人类胰岛素信号通路基因表达分析

人类胰岛素信号通路基因是糖尿病药物的重要靶标.本文通过查询公共数据库获取人类胰岛素信号通路基因的表达数据,采用SPSS软件分析基因的组织表达谱特征和相关性.结果表明:胰岛素信号远端靶基因具有更高的差异表达水平;脂肪细胞和骨骼肌的基因表达谱具有显著的相关性,而肝组织的基因表达谱与脂肪细胞和骨骼肌都无显著相关性.提示在胰岛素的靶组织中,脂肪组织和骨骼肌可能具有相似的信号调控机制.     

人源蛋白激酶B的原核表达研究

确定人源PKB在大肠杆菌中的表达条件.方法构建PKB原核表达质粒pET-28-PKB,转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,通过改变诱导剂IPTG浓度、诱导时间、诱导温度和菌体浓度确定了PKB的最佳表达条件,并初步纯化PKB蛋白.结果确定了重组菌株的最佳表达条件为:37℃、200 r/min培养2 h后,28℃、1 mmol/L IPTG诱导培养8 h.超声破碎菌体,经8M尿素变性、12 000 rpm/min离心和亲和层析,获得了纯化的PKB.结论为PKB蛋白的表达纯化建立了可行性的技术方案.     

吲唑类PI3Kδ选择性抑制剂活性 理论模型的构建

吲唑类PI3Kδ选择性抑制剂是一类新的靶向抗癌药物,有的已开始应用于临床.为了研究PI3Kδ抑制剂的活性pIC50与结构之间的定量结构-活性关系,在分子拓扑理论的基础上,计算了47个PI3Kδ抑制剂分子的分子形状指数和电性拓扑状态指数,筛选了分子形状指数的K_1,K_3,K_4和电性拓扑状态指数的E_7,E_(16),E_(19)共6种结构参数,建立了这些PI3Kδ抑制剂分子的活性与K_1,K_3,K_4,E_7,E_(16),E_(19)这6种结构参数的定量结构-活性相关性多元回归模型,并将这6种参数作为神经网络输入层变量,47个PI3Kδ抑制剂分子的活性为输出层变量,采用6∶4∶1的网络结构方式,建立了预测能力强的神经网络模型,其总相关系数r为0.979 4,利用该神经网络模型计算得到的预测活性值与实验值的平均相对误差为1.92%.结果表明,PI3Kδ选择性抑制剂的活性与6种分子结构参数之间有良好的非线性关系,基团的类型、基团的连接位置以及相互之间的作用均能影响PI3Kδ选择性抑制剂的活性.     

大鼠原代脂肪细胞中单个GLUT4囊泡的成像——全内反射荧光显微成像技术的应用

本研究采用高斯拟合算法与全内反射荧光显微技术（TIRFM），通过实时动态的单粒子追踪拍摄来分析原代培养大鼠脂肪细胞基础条件及胰岛素刺激下细胞膜附近绿色荧光蛋白(GFP)标记的GLUT4囊泡的运动变化.使用高斯拟合来消除光学成像系统中发生的原始样品中单像素点荧光强度值的污染，重建出囊泡真实的中心点荧光强度值.通过对序列图像中的囊泡点应用高斯拟合和相应的搜索算法，得到所有囊泡的高斯中心点荧光强度值序列，继而描绘出囊泡的动态转运路径.结果表明，基础条件下膜附近的多数GLUT4囊泡处于沿同一路径的快速长距离转运状态；胰岛素刺激后，长距离转运的GLUT4囊泡数量减少，多数GLUT4囊泡固定成团或者在原地摆动呈限制性的运动.当GLUT4囊泡锚定至膜上后，即迅速与膜融合.说明高斯拟合算法及全内反射荧光显微技术的结合可以很好地实现囊泡纳米尺度的三维实时追踪.     

仿刺参过氧化氢酶的克隆、表达及纯化

采用RT-PCR技术从仿刺参肠道组织中克隆了过氧化氢酶(Aj-CAT)蛋白的编码序列(CDS)。通过PCR扩增,成功构建了含有Aj-CAT编码序列的重组表达载体pET28c-Aj-CAT。通过热激法获得用于外源表达仿刺参过氧化氢酶蛋白的基因工程菌株BL21(DE3)/pET28c-Aj-CAT。IPTG诱导后,SDS-PAGE检测发现,基因工程菌能够在体外成功地表达融溶状态的仿刺参过氧化氢酶蛋白。利用镍离子亲和层析柱分离纯化,经200 mmol/L咪唑洗脱后,成功得到纯度为97.6%、能够清除过氧化氢的Aj-CAT蛋白。     

FGF-21改善谷氨酸钠引起的体内脂肪堆积

为研究成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)对谷氨酸钠(MSG)诱导的肥胖大鼠的脂肪代谢是否具有调节作用,给新生SD大鼠饲喂MSG至20周龄后,连续注射FGF-21(1 mg/kg)32 d,检测FGF-21注射前后大鼠体质量、Lee’s指数、进食量、腹部和皮下脂肪质量、血脂浓度、糖耐量和肝脂代谢中的相关指标.结果显示,与MSG对照组相比,FGF-21试验组大鼠体质量、Lee’s指数、腹部脂肪质量及脂肪细胞大小显著降低(P0.01),进食量没有明显变化;血糖、TG、TC、LDL-C浓度显著降低(P0.01),HDL-C浓度升高;脂肪中Glut-1水平显著上升(P0.05),Leptin mRNA的高表达水平显著下降(P0.01);肝脏的质量和肝脏中ALT、AST、ALP的水平得到改善,FGF-21、PPARα、PPARγmRNA水平显著下降(P0.05),脂肪肝得到恢复,糖耐受得到改善.以上结果表明,FGF-21明显改善由MSG诱导引起的体内脂肪堆积,对腹部脂肪的减少效果尤其显著,同时有效改善MSG肥胖大鼠的肝脂代谢水平,恢复脂肪肝.     

重组海参溶菌酶基因工程菌的构建及原核表达

根据GenBank中海刺参溶菌酶的cDNA序列(Accession no.EF036468),利用RT-PCR技术扩增出海刺参溶菌酶的基因片段(SL),将其克隆到原核表达载体pET-32a(+),得到重组质粒pET-32a(+)-SL,再转化至E.coil Rosetta(DE3)pLysS。利用IPTG诱导表达,重组蛋白经SDS-PAGE分析,得到一条分子质量约为31ku的特异条带。经过Western blotting分析鉴定,结果显示重组海参溶菌酶成功在大肠杆菌中表达,并且有部分可溶性蛋白,占总菌体蛋白约10%。这些结果为进一步研究海参溶菌酶的作用机理奠定基础。     

糖尿病胃动力障碍大鼠胃窦平滑肌中PDE2和PDE3蛋白表达变化

为了观察糖尿病胃动力障碍大鼠胃窦平滑肌组织中PDE2和PDE3的蛋白含量变化,由腹腔注射STZ制备糖尿病动物模型,利用多道生理信号记录系统记录糖尿病大鼠胃窦平滑肌收缩活动,将发生胃窦平滑肌收缩活动紊乱的大鼠列入糖尿病胃动力障碍模型,再采用免疫组织化学方法观察糖尿病胃动力障碍组大鼠胃窦平滑肌中PDE2和PDE3的分布。结果发现,糖尿病发病胃动力障碍大鼠与正常对照组相比,胃窦平滑肌组织PDE2表达无明显差异,但PDE3表达明显减少(P0.05)。因此,糖尿病大鼠发生胃动力障碍可能与胃窦平滑肌中PDE3下调有关,糖尿病大鼠胃c GMP-PDE3的改变可能参与胃动力障碍的发生。     

打印室PM2.5导致的体内外损伤与机制探究

为研究打印室PM2.5造成的体内外损伤及其机制,建立了细胞和小鼠模型来评估打印室PM2.5对细胞和肺损伤的影响及其可能的机制。结果表明:打印室PM2.5明显上调了细胞和小鼠体内磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)蛋白表达量,而磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路的激活,促进基质金属蛋白酶-2(MMP-2)蛋白表达量上调,MMP-2表达量上调加剧了细胞以及小鼠肺部纤维化的形成,同时,血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达量被下调,导致了血管生成的抑制作用(P<0.05)。打印室PM2.5还下调了小鼠体内B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白表达量,同时,上调了Bcl-2同源水溶性蛋白(BAX)的表达量。当这2个蛋白表达比例变化时,可以激活凋亡启动子Caspase-8和执行子Caspase-3,所以Caspase-8和Caspase-3蛋白的表达量在打印室PM2.5处理组中上调(P<0.05),预示了凋亡的开始。综上所述,打印室PM2.5的暴露明显加剧了细胞和小鼠体内纤维化、小鼠体内凋亡的发生,对长时间待在打印室的人员构成潜在威胁。     

镧对仔鼠皮质神经细胞BAX表达的影响

通过对染镧仔鼠皮质组织BAX mRNA和BAX蛋白表达的检测,探讨镧暴露对仔鼠皮质神经细胞BAX表达的影响。取Wistar雌性大鼠32只,随机分成对照组及低、中、高剂量LaCl_3组,各LaCl_3组饮水中镧(用LaCl_3配制)浓度分别为0.25%、0.5%和1.0%,每组8只动物。实验动物以自由饮水的方式进行镧暴露。子代大鼠在断乳前经由母体血循环和吸吮母乳染镧,断乳后则通过自行饮水摄入。在整个实验过程中记录孕鼠及仔鼠体重,在仔鼠出生后49 d麻醉处死。取仔鼠皮质组织,应用实时定量PCR检测BAX mRNA、用Western-blot检测BAX蛋白表达水平变化。结果显示仔鼠皮质重量逐渐下降,高、中剂量LaCl_3组仔鼠皮质重量低于对照组,皮质系数逐渐增加,差异有统计学意义(P0.05),这提示仔鼠脑发育已经受损。仔鼠皮质组织BAX mRNA和BAX蛋白表达在各剂量LaCl_3组之间出现差异,与对照组相比,高、中剂量LaCl_3组仔鼠皮质组织中BAX mRNA和BAX蛋白表达量明显增高,差异有统计学意义(P0.05);且随着LaCl_3暴露剂量的增加,仔鼠皮质BAX mRNA和BAX蛋白表达水平逐渐上升,差异有统计学意义(P 0.05)。提示镧暴露导致的仔鼠大脑皮质发育损伤,可能与皮质BAX mRNA和BAX蛋白表达水平升高有关系。     

四氧嘧啶致小鼠、大鼠糖尿病模型研究

目的：研究四氧嘧啶尾静脉注射小鼠和大鼠诱导糖尿病模型,观察不同剂量四氧嘧啶诱导糖尿病模型的稳定性。方法l分别对小鼠尾静脉注射四氧嘧啶60、70、80mg/kg和对大鼠尾静脉注射四氧嘧啶30、40、50mg/kg,测定不同时点小鼠和大鼠的血糖值及体重。结果60、70和80mg/kg四氧嘧啶剂量均可导致小鼠糖尿病模型,但70和80mg/kg剂量组小鼠死亡率较大,而60mg/kg组小鼠糖尿病模型稳定;30mg/kg四氧嘧啶剂量不能造成大鼠糖尿病模型,40和50mg/kg四氧嘧啶剂量均可导致大鼠糖尿病模型,但四氧嘧啶50mg/kg剂量组大鼠死亡率较大,只有40mg/kg组糖尿病大鼠模型稳定。结论：造成小鼠和大鼠糖尿病模型最佳剂量分别为60mg/kg和40mg/kg。     

Anti-Hyperglycemic Activity of Shan Tang Ping an Ethanol Extract from Yew Tree in Diabetic Rats

The extracts of yew tree have showed unique anti-tumor and anti-leakematic activities. Taxol extracted from it is effective against a variety of cancers, such as ovarian cancer and breast cancer. However the hypoglycemic efficacy of the extract has not been reported yet, so the effects of oral administration of yew tree extracts on streptozotocin-induced diabetic rats were examined. Administration of shah tang ping （STP）, a fraction from the column separation of extract （450 mg/kg body weight）, for 14 days reduced the serum glucose concentrations of fasted diabetic rats by 52.4%. In addition, it also decreased the concentrations of triglyceride （TG）, total cholesterol （TC）, and low density lipoprotein cholesterol （LDL-C）. An oral glucose tolerance test （OGTT） was performed, a significant improvement in glucose tolerance was observed in rats treated with STP. These results suggest that STP has hypoglycemic properties and hypolipidemic action on streptozotocin-induced diabetic rats.     

3种微生态制剂对幼刺参养殖水体水质的影响

对3种微生态制剂改善幼刺参养殖水体水质的效果进行了研究。试验设3个处理组,分别在水体中泼洒芽孢杆菌、海洋红酵母和EM菌;另设1个对照组,只投喂基础饵料。试验水体20L,试验期间不换水,每隔2d对pH、化学需氧量、氨氮及亚硝酸盐氮进行检测,氨氮超过0.15mg/L时结束试验。结果表明,在水体中泼洒3种微生态制剂均可改善水质,其中,EM菌和海洋红酵母具有降低化学需氧量的作用,EM菌和芽孢杆菌具有降解氨氮和亚硝酸盐氮的功能,EM菌改善水质的效果最好。     

重组海参溶菌酶的表达及其性质

研究了重组海参(Stichopus japonicus)溶菌酶(SjLys)可溶性表达的发酵条件。采用多因素正交优选法,以摇瓶培养方式从培养基组分、发酵条件两个方面对重组海参溶菌酶进行研究,构建了高效分泌型表达重组海参溶菌酶工程菌。研究结果发现,30℃、140r/min、IPTG浓度0.3mmol/L、诱导后继续培养14h,目的蛋白分泌表达量可达到30~40mg/L,且产物以大量可溶性蛋白存在。     

海参溶菌酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达与纯化

研究构建并筛选了具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(Stichopus japonicuslysozyme,SJL)的毕赤酵母工程菌。从海参肠组织中提取总RNA,根据已经测得的SJL的基因序列(GenBank accession No.EF036468)设计引物,以总RNA为模板经RT-PCR获得目的基因,并将该基因与表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-SJL,再转化至毕赤酵母GS115中。利用MD、MM和含抗生素G418的YPD平板培养基筛选出表型为His+Muts的高拷贝阳性菌株。挑选具有抑菌活性的菌株进行甲醇诱导表达液体发酵,其上清液经硫酸铵沉淀、透析后得到溶菌酶粗品,再经CM52-纤维素阳离子交换柱进一步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。结果显示,共筛选到7株有抑菌活性的重组酵母菌株,诱导72 h时表达量最高。SJL在毕赤酵母中得到成功表达。     

海刺参组织蛋白酶L基因的克隆、重组表达及活性鉴定

通过RT-PCR和RACE PCR技术,从海刺参(Stichopus japonicus)肠中克隆得到编码组织蛋白酶L(SjCL)基因,其中全长cDNA 1 287 bp,5′非编码区(UTR)202 bp,3′UTR 87 bp,开放阅读框(ORF)999 bp,编码332个氨基酸(aa),包括组织蛋白酶L成熟肽316 aa和信号肽16 aa,分子质量预测为35.3 ku。用SjCL序列与相似物种海胆、海葵等进行对比,可知SjCL具有组织蛋白酶L所特有的氨基酸保守区域ERFNIN和GNFD,以及由Cys 139,His 278和Asn 299残基组成的保守活性位点。将编码SjCL基因克隆进原核表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)-SjCL,转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞,再进行诱导表达、亲和纯化和透析复性,得到了纯化且具有活性的重组SjCL。酶活力检测结果表明,重组SjCL对组织蛋白酶L特异性底物Z-Phe-Arg-Nmec具有较高活性,而对组织蛋白酶B特异性底物Z-Arg-Arg-Nmec无活性。本实验对SjCL的cDNA序列进行了生物信息学分析并通过基因工程的手段表达出具有活性的重组SjCL,为进一步研究组织蛋白酶L在海刺参自溶过程中的作用提供理论基础。     

海参溶菌酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达与纯化

研究构建并筛选了具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(Stichopus japonicuslysozyme,SJL)的毕赤酵母工程菌。从海参肠组织中提取总RNA,根据已经测得的SJL的基因序列(GenBank accession No.EF036468)设计引物,以总RNA为模板经RT-PCR获得目的基因,并将该基因与表达载体pPIC9K连接,构建重组质粒pPIC9K-SJL,再转化至毕赤酵母GS115中。利用MD、MM和含抗生素G418的YPD平板培养基筛选出表型为His+Muts的高拷贝阳性菌株。挑选具有抑菌活性的菌株进行甲醇诱导表达液体发酵,其上清液经硫酸铵沉淀、透析后得到溶菌酶粗品,再经CM52-纤维素阳离子交换柱进一步纯化,得到电泳纯的溶菌酶。结果显示,共筛选到7株有抑菌活性的重组酵母菌株,诱导72 h时表达量最高。SJL在毕赤酵母中得到成功表达。     

鲍鱼性腺多糖的体内抗氧化活性

采用酶水解结合乙醇醇沉的方法从皱纹盘鲍性腺中提取多糖(CAGP),并研究其体内抗氧化活性.研究发现,对于正常小鼠,200 mg/kg的CAGP可有效提高其肝组织中CAT活力及T-AOC能力(P<0.01),降低血液与肝脏MDA浓度(P<0.01);CAGP还可显著降低脑组织MAO活力(P<0.01).对于四氧嘧啶致氧化...     

Effect of puerarin on the P13K pathway for glucose transportation and insulin signal transduction in adipocytes

To explore the effect of puerarin on insulin receptor (IR), insulin receptor substrate-1 (IRS-1) and protein expression of protein kinase B(PKB) in the P13K pathway of the glucose consumption, transportation and insulin signal transduction in 3T3-L1 adipocytes with insulin resistance. The insulin resistance 3T3-L1 adipocytes model was established by free fatty acid induction. The model cells were managed with puerarin in different concentrations. Glucose consumption was detected with glucose oxidase method, glucose transportation rate was determined by 2-deoxy-3H glucose ingesting method, and the IR, IRS-1 and PKB expression were determined by Western blot. Glucose consumption and transportation were significantly decreased in the model adipocytes, but increased after treated with puerarin (P<0.01). Moreover, the level of tyrosine phosphorylation of IR subunit β was higher in the puerarin treated groups, and that of IRS-1 was higher in the group treated with low dose puerarin than that in the model group. The 3T3-L1 adipocytes of insulin resistance model could be induced by free fatty acid successfully, puerarin could promote the glucose utilization in them to alleviate the insulin resistance, which may be related with the action in advancing the tyrosine phosphorylation of IR and IRS-1.     

设施环境下百菌清、毒死蜱在黄瓜中的分布特征

采用GC-MS研究大棚和露天条件下百菌清和毒死蜱在黄瓜植株中分布特征和残留量变化.结果表明:施用推荐剂量的两种农药在黄瓜各部位的残留量表现为叶片》果实＞茎＞根,其中大棚黄瓜叶中的百菌清、毒死蜱的平均残留量是568和183 mg/kg,露天黄瓜叶中百菌清、毒死蜱的平均残留量分别是1 76和15.9 mg/kg,叶中百菌清、毒死蜱残留量远远高于其他部位.在两种种植条件下黄瓜各部分中的农药在试验时间内残留量总体都呈下降趋势,但大棚黄瓜果实上的农药的残留消解速度要比露天慢.施药14 d后大棚黄瓜果实中的相应值分别为7.86和1.01 mg/kg,未达到国家标准.而施药7d后,露天条件下黄瓜中的农药残留量已达到国家标准.