argE基因的表达优化及Zn2+添加时间和浓度的影响机制分析

确定了目的基因argE在重组菌BL21(DE3)-pET22b-argE中的表达位置,研究了Zn2+对重组菌生长及表达产物活性的影响,并分析了影响机制. 结果表明,argE可在重组菌中高效表达,表达产物N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶大多以不可溶的包涵体形式存在,只有少量为有活性的可溶性表达. 1.0 g/L的Mg2+对重组菌的生长及酶活有明显促进作用. Zn2+加入时机及加入量不同,影响结果也不同. 发酵起始加入Zn2+严重抑制菌的生长及酶活,而在1.0%乳糖诱导2.5 h后加入则可解除生长抑制并提高酶活. SDS-PAGE电泳及活力测定证实Zn2+参与形成酶的催化中心,对酶的表达量没有影响.     

五种金属离子对Rhodosporidium toruloides Y2产油的影响

研究Fe3+、Cu2+、Mg2+、Ca2+和Zn2+等五种金属离子对Rhodosporidium toruloides Y2产油的影响;采用单因素实验设计法,生物量测定采用重量法,油脂含量测定采用氯仿甲醇法,葡萄糖浓度采用DNS法测定;发酵培养基中添加适当浓度的Fe3+(10 mg/L)、Cu2+(10 mg/L)、Mg2+(0.5 g/L)、Ca2+(1 g/L)和Zn2+(5 mg/L)可提高酵母生物量和油脂含量。其中Cu2+、Ca2+和Zn2+添加对酵母生长和产油的影响较为显著,生物量得率达到0.35 g/g以上,油脂得率达0.20 g/g,分别比空白组增加了16.7%和33.3%;本研究通过优化金属离子浓度提高了R.toruloides Y2生物量和油脂积累效率,为提高微生物油脂生产效率提供了有用的参考。     

Ca~(2+)与Mg~(2+)对SBR运行效果和活性污泥性能的影响

为了提高序批式活性污泥工艺(SBR)的脱氮效率和污泥沉降性能,考察了Ca2+和Mg2+对SBR硝化作用和EPS的影响。结果表明:当Ca2+和Mg2+浓度由5 mmol/L增加至200 mmol/L时,添加Ca2+反应器中胞外聚合物(EPS)中蛋白质质量浓度由76.8 mg/L降低至4.87 mg/L,添加Mg2+反应器中EPS中蛋白质质量浓度由94.3mg/L降低至38.18 mg/L,多糖质量浓度变化较小,污泥的絮凝性逐渐增加,有机物去除和脱氮能力下降。随着Ca2+浓度的增加,污泥沉降比(SVI)由453 mL/g降低至320 mL/g,而随着Mg2+浓度的增加,SVI由461 mL/g升高至555.9 mL/g。因此,废水中硬度离子的浓度能够影响活性污泥的沉降和絮凝性能,应在实际的活性污泥工艺运行中予以重视。     

培养温度对基因工程菌生长密度和rhG-CSF表达的影响

观察培养温度对重组人粒细胞集落刺激因子的基因工程菌 p CG- 1/ rh G- CSF/ DH5α生长密度和 rh G-CSF表达的影响发现 ,在培养阶段采用不同的培养温度有利于提高细菌的生长密度和重组产物的表达量 ,并可缩短培养周期。通过在 NBS MPP- 40大罐中进行 3批发酵 ,每批发酵 15 h,平均菌密度 A6 0 0 为 2 5 .0 ,菌干重 2 3g/L ,rh G- CSF表达量可达 2 6 .93%。     

L-谷氨酸氧化酶生物合成α-酮戊二酸的工艺优化

利用表达L-谷氨酸氧化酶(LGOX)的工程菌进行全细胞催化L-谷氨酸钠合成α-酮戊二酸,考察了各无机离子对酶活的影响,结果表明1mM Mn2+和Mg2+分别对酶活有22%和15%的提高,而Fe2+、Cu2+和Ba2+对酶活有不同程度的抑制。正交实验设计考察催化反应中的影响因素,包括温度、pH、投菌量(固定底物浓度为100g/L)、过氧化氢酶添加量,结果表明最优工艺为温度为30℃、pH值为6.5、投菌量2%、过氧化氢添加量为2%,反应15h,摩尔转化率为99%,该工艺结果对α-酮戊二酸的酶催化工艺有很强的指导作用。     

重组Echistatin融合基因工程菌高密度发酵工艺优化

目的优化大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合基因工程菌的发酵工艺。方法在15L发酵罐内,研究培养基、培养条件和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果工程菌在pH7·4的2×YT培养基中诱导4h,菌体湿重可达75g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的35%,所构建的重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。结论优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和表达条件,为规模化生产奠定了基础。     

橡胶工业有机废水降解微生物的驯化筛选与降解条件研究

用含M盐(2-硫醇基苯并噻唑)的橡胶工业有机废水驯化活性污泥,筛选出8株菌。纯化后进行混合培养,对其生长条件进行分析后发现:复合菌适合在30～35℃的偏碱性条件下生长,能耐受50 g/L盐度的影响。当添加葡萄糖和尿素后对复合菌生长影响较大,同时可使橡胶工业有机废水降解率分别提高18.6%和7.56%;无机离子也对复合菌的降解能力有一定的促进作用。采用综合正交试验得出:葡萄糖、尿素、菌量、转速分别为2g/L、1 g/L、20%、80 r/min为复合菌的最佳降解条件,最高降解率为68.24%,从而提高了投菌法的降解效率。     

氨基酸强化Torulopsis glabrata发酵生产丙酮酸

在维生素限量添加的条件下,研究了添加氨基酸对丙酮酸发酵的影响. 在发酵初始添加0.8 g/L谷氨酸、0.6 g/L酪氨酸和0.2 g/L甲硫氨酸使丙酮酸产量分别提高23.5%, 16.4%和11.8%. 动力学分析表明,添加以上3种原料提高丙酮酸生产性能的原因在于用于细胞生长的葡萄糖下降,显著提高了细胞对葡萄糖的产率系数(Yx/s)和丙酮酸对葡萄糖的产率系数(Yp/s). 添加氨基酸导致胞内NADH/NAD+比下降,增加了胞内NAD+可用度,加强了糖酵解速度,从而提高了丙酮酸生产强度.     

Ca~(2+)、Mg~(2+)对好氧污泥颗粒化的影响研究

研究了投加不同金属离子(Ca2+、Mg2+)在好氧污泥颗粒化过程中的作用,简要分析了颗粒形成过程中污泥的形态和物化性质变化,重点探究Zeta电位、胞外多聚物(EPS)的变化以及两者之间的关系。在接种普通活性污泥的2个序批式反应器中分别投加等量40 mg/L的Ca2+和Mg2+,培养运行34 d,2个反应器都已全部颗粒化,结果显示添加Mg2+更有利于缩短好氧颗粒污泥系统的启动时间,而添加Ca2+形成的颗粒污泥平均粒径较小,添加Mg2+更能促进EPS的分泌。底物匮乏期,添加Mg2+较添加Ca2+的微生物更易利用EPS作为碳源,且在饱食-饥饿期的交替阶段Mg2+对污泥表面Zeta电位造成的影响更大。     

重组大肠杆菌苯丙氨酸解氨酶稳定性研究

考察了甘油、Mg2+和二硫苏糖醇(DTT)对重组大肠杆菌苯丙氨酸解氨酶(PAL)稳定性的影响,并用响应面法优化筛选了最佳稳定剂组合。结果表明,φ(甘油)=10%和c(Mg2+)=0.05mol/L组合可以显著提高酶稳定性,在连续三轮转化后,PAL比酶活仍然能达到62.43U/g,是对照的1.53倍,明显好于单独使用φ(甘油)=10%或Mg2+。响应面分析结果表明,甘油在提高稳定重组PAL稳定性过程中起的作用最显著,最佳稳定剂组合条件是:c(Mg2+)=0.115mol/L,ρ(DTT)=0.52g/L,φ(甘油)=10.03%。在该条件下,在连续三轮转化后,PAL比酶活基本维持在82.53U/g,是对照的2倍;5L发酵罐PAL可以达到876U/g,酶活力是对照的近4倍。     

天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白的原核表达、纯化与发酵

目的原核表达天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,并进行纯化和发酵。方法全基因合成带有凝血酶切割位点的天蚕素B和表皮生长因子融合基因,克隆入pET22b(+)-X表达载体中,构建重组质粒pET22b-CecropinB-EGF,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta-gami2(DE3),经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。镍离子亲和层析纯化融合蛋白并复性后,对其促表皮生长活性进行测定,最后在5L发酵罐中进行发酵。结果酶切及测序结果显示,融合蛋白基因已克隆入pET22b(+)-X表达载体中;SDS-PAGE分析显示,天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白在Rosetta-gami2(DE3)宿主菌中得到了有效表达,表达量约占全菌总蛋白的30%;Westernblot分析显示,表达产物可与表皮生长因子单克隆抗体特异结合;融合蛋白的表达形式为包涵体;纯化、复性后的融合蛋白具有促BALB/c3T3细胞生长的活性,在5L发酵罐中进行发酵,1次可收获菌体约60g。结论已成功地在大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)中表达了天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,为研究具有抗菌和促伤口愈合的双功能药物奠定了基础。     

东亚钳蝎氯离子通道毒素BmK CTa在大肠杆菌中的异源表达及其对宿主菌增殖的影响

目的在大肠杆菌中异源表达东亚钳蝎氯离子通道毒素BmK CTa,并观察其对宿主菌增殖的影响。方法构建BmK CT基因原核表达质粒pExSecI-rBmK CTa,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。光密度法检测含不同质粒的大肠杆菌BL21(DE3)及空菌在37℃,LB液体培养基中的生长速率。结果重组原核表达质粒pExSecI-rBmK CTa经PCR、双酶切和测序证明构建正确。目的蛋白的表达量占全菌总蛋白的19.94%,为可溶性表达,且具有良好的反应原性。rBmK CTa的异源表达显著抑制了大肠杆菌在对数生长期的增殖。结论rBmK CTa在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,且对大肠杆菌的生长具有显著的抑制作用。提示BmK CT可能特异性地作用于宿主菌的氯离子通道,对原核生物的氯离子通道有抑制作用。     

C型产气荚膜梭菌保护性抗原的免疫原性

目的研究C型产气荚膜梭菌α-β2-β1融合基因重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1抗原的免疫原性。方法在对重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1进行优化表达的基础上,制备包涵体粗提物、全细胞培养物及全细胞乳糖诱导培养物3种抗原,对ICR小鼠进行攻毒保护试验。结果重组工程菌BL21(DE3)/pXETAB2B1能够表达α-β2-β1融合蛋白,该融合蛋白能够有效刺激免疫小鼠产生特异性抗体,达到保护的目的。结论已获得具有一定免疫原性的重组工程菌,可作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。     

重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38在大肠杆菌中的表达及其细胞毒性

目的 在大肠杆菌中表达、纯化重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38,并检测其细胞毒性。方法以PHis-hIL6(T22)-PE38质粒为模板,PCR扩增hIL6(T22)-PE38基因,插入表达载体pET-28a(+)的NcoⅠ和XhoⅠ多克隆位点,构建重组表达质粒,分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)、Rosettablue(DE3)和BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,并对表达条件进行优化。表达产物经亲和层析纯化后,检测其细胞毒性。结果重组表达质粒pET-28a-hIL6(T22)-PE38经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组毒素相对分子质量约56 000,在大肠杆菌Rosettablue(DE3)中表达量最高。最适诱导表达条件为:1 mmol/L IPTG 28℃诱导4 h。重组毒素能选择性地杀伤人骨髓瘤细胞U266和鼠骨髓瘤细胞SP2/0,体外对U266和SP2/0细胞的IC50分别为0.5～1.0和1.0～1.5μg/ml。结论重组靶向毒素hIL6(T22)-PE38在大肠杆菌中成功获得可溶性表达,纯化的蛋白可明显选择性杀伤U266和SP2/0细胞。     

表达MAGE-1/HSP70/MAGE-3工程菌的稳定性

目的检测重组工程菌pET28a-MAGE-1/HSP70/MAGE-3/BL21(DE3)生物学性状的稳定性。方法将工程菌菌株连续传50代,每隔10代挑取单克隆菌落进行诱导表达,并计算质粒丢失率。提取不同代次的质粒,扫描电镜观察,检测融合蛋白表达水平,并进行工程菌的染色镜检及生化鉴定。结果pET28a-MAGE-1/HSP70/MAGE-3/BL21(DE3)融合蛋白工程菌呈典型的大肠杆菌形态,各代次菌的各项检测结果与原始菌种差异无显著意义。结论重组工程菌pET28a-MAGE-1/HSP70/MAGE-3/BL21(DE3)生物学性状稳定,可作为生产用菌种。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因的克隆及其高效表达

目的克隆幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)基因,构建原核表达载体,并进行高效表达。方法以幽门螺杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增UreB基因,双酶切后,与质粒pET-22b(+)连接,构建表达载体pET-22b(+)/UreB,分别转化E.coliBL21(DE3)、Origam(iDE3)和Rossetta(DE3),经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果经酶切及测序,证明幽门螺杆菌UreB基因的原核表达载体构建正确。3种重组菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分析,均可见相对分子质量为64000的目的蛋白条带,Rossetta(DE3)重组菌目的蛋白表达量最高,约占菌体蛋白的35%。Western blot结果表明,表达的目的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆了幽门螺杆菌UreB基因,并在大肠杆菌Rossetta(DE3)中获得了高效表达。     

百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素基因的克隆及原核表达

目的克隆百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素(CyaA,ACT)基因,表达并纯化重组CyaA蛋白。方法从百日咳杆菌CS株的基因组DNA中PCR扩增CyaA编码基因,克隆入载体pET30a,构建重组原核表达质粒pET30a/cyaA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经8mol/L尿素变性、透析复性、DEAE阴离子交换柱纯化后,采用Western blot法鉴定其反应原性。结果重组原核表达质粒pET30a/cyaA经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的20%;纯化的重组蛋白纯度达90%左右,可与全细胞百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗免疫血清结合。结论已成功克隆了百日咳杆菌cyaA基因,并在大肠杆菌中表达了重组CyaA蛋白,为进一步开展CyaA的应用研究奠定了基础。     

人内毒素结合肽基因的突变及突变体蛋白表达

目的分析亲代人内毒素结合肽一级结构,选择可能影响其生物学活性的氨基酸对应碱基位点进行突变,克隆基因突变体mEBP基因并研究其蛋白表达。方法以亲代EBP基因为基础,结合DNASIS软件理化性质分析确定突变碱基,应用PCR定点诱变技术进行第5、18位谷氨酰胺→赖氨酸的定点突变。并将其克隆至原核融合表达载体pinpointXa-3,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS进行表达,经Western blot鉴定。结果突变EBP基因13及52位核苷酸由C突变为A,构建的阳性重组子经酶切及测序鉴定证实与设计序列完全一致,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达生物素化的融合蛋白,Western blot鉴定显示能与抗生物素单克隆抗体结合。结论已成功获得EBP基因突变体,并在大肠杆菌以融合蛋白的形式进行表达。     

B型肉毒毒素轻链蛋白的原核表达及纯化

目的克隆B型肉毒毒素轻链Bont-B基因,使其在大肠杆菌内表达,并对表达的重组蛋白进行纯化。方法设计并人工合成Bont-B基因,克隆入表达载体pMD19-T中,构建质粒pMD19-T-Bont-B,经酶切后与pET-28a载体连接,构建重组表达质粒pET-28a-Bont-B,将重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析后,经金属螯合层析Cu2+柱进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE分析纯度。结果重组表达质粒pET-28a-Bont-B经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约50 000,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的6%;纯化后的重组蛋白纯度可达90%以上。结论已成功克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中原核表达了Bont-B轻链基因,为制备抗Bont-B轻链单克隆抗体及研究肉毒中毒机制和治疗奠定了基础。     

固定化细胞催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯工艺研究

采用硅藻土作载体,聚乙烯亚胺和戊二醛作交联剂来固定化E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr共表达菌株,以此来催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯[(5R)-1]合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯[(3R,5R)-2],考察了硅藻土-聚乙烯亚胺-戊二醛固定化细胞的催化性能,进一步优化了固定化细胞催化合成(3R,5R)-2工艺。结果表明:在固定化细胞用量100g/L、葡萄糖与底物质量浓度比为1:1、转化温度30℃、pH7.0、流速12mL/min、100 g/L的(5R)-1转化完全的条件下,填充床式反应器可以连续反应五个批次,转化570 g/L的(5R)-1,较搅拌式反应器提高了107.3%,较游离细胞间歇催化操作提高了185%。