乙型肝炎病毒表面抗原化学发光免疫诊断试剂的研制

目的 研制高敏感度、宽线性,且能定量的HBsAg化学发光免疫诊断试剂。方法 将碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)用改良过碘酸钠法标记抗-HBs单抗、山羊抗-HBs多抗,经亲和层析纯化用于制备固相包被板;国家标准品标定HBsAg校准品,优化反应条件,建立HBsAg双抗体夹心一步法检测试剂。结果 试剂灵敏度adr<0.2ng/ml,adw<0.5ng/ml,ay<0.5ng/ml,23份HBsAg阴性Pannel符合率100％;批内CV3％～4.04％,批间CV9.47％～12.5％;准确率91,9％～110.4％;检测限0.023ng/ml;0.1～200ng/ml范围线性相关系数r=0.999 1;与EIA试剂对比分析相对灵敏度100％,相对特异性99.03％;37℃放置12d稳定性与2～8℃存放无异。结论 该HBsAg化学发光免疫诊断试剂适合于临床诊断应用。     

EIA乙型肝炎表面抗体(抗-HBs)诊断试剂的研制

<正> 采集乙肝表面抗原携带者血浆,经(NH_4)_2SO_4沉淀、KBr浮升离心、蔗糖沉降法离心纯化HBsAg,胃酶消化、超过滤,获不含正常人血清蛋白成分的HB-sAg。SDS-PAGE纯度>90％,-20℃保存,待用于包被和标记用的HBsAg。用RIA法筛选HBsAg、抗-HBs及抗-HBc三项全阴的3～5份血清混合作为阴性对照。用RIA法测定抗-HBs阳性的血清调整约为50min/ml,作为阳性对照。检测程序为pH9.6碳酸盐     

人β-hCG化学发光免疫分析方法的建立

目的建立一种检测人血清hCG浓度的双抗体夹心化学发光免疫分析方法。方法采用2种高特异性的抗β-hCG单克隆抗体,以一种包被微孔板制成固相抗体,另一种标记碱性磷酸酶,以金刚烷衍生物为底物,采用双抗体夹心法检测人血清hCG浓度,并与进口试剂进行比较。结果以5μg/ml单克隆抗体包被微孔板,酶结合物以1∶10000稀释,在室温条件下检测,可测范围为5~540mIU/ml,灵敏度为0.143mIU/ml,批内、批间平均变异系数分别为5.28%和7.05%,平均回收率为98.77%,范围为92.3%~108.6%,与TSH、FSH和LH的交叉反应率均小于0.01%。与国外同类试剂有良好的相关性。结论该方法有较高的灵敏度、精密性和准确性。     

不同种类与剂量乙型肝炎疫苗在青年中的免疫效果及安全性

目的探讨不同种类与剂量乙型肝炎疫苗在青年中的免疫效果及安全性。方法在江西省上饶市卫生学校抽取乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阴性、健康状况良好的15²0岁学生910名,随机分为A、B、C 3组,按照0、1、6月免疫程序,分别经上臂外侧三角肌全程接种3针10μg/ml重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)、20μg/ml重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)和10μg/ml重组乙型肝炎疫苗(酵母),全程免疫后1个月采集接种者静脉血,分离血清,采用放射免疫法检测抗-HBs水平,并进行安全性观察。结果全程免疫后1个月,A组与C组抗体阳转率、抗-HBs GMC水平和分布相近,差异均无统计学意义(P>0.05);B组的抗体阳转率、抗-HBs GMC水平和≥500 mIU/ml的分布均明显高于A组和C组(P均<0.01),抗-HBs GMC﹤10和1020岁学生910名,随机分为A、B、C 3组,按照0、1、6月免疫程序,分别经上臂外侧三角肌全程接种3针10μg/ml重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)、20μg/ml重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)和10μg/ml重组乙型肝炎疫苗(酵母),全程免疫后1个月采集接种者静脉血,分离血清,采用放射免疫法检测抗-HBs水平,并进行安全性观察。结果全程免疫后1个月,A组与C组抗体阳转率、抗-HBs GMC水平和分布相近,差异均无统计学意义(P>0.05);B组的抗体阳转率、抗-HBs GMC水平和≥500 mIU/ml的分布均明显高于A组和C组(P均<0.01),抗-HBs GMC﹤10和10⁴99 mIU/ml的分布显著低于A组和C组(P<0.01或<0.001)。有1名接种者在接种后0.5 h有局部疼痛症状,第2天疼痛消失,未见其他局部及全身不良反应。结论接种高剂量乙肝疫苗的抗-HBs阳转率和抗-HBs GMC水平均高于低剂量乙肝疫苗,提示青年应接种高剂量乙肝疫苗,以建立有效的防御乙肝的免疫屏障。     

乙型肝炎疫苗和卡介苗同时或分别接种的抗-HBs持久性

对乙肝疫苗和卡介苗同时或分别接种的抗-HBs的持久性进行了研究。同时接种组(1组)和分别接种组(2、3A、3B组)的抗-HBs阴转率和GMT均无显著差异,提示乙肝疫苗和卡介苗可以同时接种。抗-HBs的持久性与全程免疫后抗-HBs的峰值呈正相关,峰值<100 mIU/ml者,3年后有43.48％抗体转阴。建议全程后抗-HBs<100 mIU/ml者,3年后宜加强一针。     

狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立及初步应用

目的建立狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法,用于不同株狂犬病疫苗免疫后抗体水平的检测。方法用市售的不同狂犬病疫苗株抗原免疫NIH小鼠,制备免疫血清,用不同的疫苗株抗原包被酶标板,分别测定小鼠血清抗体效价,并通过不同株抗原抗体的交叉中和实验,分析抗原的差异性;在此基础上,将不同毒株抗原按不同比例混合包被酶标板,分别测定阳性血清样本,并与快速免疫荧光抑制试验(RFFIT)检测结果比较,确定包被抗原模式,建立狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法,绘制标准曲线,确定最佳定量范围及灵敏度,确定Cut-off值;并对其特异性、精密性、准确性及稳定性进行验证;用建立的方法与其他市售狂犬病病毒抗体检测试剂分别检测血清样品,分析检测结果的一致性及相关性。结果狂犬病病毒抗原AG∶CTN-1=4∶1为最适包被抗原模式,试剂经优化后,检测抗体效价范围在535.00～33.44 mIU/ml之间,具有良好的线性关系(r>0.99),最低检出限为8.36 mIU/ml,Cut-off值为0.735 mIU。该方法检测人血清白蛋白、破伤风阳性血清、乙肝表面抗原阳性血清、白喉阳性质控血清均未发生反应;试验内变异系数在6.68%～7.84%之间;回收率在97.25%～104.50%之间;试剂置37℃3 d,与4℃保存试剂测定结果差异无统计学意义(P>0.05)。该方法检测血清样品与市售狂犬病病毒抗体检测试剂比较,均具有良好的一致性;与RFFIT测定结果比较,二者差异无统计学意义(P>0.05),回归方程为Y=-0.475+3.246 X,相关系数为0.801。结论已建立了狂犬病病毒抗体竞争ELISA检测方法,可用于大规模狂犬病病毒抗体的筛查。     

抗狂犬病马血清效价ELISA检测试剂的制备

目的制备检测抗狂犬病马血清效价的ELISA试剂。方法采用ELISA间接法。先用抗狂犬病病毒IgY包被酶标板,并确定其最适包被浓度;制备酶标二抗,并确定其最佳使用浓度。对试剂的灵敏度、特异性、精密性、稳定性及与小鼠中和试验结果的相关性进行考核。结果抗狂犬病病毒IgY和酶标二抗的最适浓度分别为10!g/ml和1∶1500,试剂灵敏度为0.072IU/ml,特异性良好,批间及试验间变异系数均小于11%,37℃放置3和5d检测样品结果与放置前差异无显著意义,与小鼠中和试验结果呈正相关。结论所制备的抗狂犬病马血清效价ELISA检测试剂盒,可用于抗狂犬病马血清效价的检测。     

应用PHA参比定位判定法检测抗-HBs

<正> 采用被动血凝(PHA)测定抗-HBs效价,通常是以其最高稀释度凝集终点的稀释倍数判定。这种判定方法常受诊断血球灵敏度变化的影响,使抗-HBs滴度波动很大。PHA参比定位判定法,则可避免其影响,使测定结果更准确。 PHA参比定位判定法是根据1990年版中国生物制品规程,即制备乙型肝炎特异性免疫球蛋白用原料血浆抗-HBs效价应不低于8IU/ml的规定而建立的。其基点是以中国药品生物制品检定所提供的抗-HBs质控血清为标准,标定出符合8IU/ml参比品作为尺度来衡量被检品的检测结果。     

乙型肝炎血源疫苗加强免疫后2年的抗体应答

应用乙型肝炎血源疫苗，按0、1、2月免疫程序，每一次接种10μg，接种后5年的抗体阳转率为72．0％，平均抗HBs水平为40．5mIU／ml。在接种后5年加强免疫1次（10μg），1个月后的抗体阳转率升高到97.3％，平均抗-HBs水平升高到548．8mIU，／ml（详见本刊1991，4（4）；181）。本文是报道加强免疫后2年的抗体应答。共采集血样65份，应用美国Abbott试剂盒，SPRIA方法检测，抗体阳转率为90．8％，平均抗-HBS水平为362.3mIU／ml。与加强免疫后1个月的抗体水平无明显差异，仍能维持在较高水平。对其中抗体阴转的6例又进行了HBsAg和抗-HB…     

应用IU标准对HBsAg检测试剂的分析

目的应用IU标准对HBsAg检测试剂进行比较分析。方法筛选1份HBsAg阳性血浆,血清学检测证实为HBsAg adr亚型,参照WHO HBsAg标准品稀释方法进行稀释,以IU为单位的HBsAg国际标准品为标准,应用双平行线终点稀释方法对该样品进行定量标定。以标定的IU为单位样品,对国内外13家HBsAg检测试剂进行检测。结果待标定的样品经平行稀释后,测定的浓度值与理论浓度值误差均在11%以内,应用IU标准对国内外HBsAg检测试剂进行检测,国外试剂的最低检出限可达0.02~0.06IU/ml,国产试剂除1家可达0.14IU/ml外,其余试剂均在0.29~0.91IU/ml之间。结论应用IU标准检测HBsAg检测试剂,国外试剂的灵敏度明显高于国内试剂。     

BCG-CpG-DNA对重组HBsAg的免疫佐剂作用

目的研究BCG-CpG-DNA对重组HBsAg的免疫佐剂作用。方法以BCG-CpG-DNA与重组HBsAg混合免疫小鼠,以铝佐剂疫苗为对照,采用放射免疫法检测抗-HBs中和抗体水平,ELISA法分析抗体亚类,酶联免疫斑点试验(ELIS-POT)检测CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)功能。结果BCG-CpG-DNA能提高抗-HBs中和抗体水平,促进抗原特异性IgG2a的产生,诱导Th1型免疫应答,与铝佐剂协同作用能部分逆转Th2反应。同时能增强抗原特异性CD8+T淋巴细胞的杀伤作用,实验组与对照组比较差异有显著意义。结论BCG-CpG-DNA对HBsAg有较好的免疫佐剂作用,有可能成为一种新型的免疫佐剂。     

广州市不同地区10岁以下儿童乙型肝炎疫苗免疫效果评价

目的评价广州市不同地区10岁以下儿童乙型肝炎疫苗免疫效果。方法对本市老城区、新城区和农村1995~2005年出生、接受乙型肝炎疫苗全程免疫的儿童,按分层随机抽样3890人,检测其HBsAg和抗-HBs水平,并计算阳性率。结果1995~2005年,三地区出生的儿童HBsAg阳性率逐年下降,抗-HBs阳性率逐年上升;老城区HBsAg阳性率比新城区和农村明显下降,老城区和新城区抗-HBs阳性率比农村明显上升;三地区10、5、0岁儿童HBsAg阳性率依次下降,抗-HBs阳性率依次上升。结论广州市10岁以下儿童乙肝疫苗免疫保持在高水平,农村的乙肝疫苗免疫效果较老城区和新城区偏低,可能是造成乙型肝炎发病率高的主要原因之一。     

Vero细胞HCP试剂盒的稳定性观察

目的观察Vero细胞HCP试剂盒的稳定性。方法将Vero细胞HCP试剂盒分别于2～8℃和37℃放置不同时间,检测试剂盒的灵敏度、特异性、准确性及精密性。结果试剂盒在2～8℃放置10个月的特异性及灵敏度均较好;检测参考品的回收率在91.7%～114.8%之间;对不同制品检测结果的变异系数均小于10%。37℃放置7d,试剂盒的灵敏度仍可达12.5ng/ml;放置10d,检测参考品的回收率在85%～115%之间;对不同制品检测结果的变异系数均小于10%。结论Vero细胞HCP试剂盒于2～8℃放置10个月及37℃放置7d的稳定性较好,仍可正常使用。     

白细胞介素-2基因佐剂对乙型肝炎疫苗免疫效果的影响

目的研究白细胞介素-2基因佐剂对乙型肝炎疫苗免疫效果的影响。方法利用分子生物学技术构建含IL-2基因的重组质粒pcDNA3.1/IL-2,经测序鉴定、碱裂解法大量提取及Sepharose4FF柱层析纯化,得到重组质粒pcDNA3.1/IL-2和pcDNA3.1/S,免疫豚鼠后,经ELISA检测豚鼠血清中抗HBsAg滴度,CTLL-2细胞株/MTT法检测IL-2活性。结果序列测定和分析结果表明重组质粒pcDNA3.1/IL-2构建正确。血清中抗HBsAg抗体滴度:铝佐剂+HBsAg组为2116mIU;IL-2+HBsAg组为1987mIU;质粒pcDNA3.1/IL-2+HBsAg组为2252mIU;质粒pcDNA3.1+IL-2+pcDNA3.1/S组为67·19mIU;质粒pcDNA3.1/S组为50·88mIU。重组质粒pcDNA3.1/IL-2免疫1周后,IL-2表达水平达高峰,以后逐渐降低,但1个月后IL-2水平仍高于空白对照组。对抗HBsAg抗体滴度和IL-2活性的检测结果进行统计学分析表明,各组间差异有显著意义(P<0·05)。结论IL-2基因佐剂可以增强乙肝重组疫苗和乙肝DNA疫苗的免疫效果。     

化学发光免疫分析法检测人血清孕酮

目的研究用化学发光免疫分析法(CLIA)检测人血清孕酮(PROG)。方法采用竞争抑制法,用高亲和力的多克隆抗体包被,碱性磷酸酶标记孕酮,金刚烷增敏化学发光体系作为酶底物来检测PROG。并考察试剂的灵敏度、精密性、准确性、特异性和测定范围。将试剂盒置4℃存放14个月,检测质控血清的PROG含量,考察试剂的稳定性。并与进口试剂进行比较。结果CLIA法检测PROG灵敏度达0.1ng/ml;特异度99.5%;测定范围在0.1～200ng/ml之间;用PROG浓度分别为高、中、低的质控血清测定精密性,批内和批间变异系数均小于10%,回收率在91.7%～108.4%之间;与雌二醇、雌三醇和雌酮的交叉反应率低于0.1%,与睾酮和可的松无交叉反应;试剂在4℃存放14个月,质控血清的测定值均在规定范围内;与进口全自动化学发光试剂BeckmanAccessTM相比有较好的相关性。二者测定结果的符合率为99.2%。结论化学发光法灵敏度高,特异性好,稳定性强,检测范围宽,有很好的准确性和精密性,是现有放射免疫法的理想替代方法。     

α1-酸性糖蛋白单克隆抗体的制备及检测方法的建立

目的制备α1-酸性糖蛋白(α1-Acid glycoprotein,α1-AGP)单克隆抗体(McAb),建立α1-AGP的ELISA检测方法,用于检测人体血液、尿液及各种组织液中α1-AGP的水平。方法用高氯酸沉淀人血清中α1-AGP,经离子交换层析和高压液相层析纯化后,免疫BALB/c小鼠,建立特异性抗α1-AGP单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备并鉴定McAbs,分析各株分泌抗体的效价、特异性、位阻群、类及亚类。制备针对α1-AGP的双抗体夹心ELISA检测试剂盒,分析其稳定性、灵敏度和特异性,并进行临床评价。结果建立了9株特异性抗α1-AGP单克隆抗体杂交瘤细胞株,均分泌IgG抗体,所有抗体的轻链均为κ链。根据位阻分析结果,将9个细胞株分泌的抗体分为5个位阻群,腹水效价在1×10-4~1×10-7之间,且均有较好特异性。制备的α1-AGP双抗体夹心ELISA试剂盒灵敏度达2ng/ml,且检测结果与α1-AGP含量呈现良好的线性关系(r=0.9916),并与其他血清蛋白无交叉反应,试剂盒置37℃放置3d及4℃放置2个月,稳定性良好。用该试剂盒检测96份正常人血样,其α1-AGP平均值为0.43~1.32mg/ml;105份Ⅱ型糖尿病患者血样,其平均值为0.88~2.35mg/ml,经统计学分析,两者差异有显著意义。结论已成功制备出α1-AGP McAb,并建立了针对α1-AGP的双抗体夹心ELISA,制备的试剂盒可用于临床检测。