食品检测用大肠埃希氏菌标准物质的研制

目的建立食品检测用大肠埃希氏菌标准物质的制备方法, 研制均匀稳定的标准物质,用于实验室内部质量控制。方法采用冷冻干燥技术制备含量为4-5×104CFU/样品的菌球,参照《CNAS-GL29：2010标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》,随机抽取20件样品进行均匀性检验,采用单因素方差分析对结果进行统计分析;将样品分别于-20℃、4℃、25℃条件下保藏,对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价。并组织3家实验室进行协同标定,再使用20件食品作为基质,按照国标法检验大肠埃希氏菌标准物质的适用性。结果对20瓶标准物质的均匀性检测结果进行单因子方差分析： F=1.933, 符合标准物质的要求。标准物质在?20 ℃保藏28 d,复苏率为96.2%;在4 ℃保藏14 d,复苏率为77.0%;25 ℃保藏7 d,样品中菌含量仍保持在104CFU/样品的水平,说明样品的短期储藏稳定性、长期储藏稳定性和运输稳定性都符合要求。经3家实验室协同标定, 样品活菌含量均在104CFU/样品水平,生化鉴定结果均符合大肠埃希氏菌的特征;标准物质加入到20种食品基质中, 均可以检出大肠埃希氏菌,活菌含量仍保持在104CFU/样品的水平。结论本研究所制备的大肠埃希氏菌标准物质的均匀性、储藏稳定性和运输稳定性均符合要求,适用性良好,可用于食品检测实验室的质量控制和食品中大肠埃希氏菌检测结果的评价。     

食品检测用单核细胞增生李斯特氏菌标准物质的研制

目的建立食品检测用单核细胞增生李斯特氏菌标准物质的制备方法,研制均匀稳定的标准物质。方法利用冷冻干燥法制备103 CFU/样品的标准物质,参照CNAS-GL 29《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》,抽取20件样品,利用平板计数法测定标准物质的均匀性,并对结果进行统计分析;将样品分别置于-20、25、37℃条件下保藏,对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价。组织5家实验室进行协同标定,使用30种即食熟肉制品作为基质,并按照国标法检验标物物质的适用性。结果采用单因素方差分析进行均匀性检验, F=0.922,符合标准物质的要求。标准物质在-20℃保藏28 d, 25、37℃保藏7 d,样品仍然稳定。经5家实验室协同标定,样品含量均在103 CFU/样品的水平;标准物质加入到30种即食熟肉制品中,均可以检出单核细胞增生李斯特氏菌。结论本研究所制备的单核细胞增生李斯特氏菌标准物质的均匀性、储藏稳定性和运输稳定性均符合要求,适用性良好,可用于食品检测实验室的质量控制和食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测结果的评价。     

食品检测用鼠伤寒沙门氏菌标准物质的研制

目的 研制均匀稳定的鼠伤寒沙门氏菌标准物质。方法 采用冷冻干燥技术制备含量为1.5-2.0×103 CFU /样品的菌球, 参照CNAS—GL29: 2010《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》, 随机抽取22件样品进行均匀性检验, 采用单因素方差分析对结果进行统计分析, 将样品分别于-20、4、25、37 ℃条件下保藏, 对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价, 并组织3家实验室进行协同标定, 再使用45件食品作为基质, 按照国标法检验鼠伤寒沙门氏菌标准物质的适用性。结果 对22件标准物质的均匀性检测结果进行单因素方差分析, F=1.986, 符合标准物质的要求。标准物质在?20 ℃保藏28 d, 复苏率为103.1%; 在4 ℃保藏28 d, 复苏率为102.0%; 在25 ℃保藏14 d或者37℃保藏7 d, 样品中菌含量仍保持在103 CFU/样品的水平, 说明样品的短期储藏稳定性、长期储藏稳定性和运输稳定性都符合要求。经3家实验室协同标定, 样品活菌含量均在103 CFU/样品水平, 生化鉴定结果均符合沙门氏菌的特征; 标准物质加入到45种食品基质中, 均可以检出沙门氏菌。结论 本研究所制备的鼠伤寒沙门氏菌标准物质的均匀性、储藏稳定性和运输稳定性均符合要求, 适用性良好, 可用于食品检测实验室的质量控制和食品中沙门氏菌检测结果的评价。     

食品检测用产肠毒素大肠埃希氏菌标准物质的制备及评价

目的 制备并评价产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC）标准物质。方法 分别用基质辅助激光解吸电离（MALDI-TOF MS）、生化、16 s RNA基因序列测定三种方法确认菌株种属。采用冷冻干燥技术制备600个ETEC标准样品（103CFU/样品）;从中随机抽取20个进行均匀性检验;模拟25℃和37℃的运输温度测试样品的运输稳定性,同时在4℃和-20℃的条件下进行保藏稳定性检验。组织3家实验室对样品进行协同验证。最后选择20件食品基质来验证样品的使用效果。结果 生化、MALDI-TOF MS、16 s RNA基因序列鉴定CMCC(B)43208为大肠埃希氏菌,lt、stp、sth基因确认其为ETEC。均匀性检验中,单因素方差分析得F=1.48,小于FINV(0.05,19,20)。稳定性检验中,在25℃和37℃保藏7 d后结果为103CFU/样品,在-20℃保藏60 d和4℃保存28 d后结果为103CFU/样品。协同标定实验中,3家实验室检测样品中菌株均为ETEC(103CFU/标准样品)。使用效果评价中,ETEC标准样品加入20种食品基质后均可检出,而本底对照均未检出。结论 本实验制备的...     

真空冷冻干燥与喷雾干燥长双歧杆菌的工艺比较研究

为有效延长双歧杆菌的保存期和耐受性,利用真空冷冻干燥及喷雾干燥法制备活性菌粉。研究两种干燥方法的工艺参数,并对干燥得到的活性菌粉性能进行比较。真空冷冻干燥法制备的长双歧杆菌活性菌粉的活菌数为7.98×109CFU/g、存活率90.9%、含水量3.8%,4℃保藏90d后活菌数为2.5×108CFU/g,菌粉的水溶性好;喷雾干燥法制备的活性菌粉的活菌数为4.4×109CFU/g、存活率82.2%、包埋率71.9%、含水量5.6%,4℃保藏90d后活菌数为4×108CFU/g,菌粉在水中的溶解时间较长。真空冷冻干燥成本较高、操作时间长、菌粉的保藏期较短;而喷雾干燥工艺简单、生产成本低、工作效率高,包埋的菌粉保藏期较长。     

阪崎克罗诺杆菌标准物质研制

目的采用冷冻干燥技术制备均匀性和稳定性符合要求的阪崎克罗诺杆菌标准物质,用于实验室内部质量控制。方法对使用菌株阪崎克罗诺杆菌(45403)的生化特征、16SrRNA序列、质谱特征进行确认。采用冷冻干燥技术制备含量为103 CFU/样品的菌球。参照CNAS-GL29《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》,对20件样品进行均匀性检验,采用单因素方差分析对结果进行统计分析。将样品分别于-20、2、37℃条件下保藏,对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价。组织5家实验室进行协同标定。使用20件婴儿配方乳粉作为基质对阪崎克罗诺杆菌标准物质的使用效果进行确认。结果阪崎克罗诺杆菌(45403)生化鉴定结果、16SrRNA序列的NCBIGenebank比对结果、质谱鉴定结果均为阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)。采用单因素方差分析进行均匀性检验, F=1.067, P=0.442,符合标准物质的要求。于-20℃保藏170 d,于25、37℃保藏14d后,样品仍然稳定。经5家实验室协同标定,样品含量均为103 CFU/样品。20件婴儿配方乳粉作为基质加入阪崎克罗诺杆菌标准物质进行检验,均可以检出。结论阪崎克罗诺杆菌(CMCC45403)的生化特征、16SrRNA序列分析、蛋白飞行质谱特征均符合克罗诺杆菌属的典型特征。均匀性、储藏稳定性、运输稳定性及适用性的验证实验结果均符合标准物质的要求。     

单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品的 制备与验证

目的研究制备适用于验证、评价实验室或检测机构检测能力的单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)的能力验证冷冻干燥样品。方法对目标菌与干扰菌进行10倍梯度稀释,对不同稀释度的菌液进行菌落计数得到菌含量,确定单核细胞增生李斯特氏菌与干扰菌的添加量;对保护剂和预冻条件进行筛选优化,制备单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品。冻干样品采用西林瓶真空包装,4℃条件下冷藏保存,随机取样检测评估样品均匀性,并在210 d期间内定期抽样检测不同贮存温度下的冻干样品,检测评估样品的稳定性。结果每个冷冻干燥阳性样品最终添加目标菌单增李斯特菌和干扰菌分别为10~2 CFU/m L和10~4 CFU/m L;每个阴性样品添加干扰菌10~4 CFU/m L;最佳冻干保护剂的组合为海藻糖3%,脱脂奶粉8%,谷氨酸钠1.5%。检测结果显示PT冻干样品具有较好的均匀性和稳定性。结论建立的单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品制备方法与评估程序均为有效,适用于验证与评价实验室或检查机构检测能力,满足能力验证活动的要求。     

食品检测用副溶血性弧菌标准物质的制备和评价

该研究制备并检测了不含基质的副溶血性弧菌标准物质。用质谱、生化、16S RNA基因序列测定3种方法对菌株CMCC20030分别确认种属。先采用冷冻干燥技术制备800个样品[103 CFU/样品(20 μL)]。然后随机抽取20个样品进行均匀性检验;再将样品存放25、37 ℃分别在1、3、5、7 d取出进行运输稳定性检验,将样品存放4 ℃分别于7、14、28 d进行短期保藏性检验,将样品存放-20 ℃分别于14、28、60 d的保藏稳定性检验。组织5家实验室对样品进行协同标定。最后用食品基质检测使用效果。菌株CMCC20030经3种方法均鉴定为副溶血性弧菌。均匀性检验中,F样品=1.930,小于FINV（0.05,19,20）。稳定性检验中,于-20 ℃保藏60 d、4 ℃保存28 d、25 ℃保藏7 d和37 ℃保藏3 d后,活菌含量103 CFU/样品。协同标定实验中,5家实验室结果均为103 CFU/样品。使用效果实验中,20种食品基质加入样品后均可以检出,本底对照均未检出。制备的不含基质的副溶血性弧菌样品满足标准物质要求,可依据不同目的灵活使用。     

6种克罗诺杆菌精准鉴定及标准物质的制备研究

目的 制备具有我国食源性特点的6种克罗诺杆菌检验用标准物质。方法 通过生化、MALDI-TOF MS及二代高通量全基因组测序技术对研究用菌株进行菌种鉴定确认后,制备104 CFU/样品浓度的标准物质。参照CNAS-GL003等标准要求对样品进行均匀性检验后,采用单因素方差分析对结果进行评价。将样品放于25 ℃和37 ℃及-20 ℃、4 ℃条件下,分别进行运输稳定性检验及储存稳定性检验。依据国家标准GB 4789.40,将研制的6种标准物质分别加入20件乳粉样品中进行检验,检测真实食品样品中适用性。组织3家实验室,对6种标准物质进行协作标定。结果 CMCC45413、CMCC45410、CMCC45414、CMCC45412、CMCC98025及CMCC45408生化鉴定结果均为阪崎克罗诺杆菌属(Cronobacter sakazakii group),准确度为92%至99%;MALDI-TOF MS鉴定结果均为阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）,分数为1.914至2.244;全基因组测序鉴定结果与菌株已知种或亚种信息一致。均匀性测试结果符合正态分布,通过单因子方差分析,6种标准物质F值分别为0.422、0.922、0.980、0.409、0.721及0.631,F＜F0.05,符合均匀性要求。25 ℃及37 ℃ 放置7 d,6种标准物质中菌含量仍保持在104 CFU/样品。6种标准物质放置于4 ℃储存28 d及放置于-20 ℃储存90 d,菌含量均为104 CFU/样品,且存活率均在80%以上。20件真实乳粉样品中分别加入6种克罗诺杆菌标准物质进行检验,均可以检出;经3家实验室协作标定,6种克罗诺杆菌标准物质浓度均为104 CFU/样品。结论 本研究制备的6种克罗诺杆菌标准物质均匀性、稳定性、真实食品样品中应用验证及协作标定结果均符合要求,可应用于婴幼儿乳粉中克罗诺杆菌的检验。     

肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体和gDNA标准物质的研制

目的：为满足肠道集聚性大肠埃希氏菌准确检测的实验室质量控制和能力验证需求，研制具有我国自主知识产权且具有全基因组测序信息的均匀稳定的肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体及gDNA标准物质。方法：利用二代高通量测序技术对肠道集聚性大肠埃希氏菌（CMCC 44841）进行全基因组测序，明确CMCC 44841的种属、血清分型、多位点序列分型和毒力基因。对CMCC 44841进行astA、aggR、pic特征性基因聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）确认。采用冷冻干燥技术制备含量为103 CFU/样品的菌球和含量为20 ng/样品的gDNA小球。参照CNAS-GL017对20 个菌球样品进行均匀性检验，采用单因素方差分析对结果进行统计分析。将样品分别于－20、4、25 ℃和37 ℃条件下保藏，对其贮藏稳定性和运输稳定性进行评价。组织3 家实验室进行协同标定和验证。使用5 种不同基质的即食食品样本，按照国标法检验标准物质的适用性。结果：利用生物信息学分析，CMCC44841基因组大小为5.057 285 Mb，GC含量为50.6%，编码区基因5 173 个。种属鉴定结果为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），血清预测结果为O127:H21，MLST为ST40型，携带除aggR、astA、pic之外其他相关的毒力基因。PCR扩增出astA、aggR、pic片段大小分别为102、400 bp和1 111 bp。菌体标准物质均匀性检验结果F=1.59，符合标准物质的要求。菌体和gDNA标准物质样品于－20 ℃和4 ℃保藏60 d，25 ℃保藏7 d，37 ℃保藏5 d后仍然稳定。经3 家实验室协同标定，菌体标准物质样品含量均为103 CFU/样品。20 件不同基质的食品样品加入肠道集聚性大肠埃希氏菌标准物质进行检验，均可以检出。结论：本研究所制备的肠道集聚性大肠埃希氏菌菌体及gDNA标准物质所用菌株来源于我国国内分离菌株，且具有明确的全基因组序列信息，均匀性和稳定性均符合要求，适用性良好，能够满足食品检测实验室的质量控制和能力验证的需求。     

超高压处理对泡椒凤爪微生物与品质的影响

将超高压技术（high pressure processing,HPP）应用于泡椒凤爪的加工过程,同时以传统热加工做对照,对处理前后以及贮藏期内微生物、理化指标和质构指标等进行研究。结果表明：热处理和超高压处理（400 MPa处理5 min）后泡椒凤爪菌落总数从21 000 CFU/g分别降到12 CFU/g和23 CFU/g,4 ℃和25 ℃贮藏15 d后,超高压处理样品的菌落总数分别增加到425 CFU/g和6 600 CFU/g,符合GB 2726-2005《熟肉制品卫生标准》要求。超高压处理组产品的硬度、脆度、弹性和感官评价指标显著高于热加工组。超高压处理组样品贮藏15 d后,亚硝酸盐含量低于GB 2726-2005的最高限定值。HPP技术适合应用在传统食品泡椒凤爪的生产过程中。     

鸡蛋中氟苯尼考质控样品的研制及稳定性评价

采用空白鸡蛋基质中添加不同含量氟苯尼考的方式自主研制质控样品,按照CNAS-GL003:2018《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》,采用GB/T 22338—2008《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》液相色谱-串联质谱法为参比方法对质控样品的均匀性和稳定性进行评价,同时对影响质控样品稳定性的因素进行研究,并通过6 家实验室间联合定值的方式确定质控样品的参考值,结果表明自主研制的非冻干（液态）和冻干（固态）2 种状态质控样品均匀性良好,不同样品状态、不同贮存温度对质控样品稳定性有影响,冻干质控样品在－18 ℃条件下贮存12 个月稳定性良好,3 个添加量的冻干质控样品最终定值结果为0.23、0.39 μg/kg和1.92 μg/kg,可推广应用于快速检测领域和实验室日常检测的质量控制。     

乳酸乳球菌乳脂亚种冷冻干燥保护剂优化及其贮藏稳定性

采用单因素试验、Plackett-Burman试验设计和Box-Behnken响应面法,筛选和优化乳酸乳球菌乳脂亚种KLDS4.0326真空冷冻干燥保护剂工艺,并分析冻干菌粉在不同温度下的贮藏稳定性。结果表明：脱脂乳粉、海藻糖和甘油含量是影响菌体细胞存活率的关键因素;以菌体细胞存活率为响应值,对3 个因素进行优化分析,保护剂最佳配比为：脱脂乳粉10.77 g/100 mL、海藻糖7.81 g/100 mL、甘油3.31 g/100 mL,此条件下菌体细胞存活率为（87.43±1.62）%,与理论预测值接近。在4 ℃和25 ℃条件下保藏12 个月后,菌体细胞存活率分别为40.63%和8.67%,冻干菌粉在4 ℃条件下具有更高贮藏稳定性。     

温度和接种量对搅打奶油中金黄色葡萄球菌生长及产肠毒素的影响

目的：研究金黄色葡萄球菌在搅打奶油中的生长以及产毒特性。方法：将不同浓度的初始接种量的产A型肠毒素金黄色葡萄球菌菌液接种到奶油中并搅打成型,低接种量控制在2～3（lg（CFU/g））,高接种量控制在4（lg（CFU/g））以上。定时测量不同贮存温度条件下奶油中的金黄色葡萄球菌的菌落总数以及产毒状况。结果：36 ℃条件下生长速率最快,其他温度条件下依次降低;低初接种量水平下,只有36 ℃条件下于27 h检测到产生毒素,其他温度条件下未检测到毒素产生;高初接种量水平条件下,在36 ℃于12 h、25 ℃于24 h、15 ℃于66 h检测到产生毒素,5 ℃条件下金黄色葡萄球菌既不生长,又不产毒。结论：随着温度的升高,金黄色葡萄球菌的生长速率随之升高,产肠毒素的时间也随之缩短,高初始接种量水平肠毒素产生的时间短于低初始接种量水平,肠毒素的产生时间为一般在对数期的中后期,此时金黄色葡萄球菌菌落总数≥6（lg（CFU/g））。     

芹菜中7种农药及其代谢物基体标准物质的制备

目的 制备芹菜中7种农药及其代谢物基体标准物质。方法 将空白芹菜样品粉碎、冷冻干燥制成干粉后,与农药标准溶液混匀,搅拌挥发干后制得基体标准物质,经均匀性和稳定性检测,由8家实验室联合定值,并进行不确定度评估。结果 基体标准物质中7种农药及其代谢物的特性值为0.497～0.502 mg/kg,扩展不确定度为0.0079～0.0123 mg/kg,均匀性良好,可稳定保存至少12周。结论 通过该方法制备的基体标准物质均匀性和稳定性良好,定值结果可靠,可用于检测过程的质量控制、检测方法开发、实验室能力验证等领域。     

星状病毒核酸检测标准物质的研制

目的：研制用于食品中星状病毒核酸检测的cRNA标准物质。方法：利用基因克隆体外转录方法制备星状病毒cRNA纯品,初步定量后稀释至适宜浓度进行分装,其中一部分分装样品添加RNAsafe处理,剩余部分不做处理,制备2 种标准物质样品。采用实时荧光定量实时聚合酶链式反应（real-time-polymerase chain reaction,RTPCR）方法检验2 种标准物质样品均匀性和稳定性。样品中RNA浓度（拷贝/μL）通过荧光定量RT-PCR和数字PCR联合定值获得,并进行不确定度分析。结果：均匀性结果显示2 种样品组间精密度与组内精密度差异均无统计学意义（P＞0.05）。稳定性检验表明20～25 ℃ 10 d、4 ℃ 14 d、－20 ℃ 3 个月及－80 ℃和液氮6 个月2 种样品cRNA含量无显著变化。RNAsafe（－）标准物质定值为：（1.652±0.143）×108 拷贝/μL（－80 ℃）和（1.652±0.135）×108 拷贝/μL（液氮）。结论：RNAsafe（－）标准物质样品可作为用于星状病毒核酸检测的标准物质。     

脱脂肉骨粉在不同贮藏条件下的稳定性

以脱脂肉骨粉为原料,研究其在不同条件下的贮藏性能。结果表明：在相对湿度54.4%、温度20 ℃条件下,脱脂肉骨粉在8 个月贮藏期内未出现脂肪哈喇味和霉变现象,其酸价、硫代巴比妥酸反应物还原（thiobarbituric acid reactive substance,TBARS）值、挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen,TVB-N）值增加缓
慢,说明其贮藏稳定性得到提高。在相对湿度43.2%、温度30 ℃条件下,脱脂肉骨粉的酸价、TBARS值、TVB-N值快速增长,在贮藏后期增长速率提高,组胺含量受温度影响不大。在相对湿度69.9%、温度20 ℃条件下,酸价、TBARS值、TVB-N值迅速增加,组胺含量反而有所降低,但第6个月发生霉变现象,说明脱脂肉骨粉在该条件下贮藏时不宜超过6 个月。     

蒜氨酸标准物质的定值研究

建立蒜氨酸标准物质的定值方法。鲜蒜经一系列提取、分离、纯化得蒜氨酸标准物质。应用高效液相色谱面积归一法确定蒜氨酸标准物质的纯度。随机抽取10 瓶样品进行均匀性检验,经F检验,样品均匀性良好。长期稳定性结果经t检验表明在4 ℃条件下蒜氨酸的稳定期不少于43 个月。采取9 个实验室协作定值的方法对样品进行检测定值,定值结果由标准值和不确定度表示为（99.49±0.95）%。研制的蒜氨酸标准物质通过了国家标准委的审评,并已应用于实际检测中。     

冻干圣女果粉的水分吸附性质及玻璃化转变温度

根据吸附理论,在水分活度为0.11～0.90范围内,环境温度为25 ℃条件下,采用静态称质量法研究冻干圣女果粉的吸附和解吸等温线;通过差示扫描量热仪（differential scanning calorimeter,DSC）测量不同水分含量下的玻璃态转变温度（glass transition temperature,Tg）,并采用Gordon-Taylor方程对其进行了非线性拟合。结果表明：冻干圣女果粉在25 ℃条件下的吸附等温线和解吸等温线的类型都为J型,属于Ⅲ型等温线;在水分活度为0.23～0.76范围内存在明显的解吸-吸附滞后现象,属于H3型等温线。GAB和Peleg模型都描述冻干圣女果粉的吸附特性。随着水分含量的增加,冻干圣女果粉的Tg显著降低;Gordon-Taylor方程能够较好地拟合其玻璃化转变曲线。对比水分活度贮藏理论和玻璃化转变理论,发现二者在预测冻干圣女果粉贮藏稳定性上存在一定的差异。     

角鲨烯国家标准样品的研制

为研制角鲨烯国家标准样品。以角鲨烯粗品为原料,制备高纯角鲨烯,采用红外光谱、高分辨质谱和核磁共振谱进行结构确证。样品分装成150 瓶后,采用气相色谱-氢火焰离子化检测器法进行均匀性、稳定性检验和定值分析。从样品中随机抽取15 瓶进行均匀性检验,经F检验表明在95%置信区间范围内样品均匀性良好;稳定性考察按照－18 ℃长期实验稳定性（24 个月）进行,结果表明在考察期间内样品稳定性良好;标准样品经国内8 家具有分析资质的实验室进行协同定值,并评定了定值结果的不确定度,角鲨烯标准样品定值结果为99.57%,相对扩展不确定度为0.30%（k=1.96）。该标准样品达到国家标准样品的技术要求,可用于有关角鲨烯的方法校正和质量控制。