斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)MHC Ⅱα基因的克隆及表达分析

利用RACE PCR克隆了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)主要组织相容性复合体Ⅱα(MHCⅡα)基因,并通过荧光定量PCR分析了该基因在健康鱼体中的组织分布以及在溶藻弧菌(Vibro alginolyticus)感染后在不同组织中的表达变化。斜带石斑鱼MHCⅡαcDNA全长为2127bp,其中5'非翻译区为834bp,开放阅读框为714bp,3'非翻译区为579bp,编码237个氨基酸,其推导的氨基酸序列包含信号肽、α1及α2功能区、跨膜区、连接肽和胞浆区。荧光定量PCR结果表明,斜带石斑鱼MHCⅡα基因在鳃、头肾、肝、体肾、脑、脾和肠中表达量较高,在心脏、皮肤和肌肉中的表达量较低,并且溶藻弧菌(Vibro alginolyticus)感染后在脾、肠、头肾、和体肾中的表达显著上调,分别为对照组的9.5倍、4.3倍、3.4倍及1.9倍。上述结果表明斜带石斑鱼MHCⅡα在抗溶藻弧菌感染的免疫反应中可能发挥重要作用,这对进一步了解石斑鱼抗菌免疫反应具有参考意义。     

大菱鲆MHCⅡB基因全长cDNA的克隆与组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法,得到了1297bp的大菱鲆MHCⅡB全长cDNA片段.该序列包括741bp的开放阅读框(ORF),35bp的5'末端非编码区(UTR)以及521bp的3'末端非编码区.序列比对结果表明,大菱鲆MHCⅡB与牙鲆MHCⅡB的同源性高达71.5%,与真鲷、鲈鱼和丽鱼的同源性分别为67.1%,70.7%和68.4%,与人、鼠和鲨鱼MHCⅡB的同源性仅分别为24.1%,25.1%和13.2%.组织表达研究显示,MHCⅡB基因在正常大菱鲆组织中均表达,但表达量在各个组织中不同,其中较强的表达于鳃、脾、头肾、小肠中,中等程度表达于血、心脏和皮肤,在肝、性腺和肌肉中表达最弱.     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)一种CXC趋化因子的克隆及其表达特征

从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选到一种CXC趋化因子。它的全长cDNA含有一个81bp的5’UTR,一个414bp的开放阅读框和一个449bp的3’UTR。开放阅读框编码了137个氨基酸残基。经过PCR扩增发现,该CXC趋化因子基因内含有4个外显子和3个内含子。RT-PCR分析表明,大菱鲆CXC趋化因子在正常脾脏和头肾中表达强烈;在胚胎的不同发育时期,大菱鲆CXC趋化因子从体节期开始才有微弱的表达。大菱鲆胚胎细胞(TEC)在用鳗弧菌感染后6h也有强烈的表达。这些结果表明该CXC趋化因子在大菱鲆免疫应答中起着重要作用。     

栉孔扇贝热休克蛋白70基因Cdna的克隆与分析

应用表达序列标签法，获得了栉孔扇贝HSP70基因cDNA的部分序列，然后利用锚定PCR技术克隆到了该基因的全长cDNA。克隆到的HSP70 cDNA全长2553bp，编码区全长1902bp，可以编码634个氨基酸。Blast分析表明该序列与其他生物的HSP70基因具有很高的相似性。在该cDNA序列编码的氨基酸序列中含有3个HSP70家族的特征模体，结合Blast分析的结果，可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝HSP70的编码序列。该基因的克隆为进一步深入研究栉孔扇贝的抗逆机理以及指导扇贝的遗传选育和遗传改良都具有重要的理论意义。     

牙鲆抗菌肽hepcidin基因的克隆及表达分析

采用同源克隆的方法设计简并引物从牙鲆(Paralichthys olivaceus)肝脏中克隆了牙鲆hepcidin抗菌肽基因.牙鲆抗菌肽hepcidin基因组DNA全长821bp,序列分析表明该基因具有3个外显子和2个内含子.cDNA全长588bp,包含一个270bp的开放阅读框,编码一个长89氨基酸的前体肽.RT-PCR分析表明:该抗菌肽基因在正常牙鲆的肝脏、头肾、鳃、脾脏中表达量较高,在心脏、小肠中表达量较低;受到病原鳗弧菌感染的牙鲆各组织该基因表达量明显上升.牙鲆抗菌肽基因的克隆为水产养殖等领域的抗耐病品种的选育提供了基因源,为开发新的生物工程药物提供了基础理论和实验数据.     

大菱鲆神经肽Y基因克隆及其在工厂化养殖饥饿-投喂策略中的表达特征分析

本文通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和末端快速扩增技术(RACE)克隆了大菱鲆神经肽Y(NPY)基因全长为729 bp的互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列,其中5′非翻译区(5′-UTR)为70 bp,3′非翻译区(3′-UTR)为359 bp,开放阅读框(ORF)为300 bp。ORF编码含有99个氨基酸的蛋白质多肽,N端28个氨基酸为信号肽,信号肽后是由36个氨基酸组成的NPY成熟肽。针对大菱鲆NPY蛋白质与其他物种的同源性进行比较,结果显示大菱鲆NPY与其他物种的同源性在53.9%～98%,特别是与同属于鲆鲽鱼类的牙鲆和美洲拟鲽的同源性高达97%～98%,表现出很高的保守性。采用实时定量PCR对大菱鲆NPY基因的表达特征进行分析,结果表明,大菱鲆NPY基因在神经组织和外围组织中都有表达,其中在下丘脑中的表达量最高。饥饿实验中,随着饥饿的进行,NPY的表达量显著变化(P0.05),呈现先升高再降低,再显著升高并维持一段高水平表达后,再次下降的趋势,饥饿后再投喂会使NPY的表达量升高,并且饥饿时间越长,再投喂后NPY的表达水平越高,但是再投喂2 h后表达量还会再次下降至相似的水平,这都预示着NPY是一种摄食刺激因子,并且是一种短期的调控机制。     

抑制消减杂交法分离血管内皮细胞中表达的TNFα相关基因

介绍使用快速而高效地分离差别表达基因的新方法———抑制消减杂交法 ,克隆了在TNFα作用后血管内皮细胞中的差异表达cDNA。经反向Northern杂交试验证实。为进一步研究血管内皮细胞中表达的TNFα作用相关基因打下基础。     

动物乳腺组织高效表达通用型YAC载体的构建

以含有人α-乳白蛋白基因功能域的YAC(yeast artificial chromosome)为起始材料,构建了可以在动物乳腺高效表达外源基因的载体系统。根据已发表的人α-乳白蛋白基因序列,通过PCR的方法,扩增出了其5’端的837bp及3’端的1007bp片段,构建了整合型载体pRLA22。利用pRLA22在大肠杆菌中进行基因操作,可以将外源基因准确地置于乳白蛋白基因启动子控制之下。把重组的pRLA22导入含YAC的酵母菌后,高频率同源重组事件将会把外源基因插入YAC。本实验通过上述程序,将鸡的γ-干扰素基因cDNA序列导入了YAC。经过PCR检测,证明鸡的γ-干扰素cDNA序列已被重组到YAC的预定位置。因此,大肠杆菌载体pRLA22和含人的α-乳白蛋白基因的YAC,将构成能在动物乳腺高表达外源基因的有效载体系统。     

水稻小GTP蛋白基因Osrab5B基因的克隆和鉴定

用已知遗传图位的BAC克隆片段,对水稻（Oryza sativa)小穗cDNA文库进行筛选,获得一个水稻小GTP结合蛋白（small GTP-binding protein,SGP)的相关序列,序列测定后以该cDNA序列为基础将４个表达序列标记（EST）进行了电子克隆（electronic cloning),根据电子克隆结果设计引物,利用RT－PCR方法获得了一个水稻（Oryza stiva)中尚未鉴定的cDNA克隆Osrab5B,长1016bp。它与龙船海棠属（Mesembryanthemum crystallinum)和百脉根属（Lotus japonicus)命名为rab5B基因（序列登录号分别是AJ006225和Z73939）有着高度同源性（cDNA核苷酸序列ID值分别大于74％和76％）,同属rab家族的一个新的亚族。进而根据Osrab5B的cDNA序列设计引物,扩增得到Osrab5B的基因组克隆,序列分析表明它至少有7个内含子和8个外显子。     

栉孔扇贝C型凝集素基因的克隆与表达研究

C型凝集素作为凝集素家族中的主要成员之一,在识别外来微生物表面碳水化合物基团和激活体液中免疫因子等方面具有重要作用。本研究在EST分析的基础上采用锚定PCR方法克隆得到了该基因的全长cDNA。克隆得到的栉孔扇贝C型凝集素cDNA全长1038bp,编码区684bp,可以编码228个氨基酸。在该编码的氨基酸序列中发现了C型凝集素家族的特征模体和一个C型凝集素的结构域(C-type leetin domain,CTLD)。通过Clustalw和SMART分析在该序列中发现了形成二硫键的4个保守的半胱氨酸,与其他物种C型凝集素的二硫键结构非常相似。结合BLAST分析的结果,可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝C型凝集素的编码序列。用RT-PCR技术在鳗弧菌感染前后的血细胞中均可以检测到该基因的表达,但病原刺激前的表达水平相对较低,病原刺激后4h起表达开始升高,并在6h达到最高,随后逐渐开始下降,并于32h恢复到原来水平,该结果表明C型凝集素存在组成型和诱导型两种调控机制,在扇贝防御病原感染的过程中发挥重要作用。     

条斑紫菜锰超氧化物歧化酶基因克隆与序列分析

为研究紫菜抗逆抗病的分子机制,以本实验室建立的条斑紫菜表达序列标签(EST)和全长cDNA富集文库,结合PCR技术,克隆了条斑紫菜编码锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的cDNA及基因组DNA全长序列,并进行了序列特性相关分析.研究结果表明:该基因cDNA序列全长为958个核苷酸,包含一个完整Mn-SOD基因的ORF,编码224个氨基酸和终止密码子;该基因在基因组中序列长度为1416bp,包含4个外显子和3个内含子,这既不同于高等植物的6个外显子和5个内含子,也不同于人的5个外显子和4个内含子;该基因编码区密码子的平均GC含量为60.9%,第三位密码子的GC含量高达84.9%;序列中包含4个与Mn2 的结合位点及一个保守的金属结合结构域,预测分子量为24469.09Da,等电点为5.99;条斑紫菜Mn-SOD与人的相关蛋白具有类似的空间结构,都有6个跨膜α螺旋结构域;由cDNA序列推导的氨基酸序列与莱茵衣藻相似性为57.7%,系统发生分析表明条斑紫菜Mn-SOD与绿藻莱茵衣藻和硅藻海链藻的亲缘关系较近.这是该基因在红藻门中的首次报道.     

牙鲆T细胞抗原受体(TCR)β链同源cDNA的克隆

从牙鲆外周血淋巴细胞cDNA文库中克隆TCRβ1319bp同源cDNA序列并对其基因结构进行生物信息学分析。RT-PCR及其编码区为942bp，编码314个氨基酸，编码区包括V、D、J和C区4个基因片段。TCRVβ片段主要包括从2l—115位氨基酸残基的95个氨基酸序列，Jβ区与哺乳动物的Jβ区高度保守，在位于Vβ和Jβ之间的四区中没有发现8碱基保守序列(GGACAGGG），CDR3β氨基酸序列为GTRILYE。牙鲆TCRCβ片段共有179个氨基酸残基，缺失位于四细胞外区和临近区域的2个5—9氨基酸弹性区域。牙鲆TCRCβ片段的铰链区有6个氨基酸残基，缺少半胱氨酸位点，含Lys^271保守位点。经RT-PCR及检测，在脾、外周血和前肾中都发现TCRβ的表达，肌肉和肝中均未克隆到目的片段。     

番杏Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆及特性分析

根据同源序列设计筒并引物,通过RT—PCR及RACE的方法从盐生植物番杏中克隆出Na^ ／H^ 逆向运输蛋白基因。序列分析表明,该cDNA全长2199bp,开放读码框为1665bp,可编码一个554个氨基酸的多肽,与其他植物中已经克隆的Na^ ／H^ 逆向转运蛋白具有很高的同源性。系统发育分析表明该蛋白(TtNHX1)与液泡型的Na^ ／H^ 逆向转运蛋白的亲缘较近,与质膜型的Na^ ／H^ 逆向转运蛋白亲缘关系较远。TtNHX1的表达具有组织特异性,在番杏的根、茎和叶中均有表达,而花中没有表达。经NaCl诱导后根、茎和叶中的表达量增加,而花中仍没有表达。     

利用生物信息数据库克隆玉米基因PIS2与MFSP全长

利用玉米表达序列标签数据库(dbEST)电子克隆了玉米基因PIS2的cDNA全长,并采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术得到了包含该基因完整开放阅读框(ORF)的cDNA序列;借助水稻非冗余核酸数据库联合应用电子克隆技术和RT-PCR技术克隆得到玉米主易化子超家族蛋白基因MFSP的cDNA全长,并进一步利用植物基因组数据库(PlantGDB)快速地获得了该基因的基因组全长序列.研究证实,充分利用分子生物信息数据库,可以简便地克隆得到玉米目的基因的cDNA乃至基因组全长序列.     

反向嵌套PCR法高效扩增辽宁碱蓬甜菜碱醛氢酶cDNA5′末端序列

采用反向嵌套PCR法,根据已获得的辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA的部分序列,设计一条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和两对特异性反向嵌套PCR引物,成功地克隆了辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA′末端。与锚定PCR法相比,反向嵌套PCR法具有特异性强、扩增效率高等优点,是一种非常有效的扩增cDNA5′末端序列的方法。     

SARS病毒特异性靶基因的多重PCR检测技术研究

本研究探讨了多重PCR技术在SARS病毒检测中的应用。根据香港中文大学在GenBank上公开发表的SARS病毒基因组cDNA序列,人工合成克隆特异性靶基因DNA片段,以此片段作为阳性样品,根据世界卫生组织推荐的进行单PCR与多重PCR检测分析。以单PCR法获得了121bp、182bp及302bp的靶基因片段3条;以二重PCR法获得了121bp+182bp、121bp+302bp与182b+302bp的靶基因片段组合;以二重PCR法获得了121bp+182bp+302bp的靶基因片段组合。结果表明:多重PCR技术可成功应用于SARS病毒的检测。     

真鲷转铁蛋白基因的克隆与表达特征分析

采用同源克隆的方法,根据相近物种转铁蛋白(Transferrin,TF)基因的序列设计简并引物,在经感染真鲷的cDNA上进行PCR扩增,获得了真鲷TF的全基因编码序列(GeneBank Accession No．AY335444)。该序列由2444bp核苷酸组成,含31bp5’非编码区和340bp3’非编码区以及2073bp的开放阅读框,可编码691个氨基酸,预测分子量约为74．3kD,等电点为5．63。同源性分析表明,真鲷TF与鱼类TF的相似性很高,约为65％～75％;与哺乳类转铁蛋白和乳铁蛋白的相似性约40％～50％;与脊索动物海鞘和无脊椎动物昆虫也有一定的相似性。进化分析表明,该基因是转铁蛋白而不是乳铁蛋白。真鲷TF与其它动物TF结构相似,是由两叶相似的结构域构成的单一肽链;该基因有一信号肽序列,缺乏糖基化位点,在它的两个结构域上,分别有三个TF家族的标签序列及一个MHC分子标签序列;与哺乳类相比,参与蛋白二硫键形成的半胱氨酸以及铁离子结合位点高度保守。RT-PCR结果显示,真鲷TF在肝脏成组成型表达,但在其它组织中的表达可受病原调控,表现为经病原刺激后转铁蛋白基因的组织分布显著增多。     

反向嵌套PCR法高效扩增辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA5′末端序列

采用反向嵌套PCR法 ,根据已获得的辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA的部分序列 ,设计一条 5′末端磷酸化的特异性反转录引物和两对特异性反向嵌套PCR引物 ,成功地克隆了辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA 5′末端。与锚定PCR法相比 ,反向嵌套PCR法具有特异性强、扩增效率高等优点 ,是一种非常有效的扩增cDNA 5′末端序列的方法。     

外来入侵生物福寿螺β-actin基因片段的克隆及表达分析

采用RT-PCR的方法首次对入侵我国福寿螺的β-actin基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并通过氨基酸序列分析推导与其他相关物种的亲缘关系.结果表明,获得的福寿螺β-actin基因cDNA片段大小为840bp,核酸编码有280个氨基酸序列,与其他物种具有高度的同源性.通过邻接法(NJ)构建的系统发育树显示,福寿螺首先与软体动物聚为一簇,然后与节肢动物聚为一簇,再与脊椎动物聚为一簇.此外,RT-PCR结果显示,β-actin基因在福寿螺的鳃、消化腺、肾和足部肌肉等4个组织内的表达基本一致,具有良好的稳定性.     

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)脱毛蛋白酶基因的克隆与序列分析

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)UN-31-C-42菌株是从成都市生活垃圾中分离,并经多次诱变后得到的菌株。其发酵液具有很好的脱毛效果,且对皮革胶原没有损伤。通过对该菌株发酵液中的碱性蛋白酶DHAP的纯化与N′-末端氨基酸序列测定,以及对该序列的同源性分析后,设计出相应引物,用PCR方法扩增了该菌株的碱性蛋白酶基因AP。测序结果表明,该克隆基因全长1588bp,有一个全长1149bp的编码区序列,推测蛋白质序列长383个氨基酸残基,成熟肽分子量为27．8kD。推测的成熟蛋白酶N′-末端具有与DHAPN′-末端完全匹配的序列,说明克隆到的基因为脱毛蛋白酶基因。同源性分析表明,该基因序列与已报道的其他碱性蛋白酶基因有较高的同源性。