单亲灭活德氏乳杆菌和乳酸乳球菌原生质体融合条件优化

利用单亲灭活原生质体技术对德氏乳杆菌FQ菌株和乳酸乳球菌FL菌株的原生质体进行融合,考察原生质体制备、再生和融合条件的影响因素。结果表明:制备德氏乳杆菌FQ菌株原生质体最适条件为温度37℃,在含有10μg/mL变溶菌素和1mg/mL溶菌酶溶液中超声处理90min。在此条件下,原生质体再生率可达6.36%。乳酸乳球菌FL菌株添加1mg/mL甘氨酸处理后,用10mg/mL溶菌酶37℃恒温酶解90min,原生质体形成率可达99.97%。65℃处理乳酸乳球菌FL菌株原生质体120min,原生质体灭活率可达96.89%。融合实验结果表明,在PEG6000 400g/L(含0.02mol/L MgCl2和0.01mol/L CaCl2)、融合时间5min、融合温度20℃、pH6.5的条件下促融,德氏乳杆菌FQ菌株和乳酸乳球菌FL菌株原生质体的融合率可达2.72×10-6。     

单亲灭活保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌抗噬菌体菌株融合子的选育

为获得具有抗噬菌体功能且发酵性能优良的乳酸菌酸奶生产菌株,将生产用保加利亚乳杆菌制备原生质体后高温灭活,灭活后的原生质体与嗜热链球菌抗噬菌体菌株的原生质体通过PEG6000诱导进行融合,并对融合子性能进行研究。结果从20株融合子中挑选出3株具有噬菌体抗性且发酵性能优良的乳酸菌融合子。融合条件为:以PEG6000(浓度为400 g/L,添加0.01 mol/L Ca Cl2、0.02 mol/L Mg Cl2)为促融剂,40℃融合2 min。此条件下,融合率可达1.85×10-6。获得的融合子在凝乳、产酸、产粘性物质、产香气成分及抗噬菌体方面性能优越,适合于酸奶生产。     

乳酸菌原生质体制备与再生研究

从市售酸乳中分离嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌,并对其进行原生质体制备和再生。采用溶菌酶对嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌进行处理,脱去细胞壁以探讨原生质体形成和恢复与菌龄、酶浓度、酶解时间及酶解温度之间的关系,利用四因素三水平的正交试验选出原生质体形成和恢复较适宜的条件。试验结果显示嗜热链球菌原生质体制备和恢复的较优条件为,菌龄16h,酶浓度1mg/ml,酶解时间40min,酶解温度42℃,此时原生质体形成率为98.75%,再生率为23.8%;而保加利亚乳杆菌原生质体制备和恢复的较优条件为,菌龄16h,酶浓度10mg/ml,酶解时间30min,酶解温度36℃,此时原生质体形成率为82.05%,再生率为27.1%。本文研究为这两种乳酸菌原生质体的制备、再生条件及其基因操作和相关研究提供技术思路和实验条件。     

产胸苷磷酸化酶短乳杆菌融合菌株的构建及其特性

利用紫外加热灭活双亲原生质体技术对短乳杆菌原生质体进行融合,考察短乳杆菌原生质体制备、再生及融合的影响因素,并对短乳杆菌融合子产酶能力和遗传稳定性进行了研究。结果表明:短乳杆菌在含0.6%甘氨酸发酵培养液培养至对数生长期,2 mg/mL溶菌酶于37℃恒温水浴酶解脱壁2 h,原生质体制备率和再生率可达95%和48%;20 W紫外灯距离20 cm照射50 min,60℃处理短乳杆菌原生质体60 min,原生质体的灭活率几乎为100%;将双亲灭活的原生质体用40%PEG6000,30℃恒温融合10 min,筛选融合子F15并进行5次传代测试其胸苷磷酸化酶活均在1.500 U/mg湿菌体,较亲本酶活提高了50%。     

罗伊氏乳杆菌原生质体的制备与再生条件的研究

研究细胞培养和溶菌酶酶解条件对罗伊氏乳杆菌原生质体形成率的影响以及罗伊氏乳杆菌原生质体在多种再生培养基中的再生条件,结果表明罗伊氏乳杆菌05-1和05-2原生质体形成的最适条件:在MRS培养基中接种量5%(两菌株活菌数分别为4.96×108 cfu/mL和8.04×107 cfu/mL),37℃静置培养至OD600值1.0(两菌株活菌数分别为2.36×1012 cfu/mL和6.56×109 cfu/mL)左右,酶解pH8.0、酶质量浓度20 mg/mL、酶解时间45min。在此最适条件下,两菌株原生质体形成率分别为90.2%和92.8%;在最适再生培养基RM1中,罗伊氏乳杆菌05-1和05-2原生质体的再生率分别为30.6%和23.2%;RM1中,胎牛血清(BSA)是罗伊氏乳杆菌原生质体再生不可获缺的物质。本研究为构建益生乳杆菌食品级基因克隆和表达系统,实现原生质体的转化及细胞融合育种与基因组洗牌分子育种,提供理论依据。     

鼠李糖乳杆菌原生质体制备与再生

目的:以鼠李糖乳杆菌为试验菌株,探究其原生质体制备和再生的影响因素。方法:从菌龄、前处理、溶菌酶浓度及酶解时间等方面研究其对鼠李糖乳杆菌原生质体制备的影响。通过正交试验获得鼠李糖乳杆菌原生质体制备的最优组合,通过添加不同再生稳定剂确定鼠李糖乳杆菌原生质体再生的最适条件。结果:菌龄7 h,以1.5%的甘氨酸和0.5 mol/L蔗糖进行前处理,溶菌酶浓度30 mg/m L、酶解时间60 min,在此条件下进行试验原生质体形成率可达97%;同时,以蔗糖作为再生稳定剂的RM1再生培养基,可实现33.8%的原生质体再生率。结论:为实现鼠李糖乳杆菌原生质体转化以及乳酸菌遗传育种提供了技术支持。     

利用全基因组改组技术提高SubtilosinA的产量

以Bacillus subtilis nja A1B2-2为出发菌株,在最佳的原生质体形成、再生和融合条件的基础上,将前期经过理化诱变筛选的四株高产菌株进行两轮基因组改组。结果表明,当以0.6mol/L Na Cl为高渗洗涤液,0.1mg/m L溶菌酶酶解40min后,涂布在以SMM为高渗体系的NB再生培养基上,原生质体形成率达到95.49%,再生率为89.25%。优化原生质体的融合条件,融合率达到了1.39×10-3。在此基础上将四株高产Subtilosin A菌株进行两轮全基因组改组,结合双亲灭活的筛选方法,挑选出一株遗传性状稳定的高产菌株R2-264,产量达17.59mg/L,比出发菌株提高了3.58倍。     

纳豆菌原生质体制备与再生条件的研究

研究了菌体培养时间、溶菌酶作用条件(酶作用温度、浓度和时间)对纳豆菌BNK菌株原生质体制备和再生的影响。在此基础之上,考察了不同再生培养基、渗透压稳定剂及原生质体保护剂对再生率的影响。确定了菌株BNK原生质体制备和再生最佳条件为:菌体培养9h收集,0．8mg/ml溶菌酶,30℃作用40min制备原生质体,将原生质体液涂布于以甘露醇为渗透压稳定剂、添加有淀粉的PYG培养基中再生,此时原生质体制备率达98．2%,再生率为28．4%。     

纤溶酶产生菌原生质体形成与再生条件的探索

本文研究了菌龄、酶浓度、酶解时间、酶解pH、温度、渗透压稳定剂及青霉素对枯草芽孢杆菌DC-12原生质体形成和再生的影响。确定了DC-12原生质体最佳的形成和再生条件是以改良HM高渗溶液作稳渗系统,在pH7.5、酶浓度为0.2mg/ml（活力单位为50000U/g）和35℃的条件下酶解60min;此条件下所得原生质体形成率为96.1%;以0.6mol/LNaCl为渗透压稳定剂的DM3再生培养基中再生率为21.6%。     

红薯酸奶的研制

以红薯和鲜牛乳为主要原料,配以蔗糖和稳定剂,使用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌种发酵,制成风味独特、营养全面的保健饮品。通过正交试验法优选出最佳发酵工艺条件为：接入3%的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌（1）,在42℃下发酵5h,后发酵时间为22h。     

1 株产酸性α-淀粉酶黑曲霉原生质体制备和再生条件优化

通过单因素试验、Plackett-Burman（PB）试验和响应面优化获得产酸性α-淀粉酶黑曲霉孢子原生质体制备和再生的最佳工艺参数：黑曲霉种龄72 h、孢子浓度7.5×106CFU/mL、渗透压稳定剂甘露醇浓度0.85 mol/L,以10 g/L蜗牛酶＋ 10 g/L 纤维素酶＋ 10 g/L 溶菌酶为破壁酶、pH 6.8、酶解温度37 ℃、酶解2 h。在此条件下,原生质体制备率可达86.92%,再生率可达42.67%。     

干酪乳杆菌LC2W原生质体的制备与再生

以干酪乳杆菌LC2W为出发菌株,对其进行原生质体制备与再生。通过单因素试验研究菌龄、溶菌酶质量浓度、酶解时间及酶解温度对干酪乳杆菌LC2W原生质体制备的影响,并对制备条件进行正交设计优化。结果表明：干酪乳杆菌LC2W原生质体制备的最佳条件为：菌龄8h、酶质量浓度10mg/mL、酶解时间75min、酶解温度42℃,在此条件下制备原生质体并进行再生实验,原生质体形成率达到97.15%,再生率可达到31.25%。研究结果可为L. casei LC2W食品级外源表达系统的构建提供初步的基础。     

阿魏菇原生质体制备及再生条件的建立

以新疆阿魏菇为材料,研究菌龄、酶解时间、酶解液对阿魏菇菌丝原生质体产量的影响,同时还研究了不同渗透压稳定剂对原生质体再生的影响。结果显示,在0.6 mol/L KCl稳渗剂条件下,菌龄为8 d阿魏菇菌丝体(0.1 g)在0.8 mL混合酶解液中(1.5%离析酶+0.5%纤维素酶+2%溶菌酶)制备原生质体,35℃酶解3 h获得原生质体达5×106个/mL。原生质体再生结果显示,在0.8 mol/L蔗糖稳渗剂下,原生质体再生时间为16 d,其再生率可达0.6%。该文通过对阿魏菇原生质体分离和再生条件的研究,旨在从细胞水平上探索一条食用菌育种新途径,为发展和完善食用菌新菌株选育提供理论依据和技术借鉴。     

酱油曲霉孢子原生质体的制备与紫外诱变育种

由1株分离、纯化自曲精的酱油曲霉的分生孢子制备原生质体,并进行紫外诱变,得到7株中性蛋白酶活提高幅度较大的紫外突变株U系,中性蛋白酶活最高的1株达到6 197.4U,为出发株的1.94倍。对原生质体制备条件进行了优化:选取孢子生长旺盛的新鲜斜面培养物(培养5 d左右)制备孢子悬浮液;采用25 mmol/L-巯基乙醇+5 mmol/L Na2EDTA体系预处理20 min;酶解条件是:1%溶菌酶+1%蜗牛酶+1%纤维素酶,山梨醇作为渗透压稳定剂(0.6 mol/L,pH6.88),酶解温度33℃,酶解5 h;再生培养基为0.6 mol/L NaCl高渗透压豆汁培养基,涂布法再生。     

游动放线菌原生质体诱变选育阿卡波糖高产菌株

为提高阿卡波糖发酵水平,制备了阿卡波糖产生菌犹他游动放线菌ZJB-08196的原生质体并对原生质体进行诱变处理。考察了甘氨酸的添加方式及浓度、菌龄、酶浓度、酶解时间、酶解温度、菌体浓度对原生质体制备和再生的影响,并对再生培养基进行了优化。较佳的原生质体制备与再生条件为:菌体一级培养56 h后,转接入含0.4%甘氨酸的菌丝培养基中二级培养22 h,收集菌体并调整菌体浓度为0.2 g/mL,用10 mg/mL溶菌酶35℃水浴酶解4 h后,涂布添加4 g/L L-脯氨酸和0.2 g/L聚乙烯吡咯烷酮的R2YE固体平板,原生质体的再生率达到了15.14%。原生质体经紫外诱变处理,筛选到1株高产突变株UN-52,阿卡波糖产量达到5 165.2 mg/L,比出发菌株提高了12%。     

原生质体紫外诱变选育L-半胱氨酸高活力转化菌株

对Pseudomonas sp.HJ-14的原生质体制备和再生条件进行了研究,并对其原生质体紫外辐照诱变选育L-半胱氨酸高活力转化菌株。在37℃、2 mg/mL溶菌酶作用下酶解60 min,其原生质体的形成率和再生率分别为78.6%和28.6%。经过紫外辐照诱变Pseudomonas sp.HJ-14原生质体,在含DL-2-氨基-△~2-噻唑啉- 4-羧酸(DL-ATC)再生平板上筛选抗性菌株,获得1株酶活较高的正突变株B-3,该菌株具有良好的遗传稳定性和酶活稳定性。采用5L罐进行产酶培养,并在pH8.0、DL-ATC·3H_2O浓度为10 g/L、42℃酶促反应9 h,L-半胱氨酸最高产量达4.63 g/L,摩尔转化率为76.5%,较HJ-14提高了117.7%。     

桦褐孔菌原生质体制备与再生

研究桦褐孔菌原生质体制备与再生条件。采用正交试验法确定复合酶比例,用单因素试验测定不同等渗液、酶解时间、桦褐孔菌菌龄、酶解温度、再生培养基对桦褐孔菌原生质体制备与再生的影响。结果表明：混合酶(纤维素酶5mg/mL、蜗牛酶15mg/mL、溶壁酶15mg/mL、崩溃酶15mg/mL)、菌龄为7d的菌丝,采用0.6mol/L MgSO4为渗透压稳定液,酶解温度35℃,酶解时间5.5h,有利于原生质体的制备。就原生质体再生而言,酶解时间为3.5h制得的原生质体,以MgSO4作为渗透压稳定液,以完全再生培养基(CYM)和麦芽酵母葡萄糖再生培养基(GYM)有利于原生质体再生,再生率最高为0.13%。     

高产L-乳酸米根霉的原生质体制备与再生条件研究

为建立原生质体融合法选育高产L-乳酸米根霉(Rhizopus oryzae)菌株,对米根霉菌株原生质体制备及再生条件进行研究。考察酶种类、酶质量浓度、时间、温度、pH值、渗透压、预处理等因素对原生质体制得量及再生率的影响,获得原生质体制备及其再生的优良条件：不添加甘氨酸,渗透压稳定剂为0.6mol/L的NaCl缓冲液,按1.5mg/mL组合酶质量浓度,蜗牛酶、纤维素酶和溶壁酶质量浓度配比为1:1:1进行混合,35℃、pH6、酶解2h,可获得原生质体制得量最大为2.74×106个/mL,再生率最高为6.8%。