阴离子交换法去除类人胶原蛋白中的内毒素

采用响应面法优化阴离子交换层析去除重组类人胶原蛋白(HLC)溶液中内毒素的工艺.利用单因素试验考察HLC质量浓度、NaCl浓度和pH值对内毒素去除率的影响,以内毒素去除率和HLC回收率为指标,对三因素进行中心复合设计,并经响应面法优化,分析得到二次多项式回归方程的预测模型.去除内毒素的最佳工艺条件为:HLC质量浓度0....     

Triton X-114萃取法去除脑膜炎球菌荚膜多糖中的内毒素

目的采用Triton X-114萃取法去除A群脑膜炎球菌荚膜多糖中的内毒素。方法1% Triton X-114与多糖溶液在0℃混合均匀,分别加热至25、37和56℃,观察分层情况。离心后收集上层水相,对其中残余萃取剂Triton X-114进行去除方法的选择。比较多糖浓度对萃取的影响及二次萃取的效果,并对终产物进行全面检定。对W135群和Y群脑膜炎球菌多糖进行萃取效果比较。结果最终选择56℃10min作为升温条件,3000r/min离心10min后,上清中多糖的内毒率含量均减少85%以上,多糖回收率不低于80%。残余的Triton X-114选择透析法去除。多糖浓度越低,越易于萃取。二次萃取多糖回收率大于85%。内毒素含量可降低至0.706EU/μg多糖。经检测,终产物多糖的相对分子质量未发生改变,免疫原性与萃取前差异无显著意义,异常毒性、多糖及内毒素含量合格。蛋白含量稍有增加,核酸含量降低。W135群和Y群脑膜炎球菌多糖的萃取结果与A群多糖相似。结论Triton X-114萃取法可以用于去除脑膜炎球菌多糖中的内毒素。     

去除无细胞百日咳疫苗丝状血凝素纯化液中内毒素TritonX-114液相分离法的建立及其效果评价

目的 建立去除无细胞百日咳疫苗丝状血凝素（filamentous hemagglutinin,FHA）纯化液中内毒素的TritonX-114液相分离法,并评价其效果。方法 以影响TritonX-114液相分离法效果的TritonX-114加入量、4℃混匀时间、37℃分层时间、25℃16 743×g离心时间为试验因素,每个因素设计3个水平,通过正交试验设计12组试验。每组试验获得的样品均检测蛋白回收率,以蛋白回收率最高的条件为最佳。采用最佳条件去除3批无细胞百日咳疫苗FHA纯化液内毒素,检测FHA蛋白含量、内毒素含量及TritonX-114残留量。结果 TritonX-114液相分离法最佳条件：TritonX-114加入量为1%,4℃混匀时间为30 min,37℃分层时间为60 min,25℃167 43×g离心时间为10 min。最佳条件下去除3批无细胞百日咳疫苗FHA纯化液内毒素后,内毒素含量均<0.25 EU/mL,TritonX-114残留量均值为0.183%,蛋白回收率均值为91.04%。结论 TritonX-114液相分离法能够有效去除无细胞百日咳疫苗FHA纯化液中的内...     

去除百日咳毒素、丝状血凝素中内毒素的工艺探索

目的探讨无细胞百日咳疫苗纯化工艺中百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)的内毒素去除问题。方法选用Triton法和离子交换层析法,分别对百日咳杆菌发酵液上清和经Capto SP Imp Res柱纯化的发酵液进行内毒素去除,按《中国药典》三部(2015版)相关方法检测纯化样品的蛋白含量、内毒素含量、抗原含量,并进行SDS-PAGE分析。结果使用Triton法和离子交换层析法均可以将FHA和PT这两种成分的内毒素在脱毒前阶段降低至200 EU/mg以下。在合适的纯化条件下使用离子层析去除内毒素的能力高于Triton法,而在对抗原的回收率上Triton法又稍占优势。结论使用Triton法和离子交换层析法均可解决FHA和PT去除内毒素的问题,两类工艺下对目的蛋白活性的影响有待进一步研究。     

抗肝癌基因疫苗内毒素去除方法的建立

目的建立去除抗肝癌基因疫苗pVAX1-aLCGV内毒素的方法。方法采用Triton X-114液相分离法去除抗肝癌基因疫苗中的内毒素,鲎试剂法检测疫苗中的内毒素含量,家兔法复试,ELISA法检测内毒素入血前后血浆中细胞因子TNF-α和IL-8的含量及疫苗的免疫原性,并比较处理前后的基因疫苗转染SMMC-7721和HepG2细胞的转染效率。结果经Triton X-114处理后,基因疫苗的内毒素含量及热原检测均合格;内毒素入血后,血浆中TNF-α和IL-8的含量均明显升高;疫苗的免疫原性与处理前比较,差异无统计学意义;处理后疫苗质粒的细胞转染效率增高。结论 Triton X-114能有效去除基因疫苗pVAX1-aLCGV中的内毒素,为其临床应用奠定了基础。     

TritonX-114残留量检测方法的建立及验证

目的建立测定生物制品中Triton X-114残留量的方法,并进行验证及初步应用。方法先对Triton X-114进行光谱扫描,用所得到的特异吸收峰来初步检测Triton X-114的残留量,再根据Triton X-114与苯酚发生反应并产生具有一定浊度的复合物,且浊度与Triton X-114的浓度成正比的原理,通过测定340 nm处吸光度值,建立测定Triton X-114残留量的方法,并对方法进行稳定性、准确性、精密性验证。考察核酸和蛋白对Triton X-114含量测定的影响,并分别采用紫外吸光法和建立的方法检测样品中的Triton X-114含量。结果 Triton X-114在280 nm左右有特异吸收峰,可通过测定280 nm处的吸光度值来初步测定Triton X-114的残留量;利用Triton X-114与苯酚发生反应后产物的A340值来测定Triton X-114含量的方法的线性范围为0.001%~0.007%,检测下限为0.001%;建立标准曲线后,每间隔5 min测定1次A340值,各浓度标准品A340值的变异系数(CV)均小于5%;低(0.001%)、中(0.003%)、高(0.006%)浓度Triton X-114溶液连续测定3次,每个浓度平行测定9组的CV值均<5%,回收率均>100%;核酸和蛋白对该方法测定Triton X-114的含量无影响;4份样品经两种方法检测的试验内CV值均<10%。结论可采用280 nm紫外吸收法初步测定Triton X-114的含量,但该法灵敏度低,易受干扰;而采用Triton X-114与苯酚反应后检测其产物浊度的方法来测定Triton X-114的残留量,稳定性、精密性良好,准确性高,可用于生物制品中Triton X-114残留量的检测。     

类人胶原蛋白与Ca(Ⅱ)相互作用的荧光光谱研究

为了制备具有实际应用价值并能应用于人体的类人胶原蛋白-钙螯合物,采用荧光猝灭光谱法和紫外-可见吸收光谱法研究不同温度下类人胶原蛋白(HLC)分子与无机金属Ca(Ⅱ)离子间的相互作用,其中Ca(Ⅱ)离子的浓度为1.0×10-5—1.0×10-4mol/L。实验结果表明:无机Ca(Ⅱ)离子能够猝灭类人胶原蛋白分子的内源荧光,并形成HLC-Ca(Ⅱ)复合物;依据Stern-Volmer方程可知在类人胶原蛋白与Ca(Ⅱ)的结合过程中,动态猝灭和静态猝灭这2种猝灭机制同时存在;类人胶原蛋白分子与Ca(Ⅱ)离子以摩尔比1∶1形成蛋白-金属螯合物;根据273 K和298 K时Ca(Ⅱ)与HLC分子之间的结合常数以及相应的热力学参数可确定二者间的结合是自发反应过程,其中疏水作用力占据主导地位。因此,本研究为类人胶原蛋白-Ca(Ⅱ)复合物的大规模制备和进一步应用研究提供了理论依据和实验指导。     

流感病毒裂解工艺的优化

目的探讨影响流感病毒裂解的因素,优化流感病毒裂解工艺。方法分别在不同裂解时间(Triton X-100裂解1、2、3和4 h)、不同终浓度的裂解剂(终浓度为0.5%、0.6%、0.7%和0.8%的Triton X-100)、不同总蛋白浓度(2 000、3 000和4 000μg/ml)及不同的离子强度[终浓度为0.01、0.05、0.1和0.5 mol/L的PBS(p H 7.2)]下,对流感病毒进行裂解,电镜下观察病毒裂解效果,同时采用免疫单扩散法检测血凝素含量,Lowry法检测总蛋白含量,计算蛋白含量/血凝素含量比值(裂解后病毒纯度)及血凝素回收率,确定最佳裂解工艺参数。结果当裂解前病毒纯化液蛋白含量范围为2 000~3 000μg/ml,PBS终浓度为0.1 mol/L时,利用终浓度为0.7%~0.8%的Triton X-100裂解流感病毒2 h,可获得最佳裂解效果。结论确定了流感病毒最佳裂解参数,优化了流感病毒裂解疫苗生产中的裂解工艺。     

木质素酚吸附内毒素的研究

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的外层脂多糖组分,可引起机体发热反应,重症将导致休克。内毒素对热或有机溶剂都十分稳定,通常的灭菌操作难以使之除去。研究结果表明,采用室温相分离法从木材中分离制得的木质素—酚的衍生物能吸附内毒素。在室温下,50 mg木素酚可以吸附存在于水溶液中的内毒素1000~2000 EU。加入有机溶剂后木素酚释放出被它吸附的内毒素。分离纯化后的木素酚又可以重新吸附内毒素。木素酚有望作为吸附、清除内毒素的功能性材料在医疗行业推广应用。     

荧光光谱法研究类人胶原蛋白与Zn(Ⅱ)的相互作用

以最终制备对人体安全无毒且补锌效果良好的类人胶原蛋白-锌螯合物为目标,利用紫外-可见吸收光谱法和荧光光谱法对类人胶原蛋白分子(HLC)与金属Zn(Ⅱ)离子之间的相互作用方式和机理进行了研究,其中Zn(Ⅱ)离子浓度为1.0×10-5—1.0×10-4mol/L;并通过荧光猝灭法计算出不同温度下(298 K和273 K)HLC分子与Zn(Ⅱ)离子之间的结合常数以及相应的热力学参数。研究结果表明:Zn(Ⅱ)离子对类人胶原蛋白的内源荧光有猝灭作用;根据Stern-Volmer方程的求解结果可知猝灭机制属于动态猝灭和静态猝灭;类人胶原蛋白分子和Zn(Ⅱ)离子以摩尔比1∶1形成胶原蛋白-锌螯合物;二者间的结合为自发反应,且相互作用力主要为疏水作用力。因此,文中的研究结果对类人胶原蛋白-Zn(Ⅱ)螯合物的工业化制备、理化性质探究以及进一步的应用研究提供了实验依据和理论基础。