋白清除超氧阴离子自由基的能力,磷酸缓冲液可提高藻胆蛋白清除超氧阴离子自由基的能力。pH 5.6和pH 7.3浸提物清除超氧阴离子自由基的能力差异不显著,但pH 8.1浸提液略优于其他两种。随着处理时间延长,模拟肠液消化产物清除超氧阴离子自由基能力逐渐增强,模拟胃液消化产物却逐渐下降。     

响应面优化双水相萃取分离酵母源MT工艺

采用聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）-(NH4)2SO4双水相体系,分离铜诱导的诱变酿酒酵母菌所表达的金属硫蛋白。以PEG质量分数、(NH4)2SO4质量分数及pH值为考察因素,萃取率为响应值,结合Design-Expert 8.0.6软件做响应面优化分析,优化到最佳萃取条件：PEG相对分子质量2 000、PEG和(NH4)2SO4质量分数分别为22.5%和17.46%、pH 5.98。获取的金属硫蛋白主要分布在上相,萃取率可达81.69%。此方法操作简单、高效、成本低,是酵母源金属硫蛋白分离提纯的新方法。     

超声波辅助双水相提取条斑紫菜黄酮类物质及其抗氧化活性研究

利用超声波辅助丙醇-硫酸铵双水相体系提取紫菜中总黄酮,并优化提取条件,测定总黄酮提取物对羟自由基(·OH)的抑制活性。结果表明：本方法可有效地从紫菜中提取总黄酮,紫菜总黄酮提取率为0.148%,明显高于乙醇-水回流提取法。最优提取条件为醇水比为0.6、硫酸铵质量浓度0.30g/mL、超声时间20min、料液比0.04。紫菜中含有较丰富的黄酮类物质,提取物对·OH具有良好的抑制作用,是一种有效的天然自由基清除剂,具有很大的开发利用前景。