基于CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌进行绿色荧光蛋白标记

乳酸乳球菌是治疗剂在体内运送的良好载体,研究其在体内的真实运送情况需对其进行标记。该实验利用CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000进行增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)标记,用于研究乳酸乳球菌在体内的运送,评价其作为益生菌的功能。基于该实验室已构建的乳酸乳球菌CRISPR/Cas9编辑质粒pLL25构建重组质粒pYSH,其上携带eGFP及同源臂,电转入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中,将基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldh)替换为绿色荧光蛋白基因,从而使Lactococcus lactis NZ9000获得标记,表达绿色荧光蛋白。对绿色荧光标记的Lactococcus lactis NZ9000突变株,酶标仪定量分析eGFP的表达强度。荧光强度定量分析结果表明,在乳酸乳球菌不同生长阶段,eGFP基因均能稳定表达。     

基于CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌进行绿色荧光蛋白标记

乳酸乳球菌是治疗剂在体内运送的良好载体,研究其在体内的真实运送情况需对其进行标记。该实验利用CRISPR/Cas9系统对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000进行增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)标记,用于研究乳酸乳球菌在体内的运送,评价其作为益生菌的功能。基于该实验室已构建的乳酸乳球菌CRISPR/Cas9编辑质粒pLL25构建重组质粒pYSH,其上携带eGFP及同源臂,电转入乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞中,将基因组中的乳酸脱氢酶基因(ldh)替换为绿色荧光蛋白基因,从而使Lactococcus lactis NZ9000获得标记,表达绿色荧光蛋白。对绿色荧光标记的Lactococcus lactis NZ9000突变株,酶标仪定量分析eGFP的表达强度。荧光强度定量分析结果表明,在乳酸乳球菌不同生长阶段,eGFP基因均能稳定表达。     

大豆锰超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的分泌表达

为使大豆锰超氧化物歧化酶（Mn superoxide dismutase,MnSOD）在乳酸乳球菌中高效表达,将克隆的MnSOD基因开放阅读框序列分别重组到质粒pNZ8149和经改造的质粒pNZS上,表达载体pNZ-SOD和分泌表达载体pNZS-SOD,将两者分别以电穿孔法转化乳酸乳球菌L. lactis NZ3900,经Elliker琼脂板筛选、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）、酶切鉴定正确后,获得的两重组菌株加入Nisin进行诱导表达,对L. lactisNZ3900/pNZ-SOD和L. lactis NZ3900/pNZS-SOD的表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和酶活性对比分析。结果显示：L. lactis NZ3900/pNZS-SOD菌株表达SOD总活性约是L. lactis NZ3900/pNZ-SOD菌株的1.6 倍,是L. lactis NZ3900/pNZ8149的13.5倍,且可将表达的约2/3的SOD分泌到胞外,表明经改造的乳酸菌分泌表达系统L. lactis NZ3900/pNZS能够分泌表达SOD,并增强SOD的表达。     

乳酸乳球菌两组分食品级NICE系统载体的构建

乳酸菌食品级NICE系统是目前较理想的可控制蛋白质生产的食品级诱导表达系统。本实验构建的食品级表达载体pRNA48含α-aga食品级选择标记、θ型复制子和nisA启动子，与宿主菌L．hctis NZ9000共同构成乳酸乳球菌食品级NICE系统，可用于目的基因在乳酸乳球菌中高效诱导表达。     

基于尿嘧啶磷酸核糖转移酶为负向筛选标记的生酮古龙酸杆菌基因组无痕修饰系统的构建

通过构建尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)敲除打靶质粒,采用同源重组的方法获得了生酮古龙酸杆菌(Ketogulonigenium vulgare)的upp基因缺失突变株K.vulgareΔupp,可作为基因组无痕修饰系统底盘细胞的upp基因表达载体,转化突变株K.vulgareΔupp,获得upp基因回补菌株PBB-upp,并验证了upp作为负向筛选标记的可行性。实验结果表明:突变株Δupp在1 mg/m L的5-氟尿嘧啶培养基上可生长,野生型和回补菌株PBB-upp不能生长,3株菌对5-氟尿嘧啶的抗性存在显著差异,说明可以将upp基因作为负向筛选标记,与正向筛选标记相结合,在upp基因缺失的底盘细胞基础上通过两次同源重组,实现基因组的无痕修饰与改造。     

植物乳杆菌melA基因的克隆及其作为食品级筛选标记的初步研究

以L. plantarum1.557的基因组DNA为模板,通过PCR技术成功克隆α-半乳糖苷酶基因(melA基因),与报道的melA基因序列同源性达到99%以上。再以大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pMG36e为基本骨架,将melA基因插入该载体,构建melA基因标记的穿梭表达载体pMG36e-melA。重组表达质粒pMG36e-melA经Sac I和Sph I双酶切和PCR鉴定与预期片段大小相符。结果表明已初步构建了以melA基因为食品级筛选标记的重组载体。     

棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶的乳酸乳球菌表达

构建棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶食品级分泌表达载体并在乳酸乳球菌MG1363(L.lactis MG1363)中实现表达。通过PCR扩增L.lactis MG1363基因组中分泌信号肽Usp45、质粒pLEB590的乳链菌肽(Nisin)抗性基因NisI和质粒pPIC9k-Abgl的棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶基因Abgl,PCR方法连接后获得片段Usp45-Abgl-NisI,将其克隆到质粒pMD19中,CaCl2法转化到E.coli DH5α,测序鉴定后将该片段连接到大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒pMG36e中并转化到E.coli XL1-Blue,得重组子E.coli XL1-Blue/pMG36e-Usp45-Abgl-NisI。通过PCR方法敲除质粒pMG36e-Usp45-Abgl-NisI中红霉素抗性基因以构建食品级分泌载体pMG36N-Usp45-Abgl-NisI,将其电转到L.lactis MG1363中。转化子E.coli XL1-Blue/pMG36e-Usp45-Abgl-NisI能将β-葡萄糖苷酶分泌到胞外使七叶苷平板显色,L.lactis MG1363/pMG36N-Usp45-Abgl-NisI能在20 IU/mL Nisin上生长,经RT-PCR验证β-葡萄糖苷酶在乳酸乳球菌中实现表达。表明分泌型表达载体构建成功,为其在乳酸乳球菌中实现食品级活性表达奠定基础。     

rDNA介导的乳酸克鲁维酵母整合型表达载体的构建及初步验证

构建一个适用于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)稳定的整合型表达载体,并通过鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)来源的腺苷酸脱氨酶基因(AMPD)的表达对该载体进行初步验证。以质粒pMD 19T-simple为空骨架,K. lactis GG799来源的18S rDNA序列为同源重组位点,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的半乳糖苷酶启动子(pScGAL7)为外源基因调控元件,乙酰胺酶基因(amdS)为筛选标记,AMPD为报告基因,构建重组表达载体pTRGA-amdS。载体经Sac Ⅱ线性化后,去除了大肠杆菌(Escherichia coli)来源的ori和氨苄青霉素抗性基因(Ampr),将同源重组片段电转化K. lactis GG799得到重组菌,利用实时荧光定量PCR (RTQPCR)测定重组菌AMPD基因整合拷贝数为1～3,AMP脱氨酶酶活测定结果表明:酶活与拷贝数呈正相关,含3个整合拷贝的重组菌在半乳糖诱导下酶活提高了32.6%,达到(590±13.33) U/mL。在无选择压力下重组菌连续生长58世代稳定性为98.59%。通过载体pTRGA-amdS的构建与应用实现了外源基因在K. lactis中的稳定表达,初步探究了18S rDNA在同源重组中的作用,为K. lactis的进一步分子改造提供参考。     

表达外源谷氨酸脱羧酶基因对重组乳酸乳球菌胁迫抗性的影响

通过在乳酸乳球菌（Lactobacillus lactis）NZ9000外源添加一定浓度的γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid,GABA）和表达可以合成GABA的谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase,GAD）两种方式,研究L. lactis NZ9000在酸胁迫和冷冻胁迫下的表现。结果表明：外源添加GABA的手段对于L. lactis NZ9000在酸胁迫和冷冻胁迫下的生长没有明显帮助。与之相反,通过逆转录-聚合酶链式反应克隆茶树中的CsGAD,构建pNZ8148-CsGAD表达载体,可获得高效表达GAD的基因工程重组菌L.?lactis?NZ9000/pNZ8148-CsGAD。经2?ng/mL乳酸链球菌素（Nisin）诱导8?h后,高效液相色谱检测表明重组菌合成GABA能力提高5?倍以上。生长曲线测定结果表明,正常培养条件下,重组菌到达对数生长平台期的时间较对照菌延长,到达稳定期的最大生物量（OD600?nm）提高至对照菌的1.5?倍;在pH?4.0的酸性培养条件下,对照菌基本不生长,而重组菌仍保持一定的生长力。低温胁迫实验结果表明,培养至稳定期后期的乳酸菌抗冻能力和存活率均要高于对数期中期和稳定期前期2?个培养阶段,且不同培养阶段中,重组菌的存活率均高于对照菌1～2?个数量级。综上所述,重组的L.?lactis?NZ9000/pNZ8148-CsGAD能够通过食品级异源表达CsGAD产生的GABA显著提高乳酸菌抗酸和抗冷冻胁迫的能力。本研究为探索研究乳酸菌抗胁迫机理、改良乳酸菌生长状态以利于其工业化用途的扩展提供了参考。     

双重抗性筛选辅酶Q10高产菌株

以米曲霉（Aspergillus oryzae）Asp11为出发菌株,利用紫外线诱变处理,以制霉菌素和维生素K₃双抗性为筛选标记,获得制霉菌素抗性突变株Asp11-N006和制霉菌素及维生素K₃双重抗性突变株Asp11-N006-V01,其合成辅酶Q₁₀的能力较出发菌株显著提高。Asp11-N006和Asp11-N006-V01的辅酶Q₁₀产量分别为28.27mg/L和38.46mg/L,较出发菌株分别提高了0.34倍和0.82倍,且遗传性状稳定。     

乳酸乳球菌镉抗性质粒的鉴定及镉抗性功能片段的获取

为获得乳酸菌食品级筛选标记基因,通过质粒消除、PCR方法和电转化方法鉴定一个镉抗性质粒pCD077。酶切分析结果显示该质粒是一个50kb以上的大质粒。结合PCR及热不对称嵌套PCR的方法获得镉抗性功能片段,为以镉抗性为筛选标记构建乳酸菌食品级载体奠定了基础。     

具有溶栓活性的重组乳酸乳球菌的构建

利用PCR方法从纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.natto)基因组DNA中扩增纳豆激酶原基因,构建了纳豆激酶原基因的表达载体pFY002,转化Lactococcus lactis NZ9000,得到活性表达纳豆激酶的重组菌Lactococcus lactis NZ9000/pFY002。利用纤维蛋白平板法检测其溶栓活性,并对诱导剂乳链菌肽(NisinA)的浓度、温度、诱导时间对重组菌产酶的影响进行探究。     

CHO细胞Kcmf1基因内定点整合ZsGreen1报告基因的表达稳定性研究

以Kcmf1基因NW_003614172.1第629890碱基处定点整合ZsGreen1报告基因的CHO-K1细胞(2C3)为研究材料,采用倒置荧光显微镜和流式细胞仪定量分析ZsGreen1的表达,开展系统的稳定性表达研究。2C3细胞贴壁培养连续传代50代次,100%的细胞可以稳定表达ZsGreen1报告基因。无血清悬浮驯化培养2C3细胞后,细胞表达ZsGreen1的平均荧光强度明显降低;连续悬浮传代培养60代次,表达ZsGreen1的细胞数目显著增多,添加体积分数10%FBS到悬浮培养的细胞池,ZsGreen1阳性细胞比例上升到95%以上。流式细胞术分选细胞池中高、低表达ZsGreen1蛋白的2C3细胞,PCR确认它们均含有ZsGreen1报告基因;Q-PCR发现在高、低表达ZsGreen1蛋白的细胞中,相关的ZsGreen1 mRNA水平有明显的差异。提示CHO-K1细胞Kcmf1基因内非编码区域定点整合外源基因后,不会因细胞分裂和生长而丢失外源表达基因;悬浮驯化需要优化培养基和培育条件,达到构建工程细胞的需求。     

香灰菌gpd启动子的克隆及功能验证

为了构建香灰菌的转化体系,研究香灰菌的基因功能,需要获得高活性的启动子元件。本实验通过PCR技术分别克隆得到gpd基因以及其基因上游约1000 bp序列,使用Neural Network Promoter Prediction、Signal Scan Search Request、PLANTCAREA database软件分析发现,gpd基因上游区域内不仅包含启动子所需的特征核心元件TATA-box、CAAT-box、G-box、GC-box、CT-rich等,还含有一个高分值的转录起始位点。为进一步验证该序列的启动子功能,将gpd启动子元件与增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)和潮霉素基因(hph)连接构建成融合表达载体,通过根癌农杆菌介导将其转化香灰菌丝。潮霉素抗性筛选、绿色荧光蛋白检测结果显示,香灰菌gpd启动子成功驱动了潮霉素抗性基因和增强型绿色荧光蛋白基因的表达,根癌农杆菌介导转化成功,为香灰菌外源基因表达及基因功能的研究奠定了基础。     

PlnF抗菌肽在乳酸乳球菌中的分泌表达及抑菌活性鉴定

采用乳酸乳球菌表达载体对PlnF抗菌肽基因进行克隆表达,旨在使重组乳酸菌可以直接应用于食品的发酵和防腐之中。在乳酸乳球菌pNZ8149/NZ3900表达载体中,构建含有胞外表达信号肽的PlnF抗菌肽重组质粒,进一步在电阻200?Ω、电容25?μF条件下电转入NZ3900感受态内。经溴甲酚紫培养基筛选、菌落聚合酶链式反应验证、测序等鉴定正确的重组菌株,以1?ng/mL?Nisin诱导6?h后离心获得的上清液对金黄色葡萄球菌具有（14.03±0.23）mm的抑菌圈,经Tricine-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到在5.8～7.8?kDa间出现一条与预期大小相近的条带,进一步通过纳升液相色谱-电喷雾-串联质谱验证表明PlnF蛋白在pNZ8149/NZ3900乳酸乳球菌表达载体中正确地进行了胞外表达。     

乳酸乳球菌NICE系统食品级载体pRNB48的构建

乳酸菌食品级NICE系统是目前较理想的可控制蛋白质生产的食品级诱导表达系统。实验构建的食品级表达载体pRNB48含α-aga食品级选择标记、θ型复制子和nisA启动子,与宿主菌L.lactisNZ9000共同构成乳酸乳球菌食品级NICE系统,可用于目的基因在乳酸乳球菌中高效诱导表达。     

牛凝乳酶原基因在食品级乳酸乳球菌中的重组表达

将牛凝乳酶原基因连接pNZ8149载体,并转化乳酸乳球菌NZ3900,经乳酸链球菌素Nisin诱导,测得重组菌株胞内凝乳酶活力达到0.7 SU/mL,培养基中检测不到凝乳酶活力,实现了牛凝乳酶原基因在乳酸链球菌Nisin诱导基因表达系统（nisin controlled gene expression system,NICE）中活性表达。在此基础上,将分泌信号肽SPusp45连接于pNZ8149,构建了分泌型表达载体pNZ8149s,并实现牛凝乳酶原基因在NICE系统中分泌表达。当使用1 ng/mLNisin诱导5 h后,重组菌株胞内检测不到凝乳酶活力,培养基中凝乳酶活力为1.2 SU/mL,说明pNZ8149s能够促使凝乳酶原从乳酸乳球菌中分泌。该方法为重组牛凝乳酶在食品级菌株中重组表达提供了一种可行的方案。     

乳酸菌基因组学与基因工程的研究新进展

本文对乳酸菌基因组学的研究新进展,包括乳酸菌基因组测序、基因组的进化和基因转移、乳酸菌重要的功能基因等以及乳酸菌基因工程的研究新进展,包括乳酸菌食品级表达载体、食品级载体选择标记、活体疫苗载体等方面进行了概述.     

阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表达

利用食品级黑曲霉表达系统同源表达阿魏酸酯酶是提高阿魏酸酯酶产量、降低生产成本的有效途径。利用PCR技术扩增黑曲霉阿魏酸酯酶A基因(faeA)的编码区,构建黑曲霉表达载体pSZHG-faeA,并通过农杆菌介导法转化黑曲霉。经筛选获得将faeA基因整合到糖化酶基因位点的同源重组转化子4株。在酶摇瓶发酵条件下,重组菌株培养液上清中的阿魏酸酯酶活性最高达18.6mU/mL。SDS-PAGE分析显示,4株重组菌株都有约36ku目的蛋白条带,表达量为188~262μg/mL。结果表明,实现了阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表达,为食品级阿魏酸酯酶的大规模工业化生产奠定了基础。     

黑曲霉pyrG遗传转化系统的构建及应用

用于黑曲霉遗传操作的筛选标记基因非常有限,而基因改造往往涉及诸多基因的敲除或表达,有限的筛选标记基因难以满足需要.该文构建了以pyrG为筛选标记的黑曲霉遗传转化系统,并利用该系统使红色荧光蛋白rfp在黑曲霉中成功表达.首先,运用同源重组原理完全敲除pyrG基因,在含有5-氟乳清酸和尿苷/尿嘧啶的培养基平板进行筛选,获得...